專利名稱：一種共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的固定化技術(shù)，特別是涉及一種用EudragitL-100載體共價固 定化纖維素酶的方法。
背景技術(shù)：
開發(fā)纖維素燃料乙醇第二代生物質(zhì)液體燃料技術(shù)，對于解決能源危機(jī)、食 品短缺和環(huán)境污染等問題具有積極的意義。在纖維素乙醇糖化過程中，纖維素 酶起著關(guān)鍵性的作用。但目前使用中的纖維素酶都或多或少地存在著酶穩(wěn)定性 差、使用壽命短、活力低等缺陷，致使纖維素酶的使用成本過高，影響著纖維 素燃料乙醇的產(chǎn)業(yè)化迸程。所以如何降低纖維素酶的使用成本，增加其穩(wěn)定性 和使用壽命，是打通由纖維質(zhì)原料到燃料乙醇技術(shù)路線的關(guān)鍵，也是世界范圍 內(nèi)所面臨的一項(xiàng)共性關(guān)鍵技術(shù)。纖維素酶固定化能有效克服游離纖維素酶反應(yīng) 過程中存在的分離困難、穩(wěn)定性差和易流失等缺陷，為提高纖維素酶的使用效 率，降低使用成本提供了可能。而對于纖維素酶的固定化而言，共價結(jié)合方法 可使纖維素酶與載體牢固結(jié)合、滲漏量小，能有效降低纖維素酶的使用成本， 明顯優(yōu)于吸附結(jié)合方式。
EDC (l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)作為一種水溶性的碳二亞胺，在多肽、蛋白質(zhì)和核苷酸合成中，廣泛地被用作羧基活化劑，促使酰胺
和酯的生成。單獨(dú)采用EDC作為羧基活化劑，羧酸與EDC反應(yīng)生成的O-?；?脲中間體很不穩(wěn)定，如果該中間體不與氨基反應(yīng)，則會很快水解并重新釋放出 羧基基團(tuán)。而在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)同時存在的情況下，EDC可以將羧 基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的具有氨基反應(yīng)活性的中間體，從而可以提高產(chǎn)率，減少副反應(yīng) 的發(fā)生。
本發(fā)明在中國專利申請CN101225380A(—種腸溶衣材料固定化纖維素酶的 制備方法)的基礎(chǔ)上，采用EDC和NHS作為羧基活化劑，實(shí)現(xiàn)纖維素酶在可 溶-不可溶腸溶衣材料Eudragit L-100上的高效共價固定。目前，國內(nèi)還未見有 相關(guān)的專利文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案
本發(fā)明通過活化劑EDC和NHS的偶聯(lián)作用，把纖維素酶高效共價固定于 pH值敏感性載體Eudragit L-100上，通過溶液pH值的變化，可方便地實(shí)現(xiàn)固定 化酶的使用和回收，大大提高了纖維素酶的穩(wěn)定性和使用壽命，從而為降低纖 維素酶的使用成本提供了可能。
所述活化劑EDC指l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，所述NHS 指N-羥基琥珀酰亞胺。所述Eudragit L-100指丙烯酸樹脂聚合物，為醫(yī)藥輔料，有粘合和成膜作用，可用于包衣、緩釋和成膜。上述物質(zhì)都是現(xiàn)有技術(shù)中公開 使用的物質(zhì)。為方便描述，在權(quán)利要求書和下文中均用代號表示。 本發(fā)明的具體步驟如下
1) 將Eudragit L-100均勻地分散于蒸餾水中，用2M的NaOH調(diào)節(jié)pH值為
11.0，待Eudragit L-100完全溶解后，用2M的HC1調(diào)節(jié)pH值至6.5后
定容備用；
2) 在pH 6.5的Eudragit L-100溶液中，先后加入活化劑EDC和NHS，室 溫下活化Eudragit L-100載體30min;
3) 在活化的載體溶液中，加入纖維素酶酶粉，室溫下緩慢攪拌固定3 6 小時；
4) 用3M醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.6，離心去上清得到沉淀；
5) 將沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到所需的固定化纖 維素酶。
所述的載體材料Eudragit L-100溶液濃度為質(zhì)量體積比(W/V)濃度2 5%。 所述步驟1)中，可使用滴加2 M的NaOH調(diào)節(jié)pH值為11.0，待Eudragit L-100 完全溶解后，滴加2M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.5后定容備用。 所述的活化劑EDC用量為0.3g/g載體。 所述的活化劑NHS用量為0.3g/g載體。
所述的固定化纖維素酶中蛋白質(zhì)載量為10 100mg蛋白/g載體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可通過溶液pH的變化方便地實(shí)現(xiàn)固定化酶的均相酶解 和異相回收，也能夠確保固定化酶在均相狀態(tài)下對不溶性纖維素材料的高效酶 解，以及酶解后副產(chǎn)物木質(zhì)素的快速分離，具有反復(fù)使用多次，酶活保留率變 化不大的優(yōu)點(diǎn)，制備過程簡單方便，可大大降低纖維素酶的使用成本，具有較 好的推廣應(yīng)用價值。
具體實(shí)施例方式
為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例 僅限于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例方法適用于固定化的對象并不僅限于纖維素酶，其他類似于淀 粉酶、木聚糖酶、溶菌酶等也都可適用。
本實(shí)施例采用的EDC和NHS購自Sigma-Aldrich公司。 實(shí)施例1
準(zhǔn)確稱取1.00 g Eudragit L-100置于40 mL蒸餾水中(體積以最后定容后的 體積為準(zhǔn)，質(zhì)量體積比濃度2%)，滴加2 M的NaOH至pH值為11.0，待Eudragit L-100完全溶解后，滴加2 M鹽酸至pH值至6.5，然后定容至50mL備用；先 后往載體溶液里加入0.30 gEDC和0.30 gNHS，室溫下活化載體30 min;然后 加入0.10 g纖維素酶，室溫固定6 h;用3 M的醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.6， 10， OOOrpm 下離心5min;將沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到所需的固 定化纖維素酶。實(shí)施例2
準(zhǔn)確稱取2.50 g的Eudragit L-100置于40 mL蒸餾水中(體積以最后定容 后的體積為準(zhǔn)，質(zhì)量體積比濃度5%)，滴加2 M的NaOH至pH值為11.0，待 EudragitL-100完全溶解后，滴加2 M鹽酸至pH值至6.5，然后定容至50mL備 用；先后往載體溶液里加入0.75 gEDC和0.75 gNHS，室溫下活化載體30 min; 然后加入0.25§纖維素酶，室溫固定6h;用3M的醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.6， 10， 000rpm下離心5 min;將沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到所 需的固定化纖維素酶。
權(quán)利要求
1、一種共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法，其特征在于包括如下步驟1)將載體Eudragit L-100均勻地分散于蒸餾水中，用2M的NaOH調(diào)節(jié)pH值為11.0，待Eudragit L-100完全溶解后，用2M的HCl調(diào)節(jié)pH值至6.5后定容備用；2)在pH 6.5的Eudragit L-100溶液中，先后加入EDC和NHS，室溫下活化Eudragit L-100載體30min；3)在活化的載體溶液中，加入纖維素酶酶粉，室溫下緩慢攪拌固定3～6小時；4)用3M醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.6，離心去上清得到沉淀；5)將沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，即得到所需的固定化纖維素酶。
2、 如權(quán)利要求1所述的共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法，其特征在于步驟l) 中所述的Eudragit L-100溶液質(zhì)量體積比濃度為2 5%。
3、 如權(quán)利要求1所述的共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法，其特征在于步驟2) 中所述的活化劑EDC用量為0.3g/g載體。
4、 如權(quán)利要求1所述的共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法，其特征在于步驟2) 中所述的活化劑NHS用量為0.3g/g載體。
5、 如權(quán)利要求1所述的共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法，其特征在于所述的固 定化纖維素酶中蛋白質(zhì)載量為10 100mg蛋白/g載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種共價增強(qiáng)型纖維素酶固定化方法。步驟為1)將載體Eudragit L-100均勻地分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為11.0，待其完全溶解后調(diào)節(jié)pH值至6.5后定容備用；2)先后加入EDC和NHS，室溫下活化載體30min；3)加入纖維素酶酶粉，室溫下緩慢攪拌固定3～6小時；4)用3M醋酸調(diào)節(jié)pH值為3.6，離心去上清得到沉淀；5)將沉淀溶解于pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中。本發(fā)明可通過溶液pH的變化方便地實(shí)現(xiàn)固定化酶的均相酶解和異相回收，也能夠確保固定化酶在均相狀態(tài)下對不溶性纖維素材料的高效酶解，以及酶解后副產(chǎn)物木質(zhì)素的快速分離，具有反復(fù)使用多次，酶活保留率變化不大的優(yōu)點(diǎn)，制備過程簡單方便，可大大降低纖維素酶的使用成本，具有較好的推廣應(yīng)用價值。
文檔編號C12N11/06GK101555473SQ200910039540
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月18日
發(fā)明者呂鵬梅, 吳創(chuàng)之, 莊新姝, 宇 張, 王忠銘, 袁振宏, 許敬亮, 馬隆龍 申請人:中國科學(xué)院廣州能源研究所