丙氨酸數(shù)目越少，多肽具有a -螺旋結(jié)構(gòu)的機會越低。
[0517] ?丙氨酸殘基越多，多肽不溶的可能性越大。
[0518] 熒光標(biāo)iP,的肽活體外BBB樽塑穿討測試
[0519] 材料及設(shè)備
[0520] 材料
[0521] -Ringer-Hepes 緩沖液（RH 緩沖液）：
[0522] NaCl 150mM ;KCL 5. 2mM ;CaCl22. 2mM ;MgCl20. 2mM ;NaHC036mM ;Ifepes 5mM ;葡萄糖 2. 8mM。調(diào)節(jié)至pH 7. 2-7. 4且經(jīng)由0. 22 ym過濾器孔徑過濾。
[0523] -DMEM/F12
[0524] -熒光黃-CH，Sigma，參考編號 L0259
[0525] 設(shè)備
[0526] -細(xì)胞培養(yǎng)物培育器（37°C，加濕氣氛，95%空氣及5% C02)
[0527] -無菌細(xì)胞培養(yǎng)柜
[0528] -具有蓋子的Millicell 24孔接收機托盤，Millipore參考編號PSMW010R5。
[0529] -Corning 96孔固體黑色平底聚苯乙稀TC處理的微量板。
[0530] -水浴，37°C
[0531] -抽吸系統(tǒng)
[0532] -自動微量移液器
[0533] _熒光劑
[0534] 活體外BBB模型的建立
[0535] 如圖22中所闡釋實施共培養(yǎng)方法。將混合神經(jīng)膠細(xì)胞的小鼠初代培養(yǎng)物接種于 24孔板上且將牛腦內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于存于另一板中的膠原包覆的插入物上。3天后，將插入 物移動至含有星狀細(xì)胞的板中且再培養(yǎng)3天。為評價活體外BBB的完整性，在實驗當(dāng)天測 量轉(zhuǎn)內(nèi)皮電阻（TEER)。高于200 D /cm2的TEER值視為可接受。
[0536] 過濾測試
[0537] 隨后實施以下程序以測試膜是否可防止肽自上隔室穿過至下隔室。在20μg/ml 焚光團下在插入物的腔室側(cè)施加肽且置于填充有Ringer-Hepes緩沖液（Ringer-Hepes緩 沖液的組成是如上文所闡述）的孔中。培育lh后，收集來自上及下隔室的樣品且使用熒光 劑測量。兩個隔室中的肽濃度相等指示肽的擴散不受膜的限制。
[0538] 穿過測試程序
[0539] 在DMEM/F12培養(yǎng)基中在20 y g/ml的最終熒光團濃度下制備每一測試肽溶液（將 以一式三份研宄的每一條件考慮在內(nèi)）。使用經(jīng)熒光標(biāo)記的不規(guī)則肽樣品作為陰性對照。 將20 yM熒光黃（LY)添加至每一樣品中。LY是呈現(xiàn)低大腦滲透的親水性小分子，且因此其 內(nèi)皮滲透系數(shù)揭露內(nèi)皮細(xì)胞單層的完整性。選擇與測試肽所攜載的熒光標(biāo)記的Em/Ex光譜 兼容的分子示蹤劑至關(guān)重要以防止FRET樣事件。
[0540] 將插入物移動至每孔含有0. 8ml培養(yǎng)基的新24孔板，且在37°C下加熱。將400 y 1 預(yù)熱樣品溶液添加至每一插入物中。收集每一溶液的等份試樣（t = 0上），儲存在4°C下， 且防止其暴露于光以及培養(yǎng)基（t = 0下）。在37°C及5% C02下培育60min后收集上及下 溶液（t = 60上及t = 60下）。
[0541] 將來自每一條件（測試肽及陰性對照）的所有樣品（t = 0上、t = 0下、t = 60 上及t = 60下）平鋪于黑色96孔微量板以及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中。使用多孔板讀數(shù)器測量熒 光。
[0542] 然后實施肽的質(zhì)量平衡以檢查可能的吸收或累積現(xiàn)象。質(zhì)量平衡值給出實驗結(jié)束 時所回收化合物的百分比，且如下文所顯示來計算：
[0543]
[0544] 滲透率計算
[0545] 亦測定LY及所測試肽的內(nèi)皮滲透系數(shù)值。使用清除率原理獲得非濃度依賴型運 輸參數(shù)。通過用所運輸化合物的量除以供體室濃度及所計算的總清除體積來計算培育時間 之間清除體積的增量，如下文所顯示：
[0546]
[0547] [C] 1代表初始腔室示蹤劑/肽濃度，[C] a代表近腔室示蹤劑/肽濃度，且Va代表 近腔室的體積。在實驗期間，清除體積隨時間以線性方式增加。針對時間繪制平均清除體 積，且通過線性回歸分析估計斜率以提供估計的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。共培養(yǎng)清除率曲線的 斜率表示為PSt，其中PS代表滲透率X表面積產(chǎn)物（以微升/分鐘表示）。僅覆蓋有膠原的 過濾器的清除率曲線的斜率表示為PSf。如下文中所顯示來計算內(nèi)皮單層的PS值（PSe):
[0548]
[0549] 用PSe值除以過濾器的表_枳（對于細(xì)胞培養(yǎng)插入物milliCell24為0. 7cm2)以 產(chǎn)生內(nèi)皮滲透系數(shù)（Pe，以厘米/分鐘表示）。
[0550] 計算每一樣品的LY Pe及測試肽/無規(guī)則肽Pe系數(shù)。若LY Pe系數(shù)值介于 0. 2-0. 8X l(T3cm. mirf1之間，則屏障在實驗后視為完整且測試肽及對照的滲透率值主要歸 因于跨細(xì)胞通量。
[0551] 結(jié)果
[0552] 使用此方法，熒光肽穿過模型BBB且具有下列百分比：
[0553]調(diào)節(jié)子
[0554] HKKWQFNSPFVPRADEPARKGKVHIPFPLDNITCRVPMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID N0:1)〇
[0555] BBB穿過百分比：3. 73 %
[0556] 調(diào)節(jié)子多肽
[0557] 序列：PTVIHGKREVTLHL(SEQ ID N0:2)
[0558] BBB 穿過百分比：11. 43%
[0559] RAP 多肽
[0560] 序列：ELKHFEAKIEKHNHYQKQLE(SEQ ID N0:4)
[0561] BBB穿過百分比：8. 27%
[0562] 橈件多肽
[0563] 序列：TGESNTVRGKRGSYKDENR(SEQ ID NO:7)
[0564] BBB穿過百分比：8. 17%
[0565] 剛件多肽
[0566] 序列：GDAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID N0:12)
[0567] BBB穿過百分比：7. 51%
[0568] 這些數(shù)據(jù)以圖表形式表示于圖24中。
[0569] 結(jié)論
[0570] 發(fā)明人已研發(fā)出經(jīng)受受體介導(dǎo)的BBB轉(zhuǎn)胞吞作用的多肽。本發(fā)明多肽與試劑的偶 聯(lián)使得可穿過BBB將試劑運輸至腦中，此運輸原本為BBB所排斥。本發(fā)明多肽與治療劑和/ 或診斷劑的偶聯(lián)使得可將治療劑和/或診斷劑運輸至腦，由此提供新的且經(jīng)改良的治療及 診斷可能性。
[0571]

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【主權(quán)項】
1. 一種用于穿過血腦屏障（BBB)的多肽，其中該多肽是： (a) 長度小于59個氨基酸的調(diào)節(jié)子多肽，其包括SEQ ID N0:2的7個或更多個連續(xù)氨 基酸，且包括K48及R49 (相對于SEQ ID NO: 1編號）； (b) 長度小于100個氨基酸的RAP多肽，其包括來自SEQ ID NO:4的至少20個連續(xù)氨 基酸； (c) 長度小于100個氨基酸的撓性多肽，其包括撓性環(huán)且其中該多肽包括以下序列： X1 X2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 X1^ R G K R X7 X8 X9 K D E 其中 X1= A、F、S 或 T ;X2= G、K、R 或 S ;X3= S 或 T ;X4= N或 S ;X5= A、I 或 T ;X6 = I、T 或 V ;X7= D、E 或G ;X8= S、T 或 Y ;X9= F、T 或 Y ;X1Q= G 或N J11= K或 R;或 (d) 長度小于100個氨基酸的剛性多肽，其包括a螺旋且包括以下共有序列： (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R)，任選地 G D(A/E)a (K/R)A(A/E/Q)K A (A/E/Q) A (K/R) A XpG Y 其中優(yōu)選地，。為I至10,且^為I至25。2. 根據(jù)權(quán)利要求1 (a)所述的調(diào)節(jié)子多肽，包括： (&)(丨）了43、￥44、145、1146、647和/或（^)￡50、￥51、了52、153及冊4(相對于5￡0 1〇 N0:1編號）；和任選地 (b) P43及L55 (相對于SEQ ID NO: 1編號）；和任選地 (c) (i)P37、M38、A39、R40、E41 和 / 或（ii)H56、P57、D58 及 H59(相對于 SEQ ID N0:1 編號）。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中該多肽： (a) 是包括以下序列或由其組成的調(diào)節(jié)子多肽：SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3; (b) 是包括以下序列或由其組成的RAP多肽：SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6 ； (c) 是包括以下序列或由其組成的撓性多肽：SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、 SEQ ID NO:10 或 SEQ ID NO:11 ; (d) 是包括以下序列或由其組成的剛性多肽：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多肽，其中該多肽是以重組方式產(chǎn)生。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的多肽，其中該多肽是通過化學(xué)合成產(chǎn)生。6. -種用于運輸試劑穿過血腦屏障（BBB)的偶聯(lián)物，其包括： (a) 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的肽；及 (b) 試劑， 其中該偶聯(lián)物能夠穿過該BBB。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的偶聯(lián)物，其中該試劑為藥物、多肽、酶、抗生素、抗癌劑、放射 性試劑、抗體、細(xì)胞毒素、可檢測標(biāo)記或抗血管生成化合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)物，其中該試劑是治療劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其中該試劑是小分子藥物。10. 根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)物，其中該試劑是診斷劑，任選地其中該 診斷劑為染料、化學(xué)發(fā)光染料、放射性成像劑、金屬螯合絡(luò)合物、熒光標(biāo)記、酶-底物標(biāo)記、 抗體或其抗體片段。11. 根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項所述的偶聯(lián)物，其中該多肽是經(jīng)由連接體偶聯(lián)至該 試劑。12. 根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項所述的偶聯(lián)物，其中該多肽是直接偶聯(lián)至該試劑。13. 根據(jù)權(quán)利要求6至12中任一項所述的偶聯(lián)物，其包括納米顆粒。14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述的偶聯(lián)物，其中該試劑可在運輸穿過該BBB后 自該多肽釋放。15. -種藥物組合物，其包括：根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多肽或偶聯(lián)物，及藥 學(xué)上可接受的載體。16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多肽、偶聯(lián)物或藥物組合物，其用于療法中。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽、偶聯(lián)物或藥物組合物，其用于治療神經(jīng)疾病，任選地 腦瘤、腦轉(zhuǎn)移、精神分裂癥、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、卒中和/或與BBB的 功能障礙相關(guān)的疾病。18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多肽、偶聯(lián)物或藥物組合物，其用于診斷方法 中。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽、偶聯(lián)物或藥物組合物，其用于診斷神經(jīng)疾病。20. -種分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的多肽。
【專利摘要】本發(fā)明提供穿過血腦屏障(BBB)的多肽。因此，這些多肽是BBB運輸劑。這些多肽在單獨或與治療劑或診斷劑偶合時通常能夠以治療上或診斷上有用或生理上顯著的有效量穿過該BBB。
【IPC分類】C07K7/00, C07K14/00, A61K38/16, A61K38/04, A61K38/10
【公開號】CN104968359
【申請?zhí)枴緾N201380069981
【發(fā)明人】薩爾瓦多·博羅斯戈麥斯, 弗蘭塞斯克·哈維爾·里韋羅蒙索, 安娜·卡斯坎特西雷拉
【申請人】薩吉堤斯生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2013年11月14日
【公告號】CA2890704A1, EP2919798A1, WO2014076655A1