14、15、16或17個(gè)氨基酸），同時(shí)保留穿過(guò)888的能 力，且其中該片段包括SEQ ID N0:4的20個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0090] 本發(fā)明的RAP多肽亦包含SEQ ID N0:5的變體。RH_構(gòu)建體2的變體通常是由與 SEQ ID N0:5具有以下同一性的氨基酸序列組成：85%或更大，例如85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%〇
[0091]RH_ 構(gòu)建體 3
[0092]DKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESV⑶GERVSRSREKHALLEGRTKELGYTVK KHLQDLSGRISRARH(SEQIDN0:6) :RH_ 構(gòu)建體 3
[0093] 本發(fā)明的另一優(yōu)選RAP多肽是RH_構(gòu)建體3。RH_構(gòu)建體3(SEQIDNO: 6)是RAP 的84個(gè)氨基酸的片段，其包括SEQIDNO: 5 (且因此亦包括SEQIDNO: 4)。RH_構(gòu)建體3 包含包括2個(gè)a-螺旋的RAPD3結(jié)構(gòu)域的大部分。除RH_構(gòu)建體2多肽的a-螺旋（包 含與LDLR相互作用所必需的殘基）外，RH_構(gòu)建體3包括與LDLR相互作用且穩(wěn)定復(fù)合物 的含有Arg296的第二a-螺旋。
[0094] 本發(fā)明的RH_構(gòu)建體3多肽包括SEQIDN0:4的20個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，通常 為 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80 或 81 個(gè)氨基酸殘基。
[0095] 其他優(yōu)選片段缺少一或多個(gè)來(lái)自SEQIDN0:6C端的氨基酸（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13或14個(gè)氨基酸）和/或一或多個(gè)來(lái)自SEQIDN0:6N端的氨基酸（例 如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59或60個(gè)氨基酸），同時(shí)保留穿過(guò)BBB的能力，且其中該片段包括SEQID NO:4的20個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0096] 本發(fā)明的RAP多肽亦包含SEQIDN0:6的變體。RH_構(gòu)建體3的變體通常是由與 SEQIDN0:6具有以下同一性的氨基酸序列組成：85%或更大，例如85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%〇
[0097] 撓性多肽
[0098]"撓性多肽"包括撓性環(huán)。發(fā)明人在"AP2雙結(jié)合劑模型"中鑒別出與LDLR的LA結(jié) 構(gòu)域相互作用的特征（參見(jiàn)下文實(shí)例）。本發(fā)明的撓性多肽含有這些特征且與LDLR的LA 模塊相互作用。
[0099] 發(fā)明人將"RGKRX7X8X9KDE"基序鑒別為對(duì)與LDLR的LA結(jié)構(gòu)域的相互作用至關(guān)重 要，且因此本發(fā)明的撓性多肽包括氨基酸序列：
[0100]XiX2EX3X4X5X6RGKRX7X8X9KDEX10Xn(SEQIDN0:23);或
[0101]RGKRX7X8X9KDE(SEQIDNO:24)
[0102] 其中：
[0103] ?Xi優(yōu)選與位置14處的氨基酸形成疏水性分子內(nèi)相互作用以促進(jìn)雙倍Kunitz型 折疊。
[0104] ?x2優(yōu)選具有形成撓性環(huán)的高傾向。
[0105] ?E促進(jìn)與LA模塊R103的H-鍵合的分子間相互作用。
[0106] ?x3優(yōu)選是具有形成撓性環(huán)的高傾向的極性殘基。
[0107] ?x4優(yōu)選是具有形成撓性環(huán)的高傾向的極性殘基。
[0108] ?X5優(yōu)選促進(jìn)與LA模塊V106的疏水性分子間相互作用。
[0109]?X6優(yōu)選促進(jìn)與LA模塊T126的疏水性分子間相互作用。
[0110] ? R G K R視為與LA模塊相互作用所必需。
[0111] ? X7優(yōu)選具有形成撓性環(huán)的高傾向。
[0112] ? X8優(yōu)選是具有形成撓性環(huán)的高傾向的極性殘基。
[0113] ? X9優(yōu)選促進(jìn)與氨基酸疏水性分子內(nèi)相互作用以促進(jìn)雙倍Kunitz型折疊。
[0114] ? K是視為與LA模塊相互作用所必需的AP2殘基。
[0115] ? D促進(jìn)與LA模塊Q104的H-鍵合的分子間相互作用。
[0116] ? E是視為與N端分子內(nèi)相互作用并促進(jìn)雙倍Kunitz型折疊所必需的AP2殘基。
[0117] ? X1(l優(yōu)選是具有形成撓性環(huán)的高傾向的極性殘基。
[0118] ? 選是與LA模塊的D110形成H-鍵合的分子間相互作用的極性殘基。
[0119] 優(yōu)選地，Xf A、F、S 或 T
[0120] X2=G、K、R 或 S
[0121] X3=S或T
[0122] X4=N 或 S
[0123] X5=A、I 或 T
[0124] X6=I、T 或 V
[0125] X7=D、E 或 G
[0126] X8=S、T 或 Y
[0127] X9=F、T 或 Y
[0128] X1(I=G 或 N
[0129] Xn=K 或 R
[0130] 本發(fā)明的撓性多肽可包括3￡〇10勵(lì):24以及（5￡〇10勵(lì):23的）乂 1\￡乂3乂4父5 x6 X1(l和/或X n中之一或多個(gè)。本發(fā)明的撓性多肽可包括：
[0131] X2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 25)
[0132] E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 Xn(SEQ ID NO:26)
[0133] X3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10 Xn(SEQ ID NO:27)
[0134] X4 X5 X 6 R G K R X7 X8 X 9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 28)
[0135] X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 Xn(SEQ ID NO:29)
[0136] X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 30)
[0137] R G K R X7 X8 X 9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 31)
[0138] X: X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:32)
[0139] X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X8 X 9 K D E X10(SEQ ID NO:33)
[0140] E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:34)
[0141] X3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:35)
[0142] X4 X5 X 6 R G K R X7 X8 X 9 K D E X10(SEQ ID NO:36)
[0143] X5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:37)
[0144] X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:38)
[0145] R G K R X7 X8 X 9 K D E X10(SEQ ID NO:39)
[0146] X: X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E(SEQ ID NO:40)
[0147] X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X8 X 9 K D E(SEQ ID NO:41)
[0148] E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:42)
[0149] X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:43)
[0150] X4 X5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E(SEQ ID NO:44)
[0151] X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:45)
[0152] X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:46)
[0153] R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID N0:47)。
[0154] 較短多肽產(chǎn)生廉價(jià)且容易。而且，使用較短多肽來(lái)達(dá)成穿過(guò)BBB的相同或較佳通 過(guò)允許向患者施用更小重量的多肽。
[0155] 本發(fā)明撓性多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸，其長(zhǎng)度通常為99、98、97、96、95、90、 89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、 64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11或10個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明撓性多肽的長(zhǎng)度為15-24(即15、16、17、18、 19、20、21、22、23或24)個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為18-21個(gè)氨基酸（即18、19、20或21個(gè)氨基 酸）。
[0156] 最優(yōu)選地，本發(fā)明撓性多肽的長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸。
[0157] 本發(fā)明的撓性多肽亦包含上文所列示的撓性多肽的變體。本發(fā)明的撓性多肽通 常是由與上文所列示撓性多肽中之一或多個(gè)具有以下同一性的氨基酸序列組成：85%或更 大，例如 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%〇
[0158] 優(yōu)選地，本發(fā)明的撓性多肽包括以下各項(xiàng)或由其組成：SEQ ID N0:7、8、9、10或11 及其片段或變體。
[0159] 本發(fā)明的優(yōu)選剛性多肽是SEQ ID N0:7( "撓性_1"）、SEQ ID N0:8( "撓性_2"）、 SEQ ID N0:9( "撓性 _3"）、SEQ ID N0:10( "撓性 _4"）或 SEQ ID N0:11( "撓性 _5"）及 其片段和/或變體。
[0160] "撓性 _1"
[0161] TGESNTVRGKRGSYKDEN R(SEQ ID N0:7):撓性 _1
[0162] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的撓性多肽（i)由SEQ ID N0:7組成；（ii)包括氨基 酸序列 SEQ ID N0:7 ;(iii)與 SEQ ID N0:7 具有至少 85%的同一性，即 85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡0 ID N0:7的10個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，g卩10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個(gè)連續(xù)氨基 酸。本發(fā)明撓性_1多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸。
[0163] "撓性 _2"
[0164] FRESNTIRGKRETTKDEN R(SEQ ID N0:8):撓性 _2
[0165] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的撓性多肽（i)由SEQ ID N0:8組成；（ii)包括氨基 酸序列SEQ ID N0:8;(iii)通常與SEQ ID N0:8具有至少85%的同一性，優(yōu)選與SEQ ID 勵(lì):8具有至少91%的同一性，即91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/ 或（iv)含有SEQ ID N0:8的9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或19個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明撓性_2多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸。
[0166] "撓性 _3"
[0167] TKETSATRGKRETTKDEG K(SEQ ID N0:9):撓性 _3
[0168] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的撓性多肽（i)由SEQ ID N0:9組成；（ii)包括氨基 酸序列SEQ ID N0:9;(iii)通常與SEQ ID N0:9具有至少85%的同一性，優(yōu)選與SEQ ID 勵(lì):9具有至少91%的同一性，即91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/ 或（iv)含有SEQ ID N0:9的9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或19個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明撓性_3多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸。
[0169] "撓性 _4"
[0170] ARETSIVRGKRDYFKDEG K(SEQ ID N0:10):撓性 _4
[0171] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的撓性多肽（i)由SEQ ID N0:10組成；（ii)包括氨基 酸序列 SEQ ID N0:10 ;(iii)與 SEQ ID 勵(lì):7具有至少85%的同一性，即85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡0 ID N0:10的9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個(gè)連續(xù)氨 基酸。本發(fā)明撓性_4多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸。
[0172] "撓性 _5"
[0173] SSESNITRGKREYTKDEG R(SEQ ID N0:11):撓性 _5
[0174] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的撓性多肽（i)由SEQ ID N0:11組成；（ii)包括氨 基酸序列SEQ ID NO: 11 通常與SEQ ID NO: 11具有至少85%的同一性，優(yōu)選與SEQ ID N0:11 具有至少 90%的同一性，即 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99% ;和/或（iv)含有SEQ ID N0:11的10個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，g卩10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明撓性_5多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸。
[0175] 剛性多肽
[0176] 發(fā)明人所鑒別的適用于BBB運(yùn)輸?shù)挠忠唤M多肽稱為"剛性多肽"。本發(fā)明的"剛性 多肽"如此命名的原因在于，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括a -螺旋且其設(shè)計(jì)是基于RAP-LA復(fù)合物的共 結(jié)晶。鑒于已鑒別出RAP的主要相互作用基序（論述于下文實(shí)例中），發(fā)明人進(jìn)而分析了此 基序以提供能夠穿過(guò)BBB的其他多肽。本發(fā)明的剛性多肽代表優(yōu)于全長(zhǎng)RAP的改良，此乃 因其更短且因此產(chǎn)生廉價(jià)且容易。而且，使用較短多肽來(lái)達(dá)成穿過(guò)BBB的相同或優(yōu)選通道 允許向患者施用更小重量的多肽。
[0177] 本發(fā)明的剛性多肽包括具有以下共有序列的氨基酸序列或由其組成：
[0178] (K/R)A(A/E/Q)K A (A/E/Q) A (K/R)
[0179] 優(yōu)選地，本發(fā)明的剛性多肽包括具有以下共有序列的氨基酸或由其組成：
[0180] G D(A/E)a (K/R)A(A/E/Q)K A (A/E/Q) A (K/R) A XPG Y
[0181] 其中優(yōu)選地，。為1-10,且p為1-25
[0182] 本發(fā)明剛性多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸，其長(zhǎng)度通常為99、98、97、96、95、90、 89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、 64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11或10個(gè)氨基酸。本發(fā)明剛性多肽的長(zhǎng)度優(yōu)選為10-45個(gè)氨基酸，即10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44 或 45 個(gè)氨基酸。
[0183] 本發(fā)明的剛性多肽亦包含上文所列示的剛性多肽的變體。本發(fā)明的剛性多肽優(yōu)選 由以下氨基酸序列組成：與上文所列示剛性多肽之一或多個(gè)具有95%或更大的同一性，例 如至少95%、96%、97%、98%、98.5%或99%的同一性。
[0184] 本發(fā)明的優(yōu)選剛性多肽是選自由以下組成的群：SEQ ID N0:12( "剛性_1"）、SEQ ID N0:13( " 剛性 _2"）、SEQ ID N0:14( " 剛性 _3"）、SEQ ID N0:15( " 剛性 _4"）或 SEQ ID N0:16 ( "剛性_5"）及其片段和/或變體。
[0185] "剛性 _1"
[0186] GDAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID N0:12):剛性 _1
[0187] "剛性_1"多肽（SEQ ID NO: 12)鑒別為單一結(jié)構(gòu)域結(jié)合劑（即可與LDLR的單一 LA模塊相互作用）。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的剛性多肽（i)由SEQ ID N0:12組成；（ii) 包括氨基酸序列SEQ ID NO: 12; (iii)通常與SEQ ID NO: 12具有至少85%的同一性，優(yōu)選 與5￡〇10勵(lì)：12具有至少95%的同一性，即95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含 有SEQ ID N0:12的16個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，即16、17、18、19或20個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā) 明剛性_1多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸（如上文所論述）。
[0188] "剛性 _2"
[0189] GDAAAARAAKAAARAAADGY(SEQ ID N0:13):剛性 _2
[0190] "剛性_2"多肽（SEQ ID NO: 13)鑒別為單一結(jié)構(gòu)域結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中， 本發(fā)明的剛性多肽⑴由SEQ ID N0:13組成；（ii)包括氨基酸序列SEQ ID N0:13 通常與SEQ ID NO: 13具有至少85%的同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO: 13具有至少95%的同一 性，即95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡〇10勵(lì)：13的11個(gè)或更多個(gè)連續(xù) 氨基酸，g卩11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明剛性_2多肽的長(zhǎng)度 小于100個(gè)氨基酸（如上文所論述）。
[0191] "剛性 _3"
[0192] GDAAAAKAAKAAAKAAAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID N0:14):剛性 _3
[0193] "剛性_3"多肽（SEQ ID NO: 14)鑒別為雙結(jié)構(gòu)域結(jié)合劑（即可同時(shí)與LDLR的兩 個(gè)LA模塊相互作用）。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的剛性多肽（i)由SEQ ID N0:14組成； (ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO: 14; (iii)與SEQ ID NO: 14具有至少85%的同一性，即 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% ;和 /或（iv)含有SEQ ID勵(lì):14的7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，即7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33 或 34 個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明 剛性_3多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸（如上文所論述）。
[0194] "剛性 _4"
[0195] GDAAEAKAEKAEAKAEAAEAKAEKAEAKAAAEGY(SEQ ID N0:15):剛性 _4
[0196] "剛性_4"多肽（SEQ ID NO: 15)鑒別為雙結(jié)構(gòu)域結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的剛性多肽（丨）由3￡〇10勵(lì):15組成；出）包括氨基酸序列5￡〇10勵(lì):15;(也）與 SEQ ID N0:15 具有至少 85% 的同一性，即 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% ;和 / 或（iv)含有 SEQ ID N0:15 的 7 個(gè)或更多個(gè) 連續(xù)氨基酸，B卩 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33或34個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明剛性_4多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸（如上 文所論述）。
[0197] "剛性 _5"
[0198] GDAAEAKAQKAQAKANAAKAKAQKAQAKAAANGY(SEQ ID N0:16):剛性 _5
[0199] "剛性_5"多肽（SEQ ID NO: 16)鑒別為推定的雙結(jié)構(gòu)域結(jié)合劑。在一些實(shí)施方 案中，本發(fā)明的剛性多肽（i)由SEQ ID N0:16組成；（ii)包括氨基酸序列SEQ ID N0:16 ; (iii)與 SEQ ID NO: 16 具有至少 85% 的同 一1性，g 卩 85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡0 1〇吣：16的7 個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，即 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33或34個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明剛性_5多肽的長(zhǎng)度小于100個(gè)氨 基酸（如上文所論述）。
[0200] 用于穿過(guò)血腦屏障的分析
[0201] 本發(fā)明的多肽及偶聯(lián)物可穿過(guò)BBB。BBB可是活體內(nèi)或可是離體或活體外BBB模 型，如業(yè)內(nèi)已知。測(cè)試多肽或偶聯(lián)物是否可穿過(guò)BBB的分析亦為業(yè)內(nèi)所熟知。
[0202] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，使用大腦源細(xì)胞的適宜活體外BBB模型包含：（i)經(jīng)分 離腦微血