。
[0274] 本發(fā)明的藥物組合物亦可包含醫(yī)藥上可接受的抗氧化劑。醫(yī)藥上可接受的抗氧化 劑的實例包含：（1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸 氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；（2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯 甲醚（BHA)、丁基化羥基甲苯（BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙醋、a-生育酚及諸如此類；及（3) 金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。
[0275] 組合物可包含溫度保護劑?？蓪⒁后w溫度保護劑添加至組合物中以降低其冰點， 例如使冰點降低至〇°C以下。因此，該組合物可儲存在0°C以下但在其冰點以上，以抑制熱 崩解。溫度保護劑亦容許冷凍組合物同時保護礦物鹽輔劑免于冷凍及解凍后的聚結或沉 降，且亦可在高溫（例如40°C以上）下保護組合物。適宜溫度保護劑應對人類施用安全、容 易與水混溶/可溶于水且不應破壞組合物中的其他組份。實例包含甘油、丙二醇和/或聚 乙二醇（PEG)。適宜PEG可具有介于200-20, OOODa范圍內(nèi)的平均分子量。在優(yōu)選實施方案 中，聚乙二醇可具有約300Da的平均分子量（'PEG-300'）。
[0276] 通過滅菌程序及通過包含各種抗細菌及抗真菌劑（例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁 醇、苯酚、山梨酸及諸如此類）二者可確保防止微生物存在。亦可期望這些組合物中包含等 滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。
[0277] 可使用例如以下不同種類賦形劑的組合使多肽及偶聯(lián)物于制劑中穩(wěn)定：（1)二糖 (例如蔗糖、海藻糖）或多元醇（例如山梨醇、甘露醇）通過優(yōu)先排除起穩(wěn)定劑作用且亦能 夠起凍干期間的低溫保護劑作用，（2)表面活性劑（例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20) 通過最小化界面（如液體/冰、液體/材料表面和/或液體/空氣界面）上蛋白的相互作 用起作用，及（3)緩沖液（例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸）有助于控制并維持制劑pH。因 此，除本發(fā)明的方法外，可使用這些二糖多元醇、表面活性劑及緩沖液來進一步穩(wěn)定本發(fā)明 的多肽及偶聯(lián)物并防止例如其聚集。
[0278] 無菌可注射溶液可通過以下步驟來制備：將所需量的活性化合物納入具有上文所 列示的一種成份或成份的組合（視需要）的適宜溶劑中，然后進行無菌微濾。通常，通過將 活性化合物納入含有基本分散介質及來自那些上文所列舉者的所需其他成份的無菌載體 中來制備分散液。在使用無菌粉末來制備無菌可注射溶液的情形下，優(yōu)選制備方法是真空 干燥及冷凍干燥（凍干），其可自其先前經(jīng)無菌過濾的溶液產(chǎn)生由活性成份加任一期望額 外成份構成的粉末。
[0279] 可偶聯(lián)至本發(fā)明多肽以產(chǎn)生單一劑型的試劑的量將根據(jù)所治療個體及具體施用 模式而變化。通常，該量將是產(chǎn)生治療效應的量。通常，以100%計，此量將介于約0.01% 至約99 %活性成份范圍內(nèi)，優(yōu)選約0. 1 %至約70 %、最優(yōu)選約1 %至約30 %的多肽或偶聯(lián)物 與藥學上可接受的載體的組合。
[0280] 醫(yī)學用途及治療方法
[0281] 本發(fā)明的多肽及偶聯(lián)物可用于療法中。具體而言，其可用于將治療劑遞送至腦。欲 治療的疾病將根據(jù)本發(fā)明多肽所運輸?shù)闹委焺┒?，但腦疾病優(yōu)選。因此，可治療的疾病包 含神經(jīng)疾病，任選地腦瘤、腦轉移、精神分裂癥、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、 卒中和/或與BBB的功能障礙相關的疾病。
[0282] 劑量及施用
[0283] 調節(jié)劑量方案以提供最佳期望反應（例如治療反應）。舉例而言，可施用單一濃 注劑，可經(jīng)一段時間施用若干分開劑量或可如治療狀況緊急程度所指示按比例減少或增加 劑量。以劑量單元形式來調配腸胃外組合物尤其有利于方便施用及劑量一致性。如本文所 使用的劑量單元形式是指適于作為單一劑量用于欲治療個體的物理離散單位；各單位含有 產(chǎn)生期望治療效應的預定量的多肽或偶聯(lián)物以及所需醫(yī)藥載體。本發(fā)明劑量單位形式的 規(guī)格取決于且直接依賴于下列因素：(a)多肽或偶聯(lián)物的獨特特征及欲達成的具體治療效 應，及（b)復合該多肽或偶聯(lián)物以治療個體敏感性的技術中的固有限制條件。
[0284] 另一選擇為，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可以持續(xù)釋放制劑形式來施用，在該情形下 需要較不頻繁的施用。劑量及頻率根據(jù)施用患者的多肽或偶聯(lián)物的半衰期而變化。施用的 劑量及頻率可根據(jù)治療為預防性抑或治療性而變化。在預防應用中，以相對較不頻繁的間 隔經(jīng)長時間段施用相對較低的劑量。一些患者在其余生中持續(xù)接受治療。在治療應用中， 有時需要在相對較短的間隔下相對較高的劑量直至減緩或終止疾病進展，且優(yōu)選直至患者 顯示疾病癥狀的部分或完全改善。此后，可向患者施用預防方案。
[0285] 本發(fā)明藥物組合物中多肽或偶聯(lián)物的實際劑量值可變化以便獲得可有效達成對 具體患者有期望治療反應的量的活性成份、組合物及施用模式，而對患者無毒。所選劑量值 將根據(jù)多種藥物代謝動力學因素而定，包含所采用的本發(fā)明具體組合物的活性、施用途徑、 施用時間、所采用多肽或偶聯(lián)物（或試劑）的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與所采用的多肽 或偶聯(lián)物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病況、 一般健康情況及先前病史以及已為醫(yī)療業(yè)內(nèi)所熟知的類似因素。
[0286] 本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的"治療有效量"優(yōu)選可降低疾病癥狀的嚴重程度，增加無疾 病癥狀期的頻率及持續(xù)時間或預防因感病性所致的損傷或殘疾。
[0287] 本發(fā)明的組合物可使用業(yè)內(nèi)已知多種方法中之一或多個經(jīng)由一或多個施用途徑 來施用。如本領域技術人員應了解，給藥途徑和/或模式應根據(jù)期望結果而變化。優(yōu)選施 用途徑包含顱內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外施用 途徑，例如通過注射或輸注。如本文所使用的詞組"腸胃外施用"意指除經(jīng)腸及局部施用外 的施用模式，通常通過注射，且包含（但不限于）靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心 內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外及胸骨 內(nèi)注射及輸注。
[0288] 另一選擇為，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可經(jīng)由非注射用途徑施用，例如局部、表皮或 黏膜施用途徑，例如經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、舌下或局部。
[0289] 本發(fā)明的多肽及偶聯(lián)物能夠穿過血腦屏障。因此，這些多肽及偶聯(lián)物通常是經(jīng)由 需要穿過BBB的通道的途徑施用，即外周施用。需要穿過BBB的通道的常用施用途徑是靜 脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)及腹膜內(nèi)。
[0290] 多肽或偶聯(lián)物可利用保護化合物免于快速釋放的載體來制備，例如控制釋放制 劑，包含植入物、經(jīng)皮貼片及微囊封遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾纳锛嫒菥酆衔铮?如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。許多用于制備這些制劑 的方法已獲得專利權或通常已為那些本領域技術人員所知。例如，參見Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 編輯，Marcel Dekker 公司， New York, 19了8。
[0291] 本發(fā)明的多肽、偶聯(lián)物或藥物組合物可利用業(yè)內(nèi)已知的醫(yī)學裝置來施用。
[0292] 診斷用途及診斷方法
[0293] 本發(fā)明的多肽及偶聯(lián)物可用于診斷中。具體而言，其可用于將診斷劑遞送至腦。欲 診斷或監(jiān)測的疾病將根據(jù)本發(fā)明多肽所運輸?shù)脑\斷劑而定，但腦疾病優(yōu)選。因此，可診斷或 監(jiān)測的疾病包含神經(jīng)疾病，任選地腦瘤、腦轉移、精神分裂癥、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森 病、亨廷頓病、卒中、和/或與BBB的功能障礙相關的疾病。
[0294] 核酸
[0295] 本發(fā)明亦提供包括編碼本發(fā)明多肽的核酸（例如核酸組合、載體或載體組合）的 組合物。本發(fā)明亦提供包括編碼本發(fā)明偶聯(lián)物（尤其其中試劑為多肽）的核酸（例如核酸 組合、載體或載體組合）的組合物。
[0296] 核酸可經(jīng)優(yōu)化以改良表達。
[0297] 編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的核苷酸序列可根據(jù)遺傳密碼來設計。因此，在本發(fā)明 的上下文中，該核苷酸序列可編碼一或多條本文所揭示的多肽序列。
[0298] 本發(fā)明亦提供可與這些核酸雜交的核酸。雜交反應可在具有不同"嚴謹性"條件 下實施。增加雜交反應嚴謹性的條件為業(yè)內(nèi)眾所周知并公開（例如[13]的第7. 52頁）。 相關條件的實例包含（按嚴謹性遞增的順序）：培育溫度為25°〇、371：、501：、551：及68°〇； 緩沖液濃度為 10XSSC、6XSSC、1XSSC、0. 1XSSC(其中 SSC 為 0? 15M NaCl 及 15mM 檸檬酸 鹽緩沖液）及其使用其他緩沖液系統(tǒng)的等效物；甲酰胺濃度為〇%、25%、50%及75% ;培 育時間為5分鐘至24小時；1、2或更多個洗滌步驟；洗滌培育時間為1、2、或15分鐘；及洗 滌溶液為6XSSC、1XSSC、0. 1XSSC或去離子水。雜交技術及其優(yōu)化為業(yè)內(nèi)所熟知[7、8、9 等]。
[0299] 核酸可在低嚴謹性條件下與靶標雜交；在其他實施方案中，其在中等嚴謹性條件 下雜交；在優(yōu)選實施方案中，其在高嚴謹性條件下雜交。低嚴謹性雜交條件的實例性設定為 50°C及10XSSC。中等嚴謹性雜交條件的實例性設定為55°C及1XSSC。高嚴謹性雜交條件 的實例性設定為68°C及0. 1 X SSC。
[0300] 本發(fā)明包含包括編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的核酸序列的互補序列的核酸（例如 用于反義或探測或用作引物）。
[0301] 本發(fā)明核酸可采用多種形式（例如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標記等）。本發(fā)明 核酸可為環(huán)形或具有支鏈，但通常將為直鏈。除非另外指明或需要，否則本發(fā)明中利用核酸 的任何實施方案既可利用雙鏈形式亦可利用構成該雙鏈形式的兩條互補單鏈形式中的每 一個。引物及探針與反義核酸一樣通常為單鏈。
[0302] 優(yōu)選提供呈以下形式的編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的核酸：呈純化或實質上純化形 式，即實質上不含其他核酸（例如不含天然核酸），尤其不含宿主細胞核酸，通常為至少約 50%純（以重量計），且通常至少約90%純。
[0303] 編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的核酸可以許多方式整體或部分地制備，例如通過化學 合成（例如DNA的亞磷酰胺合成），通過使用核酸酶（例如限制酶）消化較長核酸，通過連 接來自基因組或cDNA文庫等的較短核酸或核苷酸（例如使用連接酶或聚合酶）。
[0304] 術語"核酸"在一般意義上包含任何長度核苷酸的聚合形式，這些核酸含有脫氧核 糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。其包含DNA、RNA、DNA/RNA雜合體。其亦包含DNA 或RNA類似物，例如那些含有經(jīng)修飾骨架（例如多肽核酸（PNA)或硫代磷酸酯）或經(jīng)修飾 堿基者。因此，本發(fā)明包含mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶、DNA、cDNA、重組核酸、具有支鏈的核 酸、質體、載體、探針、引物等。在本發(fā)明核酸采用RNA形式時，其可具有或可不具有5'帽。
[0305] 編碼本文所闡述的多肽或偶聯(lián)物的核酸可是載體的一部分。
[0306] 術語"補體"或"互補"當對于核酸使用時是指Watson-Crick堿基配對。因此，C的 補體是G，G的補體是C，A的補體是T (或U)，且T (或U)的補體是A。亦可使用諸如I (肌 苷嘌呤）等堿基來互補例如嘧啶（C或T)。
[0307] 編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的核酸可用于例如：產(chǎn)生多肽；作為雜交探針用于檢測 生物樣品中的核酸；產(chǎn)生核酸的額外拷貝；產(chǎn)生核糖酶或反義寡核苷酸；作為單鏈DNA引物 或探針；或作為三鏈形成寡核苷酸。
[0308] 本發(fā)明提供用于產(chǎn)生編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的核酸的方法，其中核酸是使用化 學方式部分或整體地合成。
[0309] 本發(fā)明提供包括編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的核苷酸序列的載體（例如克隆或表 達載體）及經(jīng)這些載體轉化的宿主細胞。
[0310] 如本文所使用，術語"優(yōu)化"意指核苷酸序列已經(jīng)改變以使用密碼子編碼氨基酸 序列，這些密碼子優(yōu)選用于產(chǎn)生細胞或有機體，通常為真核細胞，例如畢赤酵母屬（Pichia) 細胞、中國倉鼠卵巢細胞（CH0)或人類細胞。優(yōu)化核苷酸序列經(jīng)改造以完全或盡可能多地 保留最初由起始核苷酸序列（亦稱為"親代"序列）編碼的氨基酸序列。本文亦設想這些 序列在其他真核細胞中的優(yōu)化表達。由優(yōu)化核苷酸序列編碼的氨基酸序列亦視為優(yōu)化。
[0311] 序列同一性
[0312] 就序列比較而言，一個序列通常將用作參考序列與測試序列進行比較。當使用序 列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入計算機中，必要時指定子序列坐標，并指定序列 算法程序參數(shù)?？墒褂媚J程序參數(shù)，或可指定其他參數(shù)。然后，序列比較算法將基于程序 參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分數(shù)。在比較兩條序列的同一性時，這 些序列不必鄰接，但任何空位將產(chǎn)生罰分，此會降低整體同一性百分數(shù)。對于blastn，預設 參數(shù)為空位開放罰分=5及空位延伸罰分=2。對于blastp，預設參數(shù)為空位開放罰分= 11及空位延伸罰分=1。
[0313] 本文中所指的序列同一性百分數(shù)是分別根據(jù)以下文獻中所闡述的BLAST算法 來測定：Altschul 等人，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977 ;及 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990。用于實施BLAST分析的軟件可經(jīng)由國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information)公開獲得。BLASTN 程序（對于核 苷酸序列）使用以下各值作為默認值：字長（W) 11、預期值（E) 10、M = 5、N = -4及兩條 鏈的比較值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下各值作為默認值：字長3及預期值 (E) 10 以及 BL0SUM62 分值矩陣（參見 Henikoff 及 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989)比對⑶50、預期值（E) 10、M = 5、N =-4及兩條鏈的比較值。
[0314] 概述
[0315] 如在本文件中所使用的術語"氨基酸序列"應包含對本文所揭示的每一序列及其 片段、同源物、衍生物及變體的提及。
[0316] 術語"包括"涵蓋"包含"以及"由……組成"，例如"包括"X的組合物可唯一地由 X組成或可包含額外物項，例如X+Y。
[0317] 術語"由……組成"意指"包含且限于"。
[0318] 術語"基本上由……組成"意指組合物、方法或結構可包含額外成份、步驟和/或 部分，但僅在這些額外成份、步驟和/或部分在材料上不變更所主張組合物、方法或結構的 基本及新穎特征時如此。
[0319] 術語"約"關于數(shù)值x意指x± 10%。
[0320] 除非另有說明，否則本發(fā)明實踐將采用本領域技術人員已知的常規(guī)化學、生物化 學、分子生物學、免疫學及藥理學方法。這些技術于文獻中充分解釋。參見[10-17]。
[0321] 現(xiàn)將參照以下非限制性實例來進一步闡述本發(fā)明。 實施例
[0322] LA-相互作用多肽數(shù)據(jù)庫的編譯
[0323] 為編譯LA-相互作用多肽數(shù)據(jù)庫，發(fā)明人收集了已知能夠與LDLR家族成員的LA 結構域相互作用的所有多肽的結構信息。
[0324] 這些結構數(shù)據(jù)允許發(fā)明人推導出化學實體與LA結構域相互作用必須具有的重要 特征?？紤]下列LDLR家族成員（參見圖1):
[0325] 1.LDLR(低密度脂蛋白受體）是所有家族成員的原型；
[0326] 2. VLDLR (極低密度脂蛋白受體）；
[0327] 3. Ap〇ER2 (載脂蛋白E-受體2,亦稱為LRP8);
[0328] 4. MEGF7 (表皮生長因子樣蛋白7,亦稱為LRP4);
[0329] 5. LRP1 (LDL受體相關蛋白1，亦稱為LRP);
[0330] 6.LRP1B(LDL 受體相關蛋白 1B);
[0331] 7.LRP2(LDL受體相關蛋白2,亦稱為巨蛋白（Megalin))。
[0332]
[0333]
[0335] 表1 :LDLR-家族LA結構域的相互作
用伴侶[參考文獻18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30及31]。*單一或雙結合劑代表同時與配體相互作用的LA模塊的數(shù)目。
[0336] 在表1中我們報告每一 LDLR家族成員的所有結合伴侶（配體），此可參見文獻。 與LDLR成員的LA模塊相互作用的配體的群在本文中稱為"LA-相互作用多肽數(shù)據(jù)庫"。
[0337] 重要相互作用模式的合理化
[0338] 對于LDLR家族的相互作用伴侶LA結構域發(fā)現(xiàn)的信息可分為2部分：一部分是關 于活性數(shù)據(jù)且另一部分是關于結構信息。
[0339] 在文獻中，極少數(shù)活性數(shù)據(jù)集是使用相當實驗條件獲得，且因此通常不推薦使用 這些數(shù)據(jù)來建立預測模型。然而，發(fā)明人能夠提取并利用來自這些結構數(shù)據(jù)的某些重要信 息。
[0340] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些結構數(shù)據(jù)非常不均一：
[0341] ?一些配體僅結合至單一 LA結構域，而一些其他配體與2個模塊建立相互作用 (利用親合力效應）。
[0342] ?一些配體（例如小血管肽多肽）與初級結構彼此靠近定位的殘基相互作用，而其 他配體與彼此距離極遠且構成氨基酸序列的不同部分的殘基相互作用。
[0343] ?一些配體與撓性結構區(qū)域（例如環(huán)）相互作用，而其他配體與剛性結構區(qū)域（例 如a -螺旋）相互作用。
[0344] 盡管發(fā)現(xiàn)LA-相互作用多肽數(shù)據(jù)庫中的配體非常不均一，但發(fā)明人令人驚奇地發(fā) 現(xiàn)，所有LDLR家族成員的所有LA模塊的折疊高度保守。舉例而言，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，復合物中 介于LDLR的2個LA結構域之間的LA4模塊與受體相關蛋白（RAP)共結晶，如Fisher及同 事所闡述[21](參見圖3)。每一 LA模塊具有位于N末端附近的短0 -發(fā)夾、3個二硫鍵及 高度保守的鈣結合位點。鈣離子藉助4個高度保守的酸性殘基（D147、D151、D157、E158)側 鏈及2個骨架羰基（W144及D149)配位于八面體幾何結構中[32]。所有這些酸性基團與 芳香族殘基（LA4上的W144及LA3上的F105) -起普遍存在于以高親和力結合至RAP的所 有LRP1LA模塊對中[33]。在所研宄復合物的所有結構中，主要結合要素在于強靜電相互作 用，其中在帶正電荷的賴氨酸（配體）與保守酸性基團之間形成多個H-鍵，從而在鈣離子 周圍形成帶負電荷的冠（受體）。此外，受體中的保守芳香族殘基利用疏水性相互作用穩(wěn) 定于賴氨酸鏈的非極性區(qū)域中，如Blacklow綜述[34]中對若干相互作用蛋白伴侶所顯示 (參見圖4)。
[0345] 與LA結構域形成H-鍵或疏水性相互作用的所有配體殘基的完整列表顯示于表2 中。具有表2條目的結構具有2個相互作用結構域。（例如：2FCW代表RAP與LDLR的LA4 結構域之間的相互作用，而2FCW2代表RAP與同一受體的LA3結構域之間的相互作用）。
[0346]
[0347] 表2 :與LA結構域形成H-鍵或疏水性相互作用的配體的殘基。具有上標*的殘 基為與LA模塊的高度保守的酸性冠系統(tǒng)復合的必需賴氨酸。具有上標**的殘基為長鏈 H-鍵供體殘基。具有上標的殘基與受體的W144形成疏水性相互作用。具有上標4勺殘 基與L143形成疏水性相互作用。具有上標#的殘基與P150形成疏水性相互作用。標記有 " (b) "的疏水性相互作用僅涉及骨架原子。
[0348] 在表3中將所觀察到的最為保守的藥效特征系統(tǒng)化。
[0349]
[0350] 表3 :最為保守的藥效特征.*這些殘基相對于參考2FCW中的那些略有移位。
[0351] 2. 3能夠穿過BBB的已知多肽的建模
[0352] 除自相互作用多肽數(shù)據(jù)庫收集的信息外，發(fā)明人亦分析了已知能夠穿過BBB的多 肽。具體而言，發(fā)明人選擇研宄血管肽及調節(jié)子。未獲得這些多肽的結構信息，且因此發(fā)明 人建立模型來處理這些多肽。
[0353] 在2007年由Demeule及同事[1、2]介紹的血管肽是迄今為止唯一已知能夠利用 涉及LDLR的機制穿過BBB的多肽。已知調節(jié)子多肽穿過BBB。
[0354] 血管肽
[0355] 抑肽酶是含有Kunitz型結構域的LRP及LRP2的6500-Da蛋白酶抑制劑配體。血 管肽是顯示高于抑肽酶的轉胞吞作用能力的源自Kunitz結構域的多肽家族。在表4中，發(fā) 明人報告不同血管肽的轉胞吞作用及分布體積值。發(fā)明人將血管肽-2 (AP2)鑒別為最有希 望的多肽，此乃因其具有良好轉胞吞作用水平及較高實質/總腦分布體積比率。
[0356] 對于這些多肽的每一構成AA，這些多肽的第一分析的實施考慮Cai及同事[35]所 報導的113種物理化學性質。然后使用聚合式階層式分群方法以下列方式對多肽分群：
[0357] ?將每一 AA之間的相異性計算為113維空間中的正規(guī)化歐幾里德距離（euclidean distance)〇
[0358] ?將每一多肽之間的距離計算為處在相同位置的AA之間的距離的和。
[0359] 分群結果顯示于圖5中。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些多肽可分為3個主群：(A)血管肽5及 8;?)血管肽76、78、79、4?2、4?1、4?5、4?7 ;及（〇血管肽90及91。僅使用44物理化學 性質獲得的此分群反映轉胞吞作用的顯著變化：群（A)具有低轉胞吞作用百分比；群（B) 具有中等值（但對于API。AP5及AP7的數(shù)據(jù)丟失）；群（C)具有最高轉胞吞作用值。
[0360]
[0361] 表4:血管肽多肽的分布體積*這些值是根據(jù)原始公開案圖來推斷。
[0362] 對不同氨基酸對轉胞吞作用的效應的其他理解在傳統(tǒng)上自結構分析獲得，但目前 尚未獲得血管肽的結構信息。因此，發(fā)明人使用抑肽酶的結晶Kunitz結構域作為模板遵循 同源模型策略建立了血管肽的假設結構（PDB代碼2ZJX)。與血管肽AP2的比對顯示于下文 中，其僅因同源建模程序的功能而丟失最后一個氨基酸（Y):
[0363] AP2 1 TFFYGGSRGKRNNFKTEE 18
[0364] 2ZTX A32 TFVTGGARAKBNNFKSAE 49
[0365] 發(fā)明人出于以下原因選擇抑肽酶作為模板：
[0366] ?獲得72%的序列同一性，此遠高于同源建模的常用臨限值35%。
[0367] ?存在兩個賴氨酸（其可能為與LDLR相互作用所必需）。
[0368] ?潛在地充分定向并暴露與LDLR結合所必需的殘基。
[0369] 通過同源建模獲得的AP2的一般折疊顯示于圖6中。
[0370] 使用用于折疊預測的從頭方法[36、37、38]來確認AP2的同源模型。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 此從頭模型給出與同源模型相似的折疊（參見圖7)。
[0371] 在使用同源建模時，除AP2外，其他血管肽亦顯示Kunitz樣折疊。基于這些結果， 發(fā)明人提出血管肽具有Kunitz樣折疊。
[0372] 對AP2-LDLR相互作用建模
[0373] 然后發(fā)明人對AP2與LDLR之間的相互作用建模?？紤]到兩種主要假設：(A)AP2 作為LDLR的單一結構