3'。代表性結(jié)構(gòu)是：
基團(tuán)R1、R2和R 3各自獨(dú)立地是-(CH 2)n - CH3。/?值優(yōu)選在8和16之間，更優(yōu)選為在9 和12之間，最優(yōu)選為10。
[0146] 基團(tuán) R1'、!?2'和 R 3'各自獨(dú)立地是：（a) -H; (b) -OH ;或（c) -O-CO-R 4,其中 R4 是-H或-(CH2)m-CH3,其中直優(yōu)選為在8和16之間，更優(yōu)選為10、12或14。在2位上， 4尤選為14。在2'位上，4尤選為1〇。在3'位上，4尤選為12。因此，基團(tuán)!^'、妒'和!?3' 優(yōu)選是來自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的〇-?；?。
[0147] 當(dāng)R1'、R2'和R 3'均為-H時，則3d-MPL僅有3條?；湥?、2'和3'位上各有一 條）。當(dāng)R1'、!? 2'和R3'中僅有兩個是-H時，3d-MPL可以有4條酰基鏈。當(dāng)R1'、!? 2'和R3' 中僅有一個是-H時，3d-MPL可以有5條?；?。當(dāng)R1'、!?2'和R 3'中沒有一個是-H時， 3d-MPL可以有6條?；湣８鶕?jù)本發(fā)明使用的3d-MPL可以是具有3-6條?；湹倪@些形 式的混合物，但混合物中優(yōu)選包括具有6條酰基鏈的3d-MPL，特別是確保6條?；湹男问?占 3d-MPL總重的至少10%，例如22〇%、23〇%、24〇%、25〇%或更多。已發(fā)現(xiàn)具有6條?；湹?3d-MPL是佐劑活性最高的形式。
[0148] 因此，用于本發(fā)明的3d_MPL的最優(yōu)選形式是：
當(dāng)以混合物的形式使用3d-MPL時，在本發(fā)明的組合物中，當(dāng)提及3d-MPL的量或濃度 時，指混合物中的混合3d-MPL種類。
[0149] 典型的組合物包括濃度在25Pg/ml和20(^g/ml之間的3d-MPL，例如在5〇-15〇μ 8/ ml、75-125Pg/ml、90-ll(^g/ml 的范圍內(nèi)、或大約 10(^g/ml。通常以每劑量 25-75Pg 3d-MPL 的量施用，例如每劑量45-55Pg，或大約5(^g 3d-MPL。
[0150] 在水性條件下，3d-MPL可以形成不同尺寸的膠束聚集體或顆粒，例如直徑<150nm 或>500nm。本發(fā)明可以使用它們中的一種或兩種，可以通過常規(guī)測定選擇較好的顆粒。根 據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用較小顆粒（例如小到足以產(chǎn)生澄清的3d-MPL水性懸液），因?yàn)樗鼈兙哂?優(yōu)良的活性[139]。優(yōu)選的顆粒平均直徑小于150nm，更優(yōu)選小于120nm，甚至平均直徑可以 小于100nm。然而，在大多數(shù)情況下，平均直徑將小于50nm。當(dāng)3d-MPL被吸附至鋁鹽時，可 能無法直接測量3D-MPL的顆粒大小，但是可以在發(fā)生吸附之前測量顆粒大小?？梢酝ㄟ^動 態(tài)光散射的常規(guī)技術(shù)評估顆粒直徑，其揭示了平均顆粒直徑。當(dāng)顆粒直徑據(jù)稱為z nm時， 顆粒通常分布在此平均值附近，但至少50%數(shù)量（例如26〇%、27〇°/。、28〇%、29〇%或更多）的 顆粒的直徑在x±25%的范圍內(nèi)。
[0151] Toll-樣受體7激動劑
本發(fā)明組合物可以包括TLR7激動劑，優(yōu)選人TLR7的激動劑。TLR激動劑可以是根據(jù)式 (K)的化合物： (K) 其中： R1 是 H、C「C6alkyl、-C(R5)20H、-L1R' -L1R^ -L2R5、-L2R6、-〇L2R 5、或-OL2R6; L1 是-C (0)-或-; 1^2是C1-C6M烷基、C2-C6亞烯基、亞芳基、雜亞芳基或-((CR 4R4)p0)q(CH2) p，其中L2的 C1-C6亞烷基和C 2-(：6亞烯基任選地被1-4個氟代基團(tuán)取代； 每一個L3獨(dú)立地選自C「(：6亞烷基和-((CR 4R4) p0), (CH2) p-，其中L3的C1-C6M烷基任 選地被1-4個氟代基團(tuán)取代； L4是亞芳基或雜亞芳基； R2是H或C1-C6烷基； R3 選自 基、-L 3R5、-L1R' -L3R7、-L3L4L3R 7、-L3L4R5、-L3L 4L3R' -〇L3R5、-OL3R' -OL3L4R' -OL3L4L3R' -OR8、-OL3L4R5、-OL3L 4L3R5矛卩-C (R 5) 20H ; 每一個R4獨(dú)立地選自H和氟； R5 是-P(O) (OR9)2， R6 是-CF2P (O)(OR9)2 或-C(O) OR1。； R7 是-CF2P(O) (OR9)2 或-C(O) 0R1。； R8是H或C1-C4烷基； 每一個R9獨(dú)立地選自H和C ^C6烷基； Rltl是H或C1-C4烷基； 每一個P獨(dú)立地選自1、2、3、4、5和6,以及 q 是 1、2、3 或 4。
[0152] 式⑷化合物優(yōu)選為式（K'）： 其中：
P1選自H、C ^C6烷基，其任選地被COOH和-Y-L-X-P (O) (ORx) (ORy)取代； P2 選自 H、C1-C6烷基、C「C6烷氧基和-Y-L-X-P (0) (OR x) (ORy); 條件是 P1和 P 2至少之一是-Y-L-X-P (0) (ORx) (0RY); Rb選自MPC1-C6烷基； 浐和R Y獨(dú)立地選自H和C ^C6烷基； X選自共價鍵、〇和NH; Y選自共價鍵、〇、C(0)、S和NH; L選自共價鍵C1-C6亞烷基、C1-C6亞烯基、亞芳基、雜亞芳基、C ^C6亞烷基氧基 和-((CH2)p0), (CH2)p-，其各自任選地被1-4個取代基取代，所述取代基獨(dú)立地選自鹵素、 0H、C 1-C4烷基、-OP (0) (OH) 2和-P (0) (OH) 2; 每一個P獨(dú)立地選自1、2、3、4、5和6 ;以及 q選自1、2、3和4。
[0153] 在式（K'）的一些實(shí)施方案中：P1選自C1-C 6烷基，其任選地被COOH和-Y-L-X-P(O) (ORx) (ORy)取代；P2選自 C「C6烷氧基和-Y-L-X-P(O) (ORx) (0RY) ;RB是 C「C6烷基；X 是共價 鍵；L選自（^-(：6亞烷基和-((CH 2) p0), (CH2) p-，其各自任選地被1-4個取代基取代，所述取代 基獨(dú)立地選自鹵素、〇H、C1-C 4烷基、-OP(O) (OH) 2和-P(O) (OH) 2;每一個p獨(dú)立地選自1、2 和3 ; q選自1和2。
[0154] -種有用的TLR7激動劑是"化合物K1"（參考文獻(xiàn)140的80頁的化合物6A):
化合物Kl在水中的溶解度為大約4mg/ml，并且能良好地吸附至氫氧化鋁。
[0155] 另一種優(yōu)選的TLR7激動劑是化合物"K2"（參考文獻(xiàn)140第83頁的化合物21A):
這些TLR7激動劑可以作為鹽使用，例如式（K2)的精氨酸鹽，例如精氨酸鹽一水合物。
[0156] 其它的非抗原組分 本發(fā)明的組合物可以包含載體、賦形劑、緩沖劑等。
[0157] 為控制張力，組合物可以包括生理鹽，例如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉（NaCl)，其可以以1 和20 mg/ml之間的量存在。在特定的實(shí)施方案中，氯化鈉濃度在8-9 mg/ml之間（例如大 約 8. 5 mg/ml)。
[0158] 組合物通常具有在200 mOsm/kg和400 mOsm/kg之間的克分子滲透壓重量濃度； 優(yōu)選在240-360 mOsm/kg之間，更優(yōu)選在280-320 mOsm/kg的范圍內(nèi)。以前曾報道克分子 滲透壓重量濃度對接種引起的疼痛沒有影響[141]，但是仍然優(yōu)選將克分子滲透壓重量濃 度保持在此范圍內(nèi)。
[0159] 本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括：磷酸鹽緩沖劑； Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸鹽緩沖劑。所含的 緩沖劑通常在5-20mM的范圍。
[0160] 本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種防腐劑，但是在一些實(shí)施方案中，組合物是 不含防腐劑的。由于抗原的吸附性質(zhì)，疫苗產(chǎn)品可能是具有混濁外觀的混懸液。這種外觀 意味著不容易看到微生物污染，因此疫苗優(yōu)選含有防腐劑。當(dāng)將疫苗包裝在多劑量容器中 時，這尤其重要。優(yōu)選包含的防腐劑是2-苯氧乙醇和硫柳汞。然而，優(yōu)選在本發(fā)明的方法 過程中不使用含汞防腐劑（例如硫柳汞）。因此，在所述方法中使用的一種或所有組分中可 以基本上不含含汞防腐劑。但是，如果某種組分在用于本發(fā)明之前用這種防腐劑進(jìn)行了處 理，則難以避免存在痕量防腐劑。為安全起見，優(yōu)選最終組合物含有的汞低于大約25 ng/ ml。更優(yōu)選地，最終的疫苗產(chǎn)品含有的硫柳汞無法檢測到。通常通過先從抗原制備物中除 去含汞防腐劑，再將其加入到本發(fā)明的方法中，或者避免在用于制造組合物的組分制備過 程中使用硫柳汞來實(shí)現(xiàn)。不含汞的組合物是優(yōu)選的。
[0161] 本發(fā)明的組合物進(jìn)一步可以包含表面活性劑。加入表面活性劑以減少抗原組分聚 集。水溶液中的疫苗組分在長期儲存過程中可能會發(fā)生一種或多種抗原的沉淀。加入表面 活性劑例如聚山梨醇酯20 (聚氧乙烯（20)脫水山梨糖醇月桂酸酯；Tween 20)和聚山梨醇 酯80 (聚氧乙烯（80)脫水山梨糖醇月桂酸酯；Tween 80)可以減少或防止抗原的沉淀，例 如液體組合疫苗中的抗原沉淀。優(yōu)選地，表面活性劑的濃度按體積計不超過0.05%。如果組 合物包括HBsAg，其通常包括聚山梨醇酯20,例如如果在酵母裂解過程中使用它的話[66]。
[0162] 本發(fā)明組合物的pH通常在5. 0和7. 5之間，更典型地在5. 0和6. 0之間，以達(dá)到 最佳穩(wěn)定性，或者，如果存在白喉類毒素和/或破傷風(fēng)類毒素，在6. 0和7. 0之間。因此，本 發(fā)明的方法可以包括在包裝之前調(diào)節(jié)散裝疫苗（bulk vaccine)pH的步驟。
[0163] 本發(fā)明的組合物優(yōu)選是無熱原的（non-pyrogenic)，例如每劑量含有〈1 EU (內(nèi)毒 素單位，標(biāo)準(zhǔn)測量；I EU等于每劑量0.2 ng FDA參比標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 EC-2 'RSE'），優(yōu)選每劑 量〈0· I EU。
[0164] 本發(fā)明的組合物優(yōu)選不含谷蛋白。
[0165] 本發(fā)明的組合物優(yōu)選是無菌的。
[0166] 本發(fā)明的組合物優(yōu)選是水溶液的形式。在制備過程中，通常用WFI (注射用水）稀 釋抗原以得到所需的終濃度。
[0167] 在本發(fā)明的最終疫苗組合物中，來源于單個抗原組分的殘留材料也可以以痕量存 在。例如，如果用甲醛制備白喉、破傷風(fēng)和百日咳類毒素，那么最終疫苗可能含有痕量的甲 醛（例如低于lOMg/ml，優(yōu)選<5Pg/ml)。在脊髓灰質(zhì)炎病毒制備過程中可能已使用培養(yǎng)基 或穩(wěn)定劑（例如培養(yǎng)基199)，這些可能繼續(xù)存在在最終的疫苗中。類似地，游離氨基酸（例 如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、 脯氨酸和/或羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、 色氨酸、酪氨酸和/或纈氨酸）、維生素（例如膽堿、抗壞血酸鹽等）、磷酸氫二鈉、磷酸二 氫鉀、鈣、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、酚紅、乙酸鈉、氯化鉀等，各自可在最終疫苗中保留IlOOKg/ ml，優(yōu)選〈l(^g/ml。來自抗原制備物的其它組分，如新霉素（例如新霉素硫酸鹽，具體來自 IPV組分）、多粘菌素 B (例如硫酸多粘菌素 B，具體來自IPV組分）等，也可以在每劑量中 存在亞納克的量。來自于抗原制備物的最終疫苗的其它可能組分產(chǎn)生于抗原的不完全純化 (less-than-total purification)。因此可能存在少量的百日咳博德特氏菌、白喉棒桿菌、 破傷風(fēng)梭菌和釀酒酵母蛋白和/或基因組DNA。為了使這些殘留的組分的量最小化，優(yōu)選在 這些抗原用于本發(fā)明的方法之前對抗原制備物進(jìn)行處理以除去它們。
[0168] 包裝本發(fā)明的組合物 本發(fā)明可以提供適合于包裝為單個劑量的散裝材料，其隨后可被分配用于施用給患 者。上述提及的濃度通常是最終包裝劑量中的濃度，因此散裝疫苗中的濃度可以更高（例 如通過稀釋降低至最終濃度）。
[0169] 人肌內(nèi)疫苗通常以單位劑量給藥，其個別劑量體積為0. 5ml。因此，本發(fā)明的方法 可以包括取出〇. 5ml混合物樣品并將其包裝在容器中的步驟。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)提及0. 5ml劑 量時，其包括正常偏差，例如〇. 5ml±0. 05ml。在多劑量的情況下，一起取出多劑量的量并包 裝在單個容器中，例如在10-劑量的多劑量容器裝入5ml (或5. 5ml，10%的溢裝量）。
[0170] 本發(fā)明的方法可以包括將疫苗包裝在容器中以便使用的步驟。合適的容器包括小 瓶和一次性注射器（優(yōu)選為無菌的）。
[0171] 將本發(fā)明的組合物裝在小瓶中時，小瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。在將組合物 加入小瓶之前優(yōu)選對其進(jìn)行滅菌。為了避免乳膠敏感型患者的問題，優(yōu)選用無乳膠的塞子 密封小瓶。小瓶可以包括單一劑量的疫苗，或者其可以包括一個以上的劑量（"多劑量"小 瓶），例如10劑量。當(dāng)使用多劑量小瓶時，應(yīng)當(dāng)用無菌針頭和注射器在嚴(yán)格無菌的條件下取 出各劑量，注意避免污染小瓶內(nèi)容物。優(yōu)選地，小瓶由無色玻璃制成。
[0172] 小瓶可以有帽，所述帽適合于使得預(yù)裝填注射器可以插入該帽（例如魯爾（Luer) 鎖），可以將注射器的內(nèi)容物推入小瓶（例如在其中重構(gòu)凍干物質(zhì)），并可以將小瓶的內(nèi)容 物移回注射器中。從小瓶中移出注射器后，可以連上針頭，并組合物可以施用給患者。該帽 優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)，以便在封口或蓋子移除之后才能接觸到該帽。
[0173] 當(dāng)組合物被包裝到注射器中時，注射器通常不會連接有針頭，但可以提供單獨(dú)的 針頭與注射器組裝和使用。優(yōu)選安全針頭。通常是1-英寸23-號、1-英寸25-號和5/8-英 寸25-號針頭。注射器可具有剝離標(biāo)簽，該標(biāo)簽上可打印有批號和失效日期，以幫助保存記 錄。注射器的活塞優(yōu)選帶有防脫裝置，以防止活塞在吸出過程中意外脫出。注射器可以具有 乳膠橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在 連接針頭之前密封頂端。且頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，則針 頭優(yōu)選地裝有丁基橡膠護(hù)罩。優(yōu)選灰色丁基橡膠。有用的注射器是以商品名"Tip-Lok"? 銷售的注射器。
[0174] 當(dāng)使用玻璃容器（例如注射器或小瓶）時，優(yōu)選使用由硼硅酸鹽玻璃而不是鈉鈣 玻璃制成的容器。
[0175] 當(dāng)將組合物包裝在容器中之后，可將容器封裝到用于分銷的箱子中，例如紙箱中， 該箱子標(biāo)有該疫苗的詳細(xì)情況，例如其商品名、疫苗中抗原列表（例如"乙型肝炎重組物" 等）、提供的容器（例如"一次性預(yù)裝填Tip-Lok注射器"或"10 X 0.5 ml單劑量小瓶"）、 其劑量（例如"每個含有一 〇. 5ml劑量"）、警示（例如"僅用于成人"或"僅用于兒童"）、失 效日期、說明、專利號等。每箱可以含有一個以上的包裝疫苗，例如5-10個包裝疫苗（特別 是對于小瓶）。如果疫苗裝在注射器中，那么包裝可以顯示注射器的圖片。
[0176] 可將疫苗與說明書包裝在一起（例如在同一個箱子中），所述說明書包括疫苗的 詳細(xì)情況，例如施用說明、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。說明還可以含有警示，例如如果接種 后發(fā)生過敏反應(yīng)，請準(zhǔn)備好腎上腺素溶液等。
[0177] 包裝疫苗優(yōu)選儲存于2 °C-8 °C。不應(yīng)將其冷凍。
[0178] 在制備過程中疫苗可以全液體的形式提供（即所有抗原組分都在水溶液或懸液 中），或者它們可以這樣的形式制備，其中一些組分為液體形式，而其它組分為凍干形式。因 此，可以在使用時通過混合以下兩種組分來即時制備最終疫苗：(a)含有水性抗原的第一 組分；和（b)含有凍干抗原的第二組分。這兩種組分優(yōu)選裝在單獨(dú)的容器（例如小瓶和/ 或注射器）中，本發(fā)明提供包含組分（a)和（b)的試劑盒。這種形式對于包括綴合組分，特 別是Hib和/或腦膜炎球菌和/或肺炎球菌綴合物的疫苗來說是特別有用的，因?yàn)樗鼈冊?凍干形式下可能是更穩(wěn)定的（而D、T、P和HBsAg組分優(yōu)選為液體形式）。因此在用于本發(fā) 明之前，綴合物可以被凍干。在凍干之前可以加入其它組分，例如穩(wěn)定劑。所包含的優(yōu)選穩(wěn) 定劑是乳糖、蔗糖和甘露醇，及其混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。 因此，最終的疫苗可能含有乳糖和/或蔗糖。使用蔗糖/甘露醇混合物可以加速干燥過程。
[0179] 因此，本發(fā)明提供了制備兩容器組合疫苗的方法，包括下述步驟： -如上所述制備水性組合疫苗，但其中所述一種或多種抗原不包括綴合的莢膜多糖抗 原； -將所述水性組合疫苗包裝在第一容器（例如注射器）中； -制備凍干形式的綴合莢膜多糖抗原； -將所述凍干抗原包裝在第二容器（例如小瓶）中；以及 -將第一容器和第二容器一起包裝在試劑盒中。
[0180] 然后可將試劑盒分配給醫(yī)生。在接種前，在醫(yī)生辦公室，混合兩個容器的內(nèi)容物以 得到準(zhǔn)備好施用的單一液體疫苗。
[0181] 疫苗的治療和施用方法 本發(fā)明的組合物適合于給人類患者施用，并且本發(fā)明提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的 方法，包括給患者施用本發(fā)明組合物的步驟。本