用于組合疫苗的非交聯(lián)無細(xì)胞百日咳抗原的制作方法
【專利說明】用于組合疫苗的非交聯(lián)無細(xì)胞百日咳抗原
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年10月12日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)61/713, 356的利益，為 所有目的將其全部內(nèi)容通過引用的方式合并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及包含無細(xì)胞百日咳抗原的穩(wěn)定組合物，所述無細(xì)胞百日咳抗原沒有用 交聯(lián)試劑例如甲醛或戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，以及它們在組合疫苗中作為無細(xì)胞百日咳組分的用 途。
[0003] 背景 百日咳博德特氏菌（AorofeieWa 引起百日咳。疫苗中的百日咳抗原或者是 細(xì)胞的（全細(xì)胞，以滅活的百日咳博德特氏菌細(xì)胞的形式；"wP")，或者是無細(xì)胞的（"aP")。 細(xì)胞百日咳抗原的制備有詳細(xì)記載（例如，參見參考文獻(xiàn)1的第21章），例如可以通過對(duì)百 日咳博德特氏菌的I階段培養(yǎng)物的加熱滅活獲得。無細(xì)胞百日咳抗原包含脫毒的百日咳毒 素（百日咳類毒素，或"PT"）；（2)絲狀血凝素（"FHA"）；和⑶百日咳桿菌粘附素（也被 稱為"69KD外膜蛋白")。通常通過從在改良的Stainer-Scholte液體培養(yǎng)基中生長的百日 咳博德特氏菌培養(yǎng)物中進(jìn)行分離來制備這三種抗原。一些百日咳疫苗中另外包括百日咳博 德特氏菌菌毛（例如凝集原2和3)。
[0004] PT和FHA可以從發(fā)酵液中分離（例如通過羥基磷石灰凝膠吸附），而百日咳桿菌 粘附素可以通過加熱處理和絮凝（例如使用氯化鋇）從細(xì)胞中提取。然后在連續(xù)的層析和 /或沉淀步驟中純化抗原?？梢酝ㄟ^疏水層析、親和層析和尺寸排阻層析純化PT和FHA?？?以通過離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析純化百日咳桿菌粘附素。
[0005] 在將FHA和百日咳桿菌粘附素加入到疫苗制劑之前通常用甲醛作為交聯(lián)劑對(duì)其 進(jìn)行處理。通常通過用交聯(lián)劑例如甲醛或戊二醛處理來對(duì)PT進(jìn)行脫毒。作為這種化學(xué)脫 毒程序的一種替代選擇，可以通過酶活性所必需的并且由此負(fù)責(zé)抗原毒性的氨基酸的取代 來對(duì)PT進(jìn)行基因脫毒[2]。但是，基因脫毒的PT可能是不穩(wěn)定的，且當(dāng)以液體形式儲(chǔ)存時(shí) 易于降解[3]，因此用低濃度的甲醛處理來使蛋白質(zhì)穩(wěn)定，而不影響其物理化學(xué)和免疫學(xué)指 標(biāo)[4]。
[0006] 抗原與交聯(lián)劑例如甲醛或戊二醛的交聯(lián)是附加的處理步驟，其增加了制備疫苗相 關(guān)的成本，并在整個(gè)生產(chǎn)方法中引入了附加變量。但是，安全考慮，特別是當(dāng)從同一個(gè)百日 咳博德特氏菌培養(yǎng)物中分離FHA和百日咳桿菌粘附素作為酶活性PT時(shí)，導(dǎo)致采納這樣的制 備方法：在加入疫苗之前將所有百日咳博德特氏菌抗原組分滅活，優(yōu)選通過甲醛處理來滅 活。此外，認(rèn)為甲醛處理有益于增加液體疫苗制劑中各個(gè)單個(gè)百日咳博德特氏菌抗原的穩(wěn) 定性。
[0007] 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，從攜帶有基因脫毒PT的編碼基因的百日咳博德特氏菌菌株充分純化 基因脫毒的PT和其它百日咳博德特氏菌抗原，使得不需要對(duì)PT和其它百日咳博德特氏菌 抗原進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。單獨(dú)純化的組分甚至在升高的溫度下進(jìn)行長期儲(chǔ)存后（在37°c至少一 個(gè)月）還保持穩(wěn)定性和免疫原性，而無需用甲醛或其它交聯(lián)劑進(jìn)行處理。
[0008] 發(fā)明簡述 本發(fā)明提供安全的和具有免疫原性的疫苗組合物，其不再需要用交聯(lián)劑處理百日咳博 德特氏菌抗原。本發(fā)明的疫苗制劑可與包含無細(xì)胞百日咳組分的標(biāo)準(zhǔn)組合疫苗以相同的方 式儲(chǔ)存，而不會(huì)由于儲(chǔ)存期間的抗原降解而導(dǎo)致喪失效力。具體而言，本發(fā)明涉及疫苗組合 物，其包含至少兩種未交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌 粘附素，條件是任何PT均是基因脫毒的。
[0009] 本發(fā)明還涉及組合疫苗，其包含基因脫毒的百日咳毒素和一種或多種選自IPV、 HBsAg和Hib的其它抗原，其特征在于基因脫毒的百日咳毒素未用交聯(lián)劑進(jìn)行處理。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合疫苗，其包含百日咳博德特氏菌抗原PT、 FHA和百日咳桿菌粘附素，其特征在于至少兩種百日咳博德特氏菌抗原未用交聯(lián)劑進(jìn)行處 理，條件是，如果PT未用交聯(lián)劑處理，則PT是基因脫毒的百日咳毒素。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合疫苗，其包含鋁鹽佐劑和至少兩種未交聯(lián) 的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，條件是任何PT均 是基因脫毒的。Al+++濃度優(yōu)選低于I mg/ml。本發(fā)明的組合疫苗可以進(jìn)一步包括一種或兩 種Toll樣受體（TLR)激動(dòng)劑，其可以被吸附至鋁鹽佐劑。例如，本發(fā)明的組合疫苗可以包 括TLR4激動(dòng)劑（例如3d-MPL)或TLR7激動(dòng)劑（例如化合物T，見下文），其通常被吸附至 錯(cuò)鹽佐劑。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及組合疫苗，其包含水包油乳液佐劑和至少兩種未交聯(lián) 的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，條件是任何PT均是 基因脫毒的。本發(fā)明的組合疫苗中使用的水包油乳液佐劑包括MF59和/或AS03。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及不含防腐劑的組合疫苗，其包含至少兩種未交聯(lián) 的百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，條件是任何未交聯(lián) 的PT均是基因脫毒的。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合疫苗，其包含至少兩種未交聯(lián)的百日咳博 德特氏菌抗原，所述抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，條件是任何PT均是基因脫毒 的，其中PT:FHA:百日咳桿菌粘附素的重量比為1:1:2或16:16:5或5:10:6或20:20:3或 25:25:8 或 10:5:3。
[0015] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合疫苗，其包含D、T、aP，其中按Lf單位測量 的D對(duì)T的比例在2:1和3:1之間，并且aP組分包含至少兩種未交聯(lián)的百日咳博德特氏菌 抗原，所述抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，條件是任何PT均是基因脫毒的。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合疫苗，其包含D、T、aP，其中按Lf單位測量 的T對(duì)D的比例大于1. 5,并且aP組分包含至少兩種未交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原，所述 抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，條件是任何PT均是基因脫毒的。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合疫苗包括基因脫毒的百日咳桿菌粘附素例如 PT-9K/129G。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備aP組分的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)基因脫毒PT的百日 咳博德特氏菌菌株的培養(yǎng)物，從培養(yǎng)物純化兩種或更多種百日咳博德特氏菌抗原以獲得兩 批次產(chǎn)物或更多批次產(chǎn)物，每一批次產(chǎn)物各含有不同的純化百日咳博德特氏菌抗原，以及 將兩批次產(chǎn)物或更多批次產(chǎn)物混合以制備aP組分，其中所述方法的特征在于純化的百日 咳博德特氏菌未用交聯(lián)劑進(jìn)行處理。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于制備aP組分的方法，其包括培養(yǎng)已刪除了 PT編碼基因的百日咳博德特氏菌菌株的培養(yǎng)物，從培養(yǎng)物純化兩種或更多種百日咳博德特 氏菌抗原以獲得兩批次產(chǎn)物或更多批次產(chǎn)物，每一批次產(chǎn)物各含有不同的純化的百日咳博 德特氏菌抗原，以及將兩批次產(chǎn)物或更多批次產(chǎn)物混合以制備aP組分，其中所述方法的特 征在于純化的百日咳博德特氏菌未用交聯(lián)劑進(jìn)行處理。
[0020] 發(fā)明詳述 百日咳毒素 百日咳毒素是由5個(gè)亞基構(gòu)成的105 KD蛋白，命名為Sl至S5。僅有Sl亞基具有酶活 性并對(duì)真核細(xì)胞具有毒性效果。亞基S2、S3、S4和S5以1:1:2:1的比例存在，并形成無毒 的低聚物（B寡聚物），其結(jié)合真核細(xì)胞表面上的受體，并將有毒性的亞基Sl遞送穿過真核 細(xì)胞膜。通過替換百日咳博德特氏菌菌株中Sl亞基的酶活性所必需的氨基酸的密碼子，可 以獲得產(chǎn)生基因脫毒PT的百日咳博德特氏菌菌株。
[0021] 通過取代突變鑒別了百日咳毒素的兩個(gè)區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域與霍亂毒素（CT)和大 腸桿菌不耐熱毒素（LT)的氨基酸序列共享序列同源性，并且對(duì)PT的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活 性有貢獻(xiàn)。第一個(gè)區(qū)域位于殘基8和13之間。特別地，發(fā)現(xiàn)Arg-9被Lys-9取代的突變體 Sl具有大大降低的毒性[5]。Sl的第二個(gè)區(qū)域，位于殘基51和59之間，也顯示出參與百日 咳毒素的酶活性，例如當(dāng)Arg-58變?yōu)镚lu-58時(shí)[6]。使用放射標(biāo)記的NAD通過光交聯(lián)實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)Sl亞基的位置129上的谷氨酸殘基是酶催化位點(diǎn)的一部分[7]。殘基129的取代產(chǎn)生 的PT突變體酶活性大幅降低并由此具有非常低的毒性。還可以通過突變Trp-26、His-35 和Cys-41對(duì)百日咳毒素進(jìn)行脫毒[6]。
[0022] Sl的單突變導(dǎo)致百日咳毒素的毒性和酶活性降低多達(dá)1000倍，而在Sl亞基中具 有多個(gè)取代的突變體（Lys-9 Gly-129, Glu-58 Gly-129,和 Lys-9 Glu-58 Gly-129)是大 約IO6-倍脫毒的[6]。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的百日咳毒素突變形式具有降低的或無法檢測到的毒性，但 是保留了誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的能力。這些包括Sl雙突變體PT-9K/129G、PT-13L/129G、和 PT-26I/129G。優(yōu)選地，基因脫毒的PT是PT-9K/129G，即在殘基9上是賴氨酸并且在殘基 129上是甘氨酸，如參考文獻(xiàn)8所述。
[0024] 疫苗組合物 本發(fā)明涉及疫苗組合物，其包含至少兩種百日咳博德特氏菌抗原，所述抗原選自PT、 FHA和百日咳桿菌粘附素，所述抗原未用交聯(lián)劑進(jìn)行處理，條件是任何PT均是基因脫毒的。 蛋白質(zhì)抗原與交聯(lián)劑例如甲醛或戊二醛的廣泛交聯(lián)可以干擾抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的裂解， 或者干擾通常與天然狀態(tài)存在的抗原相關(guān)的結(jié)構(gòu)柔性。例如，甲醛處理導(dǎo)致百日咳博德特 氏菌抗原中氨基酸（主要是賴氨酸）的改變，并由此引起結(jié)構(gòu)和功能上的改變?？梢酝ㄟ^ 胰蛋白酶消化將未交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原與交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原區(qū)分開， 因?yàn)榻宦?lián)的抗原與未交聯(lián)的抗原顯示出不同的蛋白酶敏感性。
[0025] 本發(fā)明的未交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原可以表現(xiàn)出比傳統(tǒng)的、交聯(lián)的百日咳博 德特氏菌抗原更高的效力。因此，與所有百日咳博德特氏菌抗原均被交聯(lián)的傳統(tǒng)疫苗相比， 每一種未交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原可以僅需要較小的量，就能產(chǎn)生類似水平的保護(hù)性 免疫。除此之外，或者可選擇地，當(dāng)未交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原與傳統(tǒng)的、交聯(lián)的百日 咳博德特氏菌抗原以相同的劑量施用時(shí)，與傳統(tǒng)的、交聯(lián)的百日咳博德特氏菌抗原獲得的 免疫原性水平相比，可以增強(qiáng)免疫原性。
[0026] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，百日咳博德特氏菌抗原之一是基因脫毒的百日咳毒 素（例如PT-9K/129G)。包含基因脫毒的百日咳毒素的疫苗組合物通常需要較小量的PT， 以獲得與通過傳統(tǒng)的甲醛或戊二醛交聯(lián)脫毒的PT相當(dāng)?shù)幕蚋叩拿庖咴?，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn) 基因脫毒的PT比通過傳統(tǒng)脫毒方法產(chǎn)生的PT更具有免疫原性[9，10]。可以進(jìn)一步提高 免疫原性，因?yàn)槲唇宦?lián)的、基因脫毒的PT能夠更有效地被抗原呈遞細(xì)胞加工，并因其更大 的結(jié)構(gòu)柔性而為更大范圍的T細(xì)胞受體提供更好的底物[11]。因此，可以進(jìn)一步減少本發(fā) 明的疫苗組合物中的基因脫毒PT的量，其中已省略了交聯(lián)步驟，而不影響疫苗組合物的免 疫原性。或者，可以使用相同量的基因脫毒PT代替疫苗組合物中的傳統(tǒng)的交聯(lián)PT組分以 獲得相對(duì)于PT抗原的更高的免疫原性。
[0027] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所有三種百日咳博德特氏菌抗原PT、FHA 和百日咳桿菌粘附素在加入疫苗組合物之前都沒有用交聯(lián)劑進(jìn)行處理。在這樣的實(shí)施方案 中，使用其中百日咳毒素 Sl亞基編碼基因已被突變以使得突變體形式缺少全部的或基本 上全部的酶活性的百日咳博德特氏菌菌株通過基因途徑實(shí)現(xiàn)PT的脫毒。
[0028] 但是，其中僅僅FHA和百日咳桿菌粘附素沒有用交聯(lián)劑進(jìn)行處理的組合物也可以 是有用的，因?yàn)榻宦?lián)劑使用的任何減少都會(huì)簡化生產(chǎn)并減少化學(xué)廢物的產(chǎn)生。此外，最終的 疫苗制劑中存在的殘余甲醛的總量可以充分降低至無法檢測的水平，由此減少了患者對(duì)甲 醛負(fù)面反應(yīng)的可能性，特別是對(duì)于易于產(chǎn)生這種反應(yīng)的患者。
[0029] 本發(fā)明因此涉及無細(xì)胞百日咳（aP)組分，其包含至少兩種未交聯(lián)的的百日咳博 德特氏菌抗原，所述抗原選自PT、FHA和百日咳桿菌粘附素，條件是任何PT均是基因脫毒 的。優(yōu)選地，本發(fā)明的aP組分包含未交聯(lián)的FHA、未交聯(lián)的百日咳桿菌粘附素和未交聯(lián)的、 基因脫毒的PT，或者由它們組成?；蛘?，只有FHA和百日咳桿菌粘附素未用交聯(lián)劑例如甲醛 或戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。
[0030] aP組分中每一種抗原的量一般以μ g表示。本發(fā)明的疫苗一般每單位劑量包括 2-30 Pg之間的PT。在第一種類型的疫苗中，PT可以以每單位劑量5-3(^g之間的量（例 如5、7. 5、20或25Pg)存在，而在第二種類型的疫苗中，組合物通常包括每單位劑量2-10 Pg 之間的PT (例如2. 5Pg或8Pg)。如果疫苗包括FHA，其通常以每單位劑量2-30 Pg之間的 量存在。在第一種類型的疫苗中，F(xiàn)HA可以以每單位劑量2. 5-25Pg之間的量（例如2. 5、 5、10、20或25Pg)存在，而在第二種類型中，F(xiàn)HA可以以每單位劑量4-l(^g之間的量存在 (例如5Pg或8Pg)。如果疫苗包括百日咳桿菌粘附素，它通常以每單位劑量2-10 Pg之間 的量存在。在第一種類型的疫苗中，百日咳桿菌粘附素可以以每單位劑量2. 5-l(^g之間的 量存在（例如2. 5、3、8或1〇μ0，而在第二種類型的疫苗中，百日咳桿菌粘附素可以以每單 位劑量2_3Pg之間的量存在（例如2. 5Pg或3Pg)。
[0031] 因此用于青少年和成人的增強(qiáng)疫苗通常每單位劑量含有2. 5-8 μ g的ΡΤ、4和8 μ g之間的FHA和2. 5和8 μ g之間的百日咳桿菌粘附素。優(yōu)選地，增強(qiáng)疫苗每單位劑量包 含4 ygPT、4 ygFHA和8 yg百日咳桿菌粘附素，更優(yōu)選5 ygPT、2.5 ygFHA和2.5 Ug百日咳桿菌粘附素。兒科疫苗優(yōu)選包含每單位劑量7 yg或7. 5Pg PT、10 yg FHA和 10 yg百日咳桿菌粘附素。通常施用的單位劑量體積是0.5 ml。
[0032] 疫苗通常含有每單位劑量18(^g的總無細(xì)胞百日咳抗原。每一個(gè)單獨(dú)的抗原通常 以每單位劑量QOPg的量存在。
[0033] 通常本發(fā)明的疫苗中存在PT、FHA和百日咳桿菌粘附素的每一個(gè)。它們可以以 不同的量存在，例如PT:FHA:百日咳桿菌粘附素的量（Pg)為20:20 :3、25:25:8、16:16:5、 5:10:6、4:4:8、5:2. 5:2. 5、7. 5:10:10、或10:5:3。還可以使用這些量的倍數(shù)，例如 10:10:1. 5、或 30:30:4. 5、或 20:10:6 等。一種有用的疫苗包括 4Pg PT、4Pg FHA 和 8Pg 百 日咳桿菌粘附素。通常FHA相對(duì)于百日咳桿菌粘附素是過量的，如果二者都存在的話。
[0034] 如果疫苗包括鋁鹽佐劑，那么疫苗中的PT優(yōu)選被吸附（有時(shí)完全吸附）至鋁鹽， 優(yōu)選被吸附至氫氧化鋁佐劑。任何FHA也可以被吸附至鋁鹽。任何百日咳桿菌粘附素可以 被吸附至鋁鹽佐劑，但是百日咳桿菌粘附素的存在通常意味著組合物需要存在氫氧化鋁以 確保穩(wěn)定吸附[12]。
[0035] 對(duì)于無細(xì)胞百日咳，使用改良的小鼠腦內(nèi)保護(hù)測定（MICA)來確定效價(jià)。MICA是致 死的小鼠攻毒模型，其檢測由無細(xì)胞百日咳疫苗提供的小鼠保護(hù)活性。每一個(gè)半成品的效 價(jià)表示為相對(duì)于參考疫苗的相對(duì)效價(jià)。用無細(xì)胞百日咳疫苗的國際標(biāo)準(zhǔn)（目前是JINH-3) 對(duì)參考疫苗進(jìn)行校準(zhǔn)，并且保護(hù)活性以國際單位（International Units)表示。疫苗的效 價(jià)應(yīng)當(dāng)為在單次人劑量推薦體積中至少4.0 IU，即至少8 IU/ml。
[0036] aP組分的制備 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備可用于制備本發(fā)明疫苗組合物中存在的aP組分的未交聯(lián) 百日咳博德特氏菌抗原的制備方法?？梢詮陌偃湛炔┑绿厥暇囵B(yǎng)物純化并被包括在根據(jù) 本發(fā)明的aP組分中的百日咳博德特氏菌抗原是PT、FHA、百日咳桿菌粘附素、凝集原2和凝 集原3。優(yōu)選地，aP組分包括PT、FHA和（任選地）百日咳桿菌粘附素。形成aP組分的純 化抗原通常以特定比例混合，已發(fā)現(xiàn)所述特定比例特別適于增強(qiáng)針對(duì)aP組分中包括的所 有百日咳博德特氏菌抗原的保護(hù)性抗體反應(yīng)。例如，PT、FHA和百日咳桿菌粘附素可以按下 述重量比混合：1:1:2 或 16:16:5 或 5:10:6 或 20:20:3 或 25:25:8 或 10:5:3。
[0037] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于制備aP組分的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)基因脫毒PT的 百日咳博德特氏菌菌株的培養(yǎng)物，從培養(yǎng)物純化兩種或更多種百日咳博德特氏菌抗原以獲 得兩批或更多批次產(chǎn)物，每一批次產(chǎn)物包含不同的純化百日咳博德特氏菌抗原，以及將兩 批或更多批次產(chǎn)物以希望的比例（見上文）混合以制備aP組分