專利名稱：重組的百日咳毒素b寡聚體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及百日咳毒素B寡聚體亞基的重組表達(dá)，以及亞基在體外結(jié)合以形成能夠用于疫苗中的非反應(yīng)原性多聚體組分，以引發(fā)抗博德特氏桿菌屬引起感染的免疫保護(hù)性反應(yīng)。
對降低百日咳疫苗之不良反應(yīng)的要求，促使人們研究以更好地了解病原體百日咳博德特氏桿菌的免疫原性成分。新的非細(xì)胞疫苗的一個(gè)重要成分是百日咳毒素(PT)，其為干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異六聚體ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(1-3)。存在于毒素S1亞基(4)中的這種酶催活性導(dǎo)致對百日咳疫苗接受者的毒性，且一般認(rèn)為是引起不良反應(yīng)的根源。因此，在生產(chǎn)毒素基百日咳疫苗中，主要關(guān)心的是除去S1亞基的酶促活性。目前，一般是用熱或甲醛和戊二醛等類毒素劑處理疫苗材料，以達(dá)到使S1失活目的。這些物理失活方法的缺點(diǎn)是，嚴(yán)格地說，它們實(shí)質(zhì)降低了毒素的保護(hù)性免疫原性;退一步說，則可在存放后出現(xiàn)分子的毒素相關(guān)性酶活性(5)。
已發(fā)展了在大腸桿菌中以重組技術(shù)生產(chǎn)各百日咳毒素亞基(6)，以及鑒定S1亞基上與酶促活性有關(guān)的關(guān)鍵性區(qū)域和形成優(yōu)勢保護(hù)性抗原決定基(7)的方法。借助位點(diǎn)特異性誘變，可消除S1亞基的酶促活性，以損害S1亞基獲得與形成保護(hù)性抗原決定基(8)或使該亞基與B寡聚體結(jié)合以組裝或全毒素樣多聚體(9)相適應(yīng)的構(gòu)象。
據(jù)信B寡聚體具有細(xì)胞受體識別區(qū)域，其為S1亞基的傳遞平臺(1.10-13);它可以作為沒有S1亞基的，由亞基S2、S3、S4和S5，以分別為1∶1∶2∶1的近似比例組成的亞聚體大分子分離得到(1)。最近已證明，本來不具有與百日咳毒素毒性相關(guān)之ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的天然B寡聚體本身即足以誘發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)(14-16);另外，在與美國食品與醫(yī)藥管理局DrusillaL.Burns博士和JuanL.Arciniega博士合作進(jìn)行的重組蛋白質(zhì)研究中，顯示S1亞基似乎對B寡聚體的保護(hù)性反應(yīng)沒有明顯貢獻(xiàn)。因此，B寡聚體顯然具有作為非細(xì)胞百日咳疫苗成分的可能。然而，在這些研究中所使用的天然B寡聚體是從全毒素分子中分離的，而且大多沒有S1亞基(＞95%)，故以這種方式得到的B寡聚體具有可檢測量的S1相關(guān)活性，而這一活性對其反應(yīng)原性起到很大作用。


圖1顯示本發(fā)明重組B寡聚體樣多聚體(以下簡稱B寡聚體)的SDS-PAGE圖譜。B寡聚體是按下文所述由重組體大腸桿菌產(chǎn)生的亞基S2、S3、S4和S5在體外組裝而成，并在胎球蛋白-Sepharose柱上親和層析純化的(17)。用三氯乙酸(TCA)沉淀已用4M MgCl2從層析柱上洗脫的樣品，并進(jìn)行SDS-PAGE(19)。然后用考馬斯藍(lán)染色。泳道1)是天然PT(商品級);泳道2)是天然B寡聚體(商品級);泳道3)是重組B寡聚體。
圖2是圖解顯示B寡聚體制劑，包括本發(fā)明的重組B寡聚體制劑的促細(xì)胞分裂活性。在RPMI1640培養(yǎng)基中以兩倍系列稀釋所指出的B寡聚體制劑。然后在B寡聚體制劑中加入小鼠脾淋巴細(xì)胞，達(dá)到如橫座標(biāo)上標(biāo)示的B寡聚體濃度。用常規(guī)方法檢測[3H]胸苷摻入(19)。因?yàn)橹亟MB寡聚體制劑儲存在高濃度尿素(2M)中，而且因其初始蛋白濃度相當(dāng)?shù)停缘拖♂尪鹊闹亟MB寡聚體制劑中含有大量足可導(dǎo)致細(xì)胞死亡的殘留尿素。各制備是天然B寡聚體(0);顯示有最高濃度的含0.125M尿素的天然B寡聚體(b);以及含有0.125M尿素顯示最高濃度的重組B寡聚體。
圖3說明用B寡聚體制劑免疫小鼠對PT之白細(xì)胞增多促進(jìn)活性的影響。5只小鼠分別經(jīng)腹腔內(nèi)注射(i.p.)本發(fā)明的重組B寡聚體制劑(rB)或天然B寡聚體制劑(B)，加在總體積為0.5ml的含明礬佐劑的PBS-凝膠中，劑量分別為8μg(rBM/BH)1μg(rBM/BM)或0.1μg(rBL/BL)(見表1)。一組5只小鼠(標(biāo)示“PT”)用PBS-凝膠作為對照免疫。一個(gè)月后，各組小鼠均用500ngPT(i.p.)攻擊(但標(biāo)示為“PBS＊”的組除外，該組用PBS攻擊);4天后測白細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果以白細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差表示。
本發(fā)明提供了衍生于重組體材料之百日咳毒素的基因工程化改造的B寡聚體樣多聚體蛋白質(zhì)(重組B寡聚體)，以及其制備方法。簡單地說，經(jīng)基因操作(如位點(diǎn)特異性誘變)產(chǎn)生毒素之S2、S3、S4和S5亞基和這些亞基類似物的順反子成分(“基因”)及其衍生物，并分別在不同轉(zhuǎn)化的異源(“外來”)宿主中表達(dá)并收獲之，然后于體外結(jié)合成類似天然B寡聚體的多聚體合成物，該合成物具有在白細(xì)胞中引發(fā)有絲分裂反應(yīng)的能力，且更重要的是可誘導(dǎo)抗百日咳毒素的免疫保護(hù)反應(yīng)。
用本發(fā)明的重組B寡聚體或從百日咳博德特氏菌產(chǎn)生的PT中分離的天然B寡聚體免疫小鼠，產(chǎn)生在ELISA分析中顯示可與PT反應(yīng)并能中和PT對培養(yǎng)的中國倉鼠卵(CHO)細(xì)胞之細(xì)胞病理效應(yīng)的抗體;由各制劑誘發(fā)的抗體滴度均相似。另外，用天然或重組B寡聚體免疫的小鼠可對抗PT的白細(xì)胞增多促進(jìn)活性。這些數(shù)據(jù)證明，在體外由個(gè)別重組亞基組裝的本發(fā)明的百日咳毒素B寡聚體是參予構(gòu)成非細(xì)胞百日咳疫苗的適用候選成分。
按以前所述的方法在重組大腸桿菌中生產(chǎn)各亞基(6)。在該重組體生產(chǎn)系統(tǒng)中，用起始蛋氨酸殘基取代其固有信號肽序列以合成委員長亞基多肽;除亞基S4外，異源氨基末端蛋氨酸殘基實(shí)質(zhì)上均被內(nèi)源性蛋氨酰氨基肽酶從各重組體蛋白質(zhì)上切掉。因此S4亞基是一種“蛋氨酰成熟”多肽，也就是說，它是在其氨基末端攜帶蛋氨酸殘基的天然成熟S4亞基的類似物。分別發(fā)酵以在各自的大腸桿菌重組體中合成各個(gè)重組體亞基蛋白質(zhì)。從發(fā)酵液中回收細(xì)胞團(tuán)，然后置于-60℃到-80℃下保存。于大約4℃，在1mM二硫蘇糖醇(DTT)存在下，使細(xì)胞團(tuán)兩次通過壓力為大約104psig的French榨壓器，以破碎細(xì)胞。在這些發(fā)酵條件下，重組體亞基蛋白質(zhì)是作為大腸桿菌中的不溶性包含體合成的。從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中回收這些包含體，并以差速離心法至少洗兩次;第一次是在1%脫氧膽酸(DOC)和25mM Tris-HCl(pH7.9)中，第二次是在4M尿素和25mM Tris-HCl(pH7.5)中。
將各種包含體制劑稱重，并根據(jù)它們與亞基蛋白質(zhì)的相對百分比例，即它們在天然B寡聚體中的近似摩爾比以化學(xué)計(jì)算量混合之(S2∶S3∶S4∶S5分別為1∶1∶2∶1)。加入在25mMTris-Hcl(pH8.5)中的6M鹽酸鈲(GuHCl)和10mMDTT溶液，以溶解包含體混合物;然后在室溫下將混合物輕輕攪拌過夜。離心(用JA20轉(zhuǎn)子，以18，000rpm于2℃室溫下離心30分鐘)以除去不溶性材料?；厥湛扇苄陨锨?，并在GH25層析柱中用不含DTT的上述GuHCl-Tris緩沖液洗脫以除去過多的DTT?；厥赵诨蚪艷H25柱之空體積處洗脫的蛋白峰部分?？稍谠摬襟E后的任何時(shí)間用6MGuHCl洗脫樣品。
加入Cu2SO4至終濃度為50μM;在室溫和大氣環(huán)境下將樣品緩慢攪抖過夜。經(jīng)此再氧化步驟后，使樣品對含有2M尿素的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)透析兩次(每次用5升)。/透析包裝管應(yīng)有3，500道爾頓的截留分子量。透析期間形成一種不溶性沉淀物，其可經(jīng)離心(JA14轉(zhuǎn)子，13，000rpm，室溫下離心20分鐘)除去。收集上清于2-8℃下保存。然后將樣品對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)于室溫下透析過夜;透析液體積應(yīng)不超過樣品體積的10倍，并至少應(yīng)換液一次。另外，透析包裝管應(yīng)有3，500道爾頓的截留分子量。
用市售胎球蛋白Sepharose 4B制備胎球蛋白-Sepharose親和柱，用Spiro方法(購自Gibco)純化，并在已公開的條件下共價(jià)連接。透析的樣品于2℃室溫下分兩次上胎球蛋白-Sepharose層析柱;也可利用散體(無柱)層析、洗滌及洗脫方法。相繼用PBS和含有1M NaCl的緩沖液A(0.05M Tris-HCl，pH7.5)洗已上樣的親合樹脂。用含有4M MgCl2的緩沖液A洗脫在這些條件下結(jié)合到樹脂上的樣品。
總體說來，可于溶解細(xì)菌后，作為不溶性包含體分離各重組亞基。將各包含體制劑溶解在加有1mM二硫蘇糖醇(DTT)的6M鹽酸鈲(GuHCl)中，并參照天然B寡聚體中的估計(jì)的近似摩爾比例結(jié)合各亞基(即S2∶S3∶S4∶S5分別為1∶1∶2∶1)。用基于分子大小的排阻層析法除去還原劑，在50μM Cu2SO4存在下于大氣環(huán)境中攪抖使之再氧化，并對2M尿素進(jìn)行，平衡透析，以利于各亞基的自發(fā)結(jié)合。借助其結(jié)合復(fù)雜碳水化合物的能力[一種毒素的細(xì)胞擊靶機(jī)制(20)]，通過在胎球蛋白-Sepharose柱上進(jìn)行親和層析將重組B寡聚體純化到均質(zhì)程度(根據(jù)多聚體中各亞基的純度估計(jì)之)(圖1);根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，個(gè)別亞基幾乎不能與胎球蛋白樹脂特異地結(jié)合，這表明大部分在MgCl2中洗脫的材料是多聚體形式的。檢驗(yàn)洗脫物，發(fā)現(xiàn)其對鵝紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)為陽性。用多克隆抗毒素血清進(jìn)行Western吸印分析，并進(jìn)行改良的ELISA試驗(yàn)(使用胎球蛋白包被的平板和抗S2、S3、S4和S5單克隆抗體，并用抗S1單克隆抗體作對照)進(jìn)一步證實(shí)各免疫反應(yīng)性B亞基多肽的存在。雖然亞基S2和S3和比例(用整合掃描光密度法對已染色的SDS-聚丙烯酰胺進(jìn)行檢測)與天然B寡聚體稍有不同，但這可解釋為存在過多的S2亞基(見上文所述)或從胎球蛋白-Sepharose親和樹脂上共洗脫的S3-S4二聚體。但顯然可通過致有絲分裂性實(shí)驗(yàn)證明分離的多聚體含有顯著量的五元B寡聚體(圖2);而B寡聚體和某些個(gè)別亞基及含有它的二聚體能夠使紅細(xì)胞聚集，且只有完整的B寡聚體是有促有絲分裂活性的。值得注意的是，不管個(gè)別蛋白質(zhì)亞基(S2、S3、S4和S5)的相對比例如何，本發(fā)明的重組B寡聚體終究不同于天然形式的B寡聚體，因其中它已具有了蛋氨酰一成熟的S4亞基。
然后使用一種估測百日咳疫苗之效能的標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測重組B寡聚體制劑在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中刺激毒素中和性免疫反應(yīng)的能力。這一試驗(yàn)方法是由FDA的D.L.Burns博士和J.L.Arciniega博士完成的。首先用確定劑量的天然或重組B寡聚體經(jīng)腹腔內(nèi)注射接種小鼠。免疫后兩周，小鼠放血以用ELISA方法檢測抗毒素抗體的濃度，然后再用致死量PT攻擊之;觀察動(dòng)物因毒素引起的死亡數(shù)，并在攻擊后4天估測所有動(dòng)物的毒素介導(dǎo)的白細(xì)胞增多。如表1的結(jié)果所證明的，對各免疫劑起反應(yīng)的小鼠均有明顯的抗毒素和毒素中和濃度，其中后者是根據(jù)對PT介導(dǎo)的CHO細(xì)胞簇集的減小作用測定的;另外，重組B寡聚體誘導(dǎo)的中和抗體滴度與使用天然B寡聚體作免疫原時(shí)觀察到的濃度相似。
表1免疫原aB寡聚體 PT 中和濕度c天然B寡聚體1°免疫4,8382,4782262°免疫223,66441,0851,810重組B寡聚體1°免疫12,0681,9331132°免疫144,81379,8342,506a、于室溫下，使已用含0.02%明膠的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-gel)稀釋的抗原經(jīng)1小時(shí)吸附到相當(dāng)于總蛋白質(zhì)(抗原加明膠)量的氫氧化鋁上，然后于4℃下對PBS透析以除去尿素和鹽。1組5只BALB/C雌性小鼠(14-16g)分別經(jīng)腹腔內(nèi)注射(i.p.)抗原(6μg)。29天后，放血并制備血清。第二天，再次對小鼠進(jìn)行免疫(2μg抗原/小鼠，i.p.)。14天后對小鼠放血并制備血清。
b、各數(shù)值是作為從各曲線之線性部分外推得到的x截距之反對數(shù)的例數(shù)計(jì)算的，其中所說的曲線為log10血清稀釋度對405nm處吸光率值作圖得到的;各數(shù)值代表了由5只小鼠的合并血清測得的結(jié)果。注射PBS-gel+Al(OH)3之小鼠的血清沒有表現(xiàn)出可測定的抗B寡聚體或PT滴度。
c、按已述方法(25)檢測血清中和百日咳毒素誘導(dǎo)之CHO細(xì)胞群集的能力。數(shù)值以代表全毒素中和CHO細(xì)胞群集活性的最大血清(合并的5只小鼠的血清)稀釋度的倒數(shù)表示。注射PBS-gel+Al(OH)3之小鼠的血清沒有顯示有可測定的中和抗體濃度。
試驗(yàn)的最小稀度為1∶20。
更重要的是，在用天然B寡聚體或用重組B寡聚體免疫的動(dòng)物中，所賦予的對抗PT之毒性作效應(yīng)的保護(hù)作用水平?jīng)]有明顯差異(圖3)。B寡聚體的個(gè)別亞基(6，22)和個(gè)別S2-S3或S3-S4二聚體(23)均不能引發(fā)對抗PT之白細(xì)胞增多促進(jìn)效應(yīng)的免疫保護(hù)作用。雖然最低劑量(0.1μg)重組材料的效力可能稍低于同等量天然B寡聚體的效力，但這種差異很可能是由于在對染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行整合光密度測定以確定重組B寡聚體之蛋白質(zhì)濃度時(shí)存在的準(zhǔn)確度差異所致。
本文中提出的結(jié)果證明了由重組DNA衍生的亞基產(chǎn)生復(fù)合異聚體蛋白質(zhì)的可行性。對于PT來說，現(xiàn)在有可能生產(chǎn)有高免疫原性的亞毒素分子形式。雖然可通過在其編碼順反子結(jié)構(gòu)中造成突變。使S1亞基結(jié)合B寡聚體的能力失活而在百日咳博德特氏菌中生產(chǎn)B寡聚體，但由該微生物產(chǎn)生的B寡聚體即使有也非常少(24)。也可以從天然毒素中純化B寡聚體，但這是一個(gè)花費(fèi)工作量很大的方法，且仍會造成含S1全毒素所致的可檢測的污染(9，19，25)。本發(fā)明的重組B寡聚體不僅由于缺失S1亞基而沒有其固有的毒性，面且因在制造過程中除去了病原生物體，所以還消除了污染其他百日咳博德特氏菌毒性成分的可能性(26，27)，而后者也可能是百日咳疫苗之不良反應(yīng)的原因。
可按常規(guī)方法將本發(fā)明的基因工程化改造的B寡聚體樣多聚體配成疫苗。在毒素已經(jīng)在“遺傳上”被失活的情況下，例如本發(fā)明的百日咳毒素，一般將不必使用其他滅活步驟(如化學(xué)處理或熱處理)，因?yàn)檫@些材料是在非致病性生物體中產(chǎn)生的，并且本來就沒有普扁認(rèn)為可引起對全細(xì)胞百日咳疫苗和末經(jīng)處理的(或沒有嚴(yán)格失活的)百日咳全毒素疫苗之不良反應(yīng)的S1相關(guān)酶活性。盡管如此，仍有必要控制重組產(chǎn)品的純度，特別是控制內(nèi)毒素含量。一般說來，本發(fā)明中描述的重組B亞基作為有潛在應(yīng)用價(jià)值的疫苗接種抗原，應(yīng)該純化到≥90%均質(zhì)性。如果有的話，應(yīng)該估價(jià)污染物的性質(zhì)及估測量，以保證內(nèi)毒素污染的程度符合各管理機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)。
為了進(jìn)行胃腸外途徑輸送，一般應(yīng)將疫苗材料吸附到鋁佐劑上。這至少可用兩種方法完成與初加工的明礬一起沉淀和與鋁鹽一起沉淀。然后將吸附的沉淀物懸浮在賦形劑中，以得到單劑濃度一般為每劑5-100μg，且氫氧化鋁量不超過每劑1.5mg的疫苗抗原;每劑體積一般在0.1-1.0ml范圍內(nèi)。懸浮賦形劑通常是緩沖溶液(如磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.0)，且可含有穩(wěn)定劑(如甘油)及防腐劑以防止微生物污染并延長有效儲存期。為了刺激分泌性粘膜免疫反應(yīng)，應(yīng)能使抗原運(yùn)送到粘模的淋巴組織。在這方面，可將疫苗材料制成腸溶膠囊或其他運(yùn)交載體，以防止在其到達(dá)道腸淋巴組織(如派伊爾氏淋巴集結(jié))之前被降解。在腸道中引發(fā)次級免疫反應(yīng)可完全地傳遞到其他粘膜起皺器官的固有層，特別是傳遞到呼吸道以預(yù)防百日咳。另外，可將疫苗產(chǎn)品加在適當(dāng)賦形劑和/或運(yùn)送載體(如脂質(zhì)體)中配成適于經(jīng)呼吸道、口或鼻給藥的氣霧劑或液體，這樣疫苗即可在支氣管中直接刺激次級免疫反應(yīng)或從口或鼻淋巴組織傳遞(如上所述)到呼吸道的固有層。
雖然已借助特定實(shí)例舉例說明了本發(fā)明，但應(yīng)明確的是，以能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方式作其他一些改動(dòng)和改變是可能的。本發(fā)明將包括屬于待批權(quán)利要求所限定之本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些改動(dòng)和改變。
參考文獻(xiàn)目錄1.Tamura，M.，etal.(1982)Biochemistry215516-5522.
2.Katada，T.，etal.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA793129-3133.
3.Bokoch，G.M.，etal.(1983)J.Biol.Chem.2582072-2075.
4.Katada，T.，etal.(1983)Arch.Biochem.Biophys.224290-298.
5.Ashworth，L.A.E.，etal.(1983)Lancetii878-881.
6.Burnette，W.N.，etal.(1988)Bio/Technology6699-706.
7.Cieplak，W.，etal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA854667-4671.
8.Burnette，W.N.，etal.(1988)Science24272-74.
9.Bartley，T.D.，etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA868353-8357.
10.Tamura，M.，etal.(1983)J.Biol.Chem.2586756-6761.
11.Sekura，R.D.，etal.(1985)inPertussistoxin(Sekura，R.D.，etal.，eds.)AcademicPress，Inc.，NewYork.PP.45-64.
12.Schmidt，M.A.，etal.(1989)Infect.Immun.573828-3833.
13.Witvliet，M.H.，etal.(1989)Infect.Immun.573324-3330.
14.Shahin，R.D.，etal.(1989)inVaccines89modernapproachestonewvaccinesincludingpreventionofAIDS(Lerner，R.A.，etal.，eds.)ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，Ny.PP.249-252.
15.Shahin，R.D.，etal.(1990)J.Esp.Med.17163-73.
16.Shahin，R.D.，etal.(1990)Infect.Immun.584063-4068.
17.Sekura，R.D.，etal.(1983)J.Biol.Chem.25814647-14651.
18.Laemmli，U.K.(1970)Nature227680-685.
19.Burns，D.L.，etal.(1987)Infect.Immun.5524-28.
20.Irons，L.I.，etal.(1979)Biochim.Biophys.Acta580175-185.
21.Nogimori，K.，etal.(1984)Biochim.Biophys.Acta801232-243.
22.Nicosia，A.，etal.(1987)Infect.Immun.55963-967.
23.Hausman，S.Z.，etal.(1989)Infect.Immun.571769-1764.
24.Pizza，M.，etal.(1990)J.Biol.Chem.26517759-17763.
25.Arciniega，J.L.，etal.(1987)Infect.Immun.551132-1136.
26.Weiss，A.A.，etal.(1986)Ann.Rev.Microbiol.40661-686.
27.Burnette，W.N.，etal.(1990)Bio/Technology81002-1005.
權(quán)利要求
1.包含亞基S2、S3、S4和S5的百日咳毒素B寡聚體樣多聚體蛋白質(zhì)，其中S4是蛋氨酰成熟多肽，或該多聚體的類似物或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的百日咳毒素B寡聚體樣多聚體蛋白質(zhì)，其中亞基S2、S3、S4和S5的化學(xué)計(jì)算的摩爾比例分別為大約1∶1∶2∶1。
3.抗百日咳疫苗，其包含有效量的權(quán)利要求1或2的百日咳毒素B寡聚體樣多聚體蛋白質(zhì)。
4.由重組亞基生產(chǎn)百日咳毒素B寡聚體樣多聚體蛋白質(zhì)的方法，該方法包括分別在異源表達(dá)宿主中表達(dá)亞基S2、S3、S4和S5的順反子成分，或其任何位點(diǎn)特異性密碼子取代或加入，并使重組亞基的混合物在體外結(jié)合，以形成具有誘導(dǎo)抗百日咳毒素免疫保護(hù)反應(yīng)之能力的亞基的多聚體合成物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中多聚體組份具有誘導(dǎo)抗百日咳疾病之免疫保護(hù)反應(yīng)的能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中個(gè)別S2、S3、S4和S5亞基是以任何化學(xué)計(jì)算量的摩爾比例混合的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中個(gè)別S2、S3、S4和S5亞基是以約為1∶1∶2∶1的化學(xué)計(jì)算的摩爾比混合的。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法其中混合物是在還原條件下溶解重組亞基S2、S3、S4和S5，然后再使之經(jīng)受氧化條件而形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中氧化劑是空氣和Cu2SO4。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中混合物是在增溶劑(Chaotrope)、去污劑或變性劑存在下形成的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中增溶劑/變性劑是鹽酸鈲。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中增溶劑/變性劑是尿素。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中在氧化后，降低增溶劑、去污劑或變性劑的濃度，或改變成另一種低濃度的增溶劑、去污劑或變性劑，以利于亞基折迭及使他們結(jié)合成多聚體蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中交換增溶劑/變性劑是鹽酸鈲。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中交換增溶劑/變性劑是尿素。
17.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中異源宿主是原核生物體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中原核宿主是大腸桿菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中重組S2、S3、S4和S5亞基是以包含體的形式從大腸桿菌中回收的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中重組亞基的多聚體合成物是用層析法純化的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中重組亞基的多聚體合成物是用親和層析法純化的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中重組亞基的多聚體合成物是用胎蛋白親和層析法純化的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中重組亞基的多聚體合成物是用結(jié)合珠蛋白親和層析法純化的。
全文摘要
可在抗百日咳疫苗中用作非反應(yīng)原性組分的基因工程化改造的百日咳毒素B寡聚體樣多聚體蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)是通過分別在異源宿主中表達(dá)亞基S2、S3、S4和S5的各自順反子成分、回收所得的亞基多肽，以及使之在體外結(jié)合以組裝成多聚體合成物而生產(chǎn)的。
文檔編號C07K14/235GK1067678SQ92104218
公開日1993年1月6日 申請日期1992年5月2日 優(yōu)先權(quán)日1991年5月3日
發(fā)明者W·N·伯內(nèi)特, V·L·馬爾 申請人:安姆根有限公司