專利名稱：：含全細胞百日咳抗原的組合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于組合疫苗領(lǐng)域，所述組合疫苗是含有來自一種以上病原體的免疫原混合物的疫苗，因此，給予這種疫苗可使對象同時獲得對一種以上病原體的免疫力。
背景技術(shù)：
：組合疫苗對患者的益處在于能減少注射次數(shù)，從而帶來順應性提高的臨床優(yōu)勢(例如參見參考文獻1的第29章)。具體涉及的(尤其是在兒童中)六種病原體是白喉棒狀桿菌(Coo^eZ^"en'wma^/^en'ae)(造成白喉)、破傷風梭菌(C/oWnWwm(造成破傷風/牙關(guān)緊閉癥)、百日咳博德特氏菌(50^她/&;er加^)(百日咳)、乙肝病毒('HepB'，病毒性肝炎)、b型流感嗜血桿菌0f/flemo/7/n7z^^/7wew^e)('Hib，，造成細菌性腦膜炎和肺炎)和腦膜炎奈瑟氏球菌C/Vehen'amem'Mg/^fo)(腦膜炎球菌性腦膜炎和敗血病)。抵抗這些病原體中每一種的疫苗是己知的，包含'D'、'T'、'P'、'HepB'和'Hib'組分的所有五種以同時組合給藥的五價疫苗由GlaxoSmkhKline銷售，其商品名為TRITANRIX-HepB/Hib。這種五價疫苗中的'P'組分基于全細胞百日咳('Pw')抗原。該疫苗中的DTP和HepB組分是裝在藥瓶中的混合溶液(這種四價DTPw-HepB組合物作為'TRITANRIX-HepB'產(chǎn)品單獨銷售)，但Hib組分被凍干并裝在單獨的藥瓶中。DTPw-HepB溶液被用來在使用時重建Hib組分，從而在藥瓶中臨時形成五價疫苗。TRITANRIX-HepB/Hib不能抵抗腦膜炎球菌感染。參考文獻2的實施例3公開了人臨床試驗的結(jié)果，其中將四價TRITANRLX-HepB產(chǎn)品與來自Hib和來自腦膜炎球菌血清組A禾PC('MenA'和'MenC')的偶聯(lián)的莢膜糖臨時混合。作者稱這種七價混合物誘導了抗每種抗原的良好免疫應答并被嬰兒良好耐受。未給出關(guān)于Hib、MenA和MenC組分的全部細節(jié)。參考文獻3和4也報道了類似的信息。本發(fā)明的一個目的是提供進一步的并改進的組合疫苗以抵抗所有六種白喉棒狀桿菌、破傷風梭菌、百日咳博德特氏菌、乙肝病毒、b型流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟氏球菌。發(fā)明概述本發(fā)明基于對包含D-T-Pw-HepB-Hib抗原(TRJTANRIX-HepB/Hib產(chǎn)品也含有該抗原)且同時包含一種或多種腦膜炎球菌偶聯(lián)物抗原的疫苗的研究。已經(jīng)公開了關(guān)于這些疫苗的許多改進和變化，這些是本發(fā)明的主題。本發(fā)明的疫苗包含(i)白喉類毒素'D';(ii)破傷風類毒素'T';(iii)細胞百日咳抗原'wP';(iv)乙肝病毒表面抗原'HBsAg';(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖；(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖。所述腦膜炎球菌糖類可來自血清組A、C、W135和Y中的一種或多種。這四種血清組通常被稱為'MenA，、'MenC，、'MenW135，禾口'MenY，。偶聯(lián)抗原在文中通常被稱為'MenA-X'等，其中'X'表示偶聯(lián)物的載體蛋白。含有特定載體蛋白的偶聯(lián)物則被稱為'MenA-CRM'或'MenC-D'等。優(yōu)選的疫苗含有至少血清組C的，優(yōu)選同時含有血清組A和C的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。因此，優(yōu)選的疫苗是六價的(D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenC)或七價的(D陽T-Pw-HBsAg-Hib-MenA隱MenC)。除了上述抗原(i)-(vi)，也可存在其它抗原以產(chǎn)生例如8價、9價、IO價等疫苗。本發(fā)明的疫苗在制造時可被制成液體形式(即所有抗原都含在水性溶液或懸浮液中)，或者可在使用時將以下兩種組分混合在一起而臨時制備(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物的第二組分。這兩種組分優(yōu)選裝在分開的容器中(例如藥瓶和/或注射器)，本發(fā)明提供了包含組分(a)和(b)的試劑盒。第一容器的內(nèi)容物優(yōu)選為水性的，第二容器的內(nèi)容物優(yōu)選為凍干的，從而可通過用水性D-T-wP-HBsAg組分重建凍干組分來制備本發(fā)明的疫苗。r"歷6錄微艘就Hib偶聯(lián)物是熟知的，但它們可以有各種形式。例如，參考文獻l的表14-7給出了四種不同Hib偶聯(lián)物的特性。該表稱，糖:載體的重量比在'PRP-D'的1.4:1凍過量)和'PRP-OMP，的0.06:1(蛋白質(zhì)過量)之間變化。所有這些偶聯(lián)物都曾用于組合疫苗，但本發(fā)明的一個方面選擇特定的重量比范圍用于含有腦膜炎球菌偶聯(lián)物的組合疫苗。曾報道Hib偶聯(lián)物中載體蛋白與糖類的重量比在組合疫苗的功效中具有重要作用。根據(jù)參考文獻5，在載體蛋白也作為抗原的組合疫苗(例如，如本發(fā)明中一樣，破傷風類毒素被同時用作載體和抗原)中，Hib偶聯(lián)物應當具有1:0.3和1:2之間的糖:載體重量比。相反，根據(jù)本發(fā)明，糖與載體的重量比可超過該范圍，并在1:2和1:4之間。在組合兒科疫苗中，該范圍內(nèi)的Hib偶聯(lián)物當與腦膜炎球菌偶聯(lián)物組合時顯示出極好的免疫原性且不會造成任何免疫干擾，即便該載體蛋白還以游離抗原存在(例如，當載體蛋白是破傷風類毒素或白喉類毒素時)。實際上，過量的載體蛋白有助于提供對例如破傷風或白喉的免疫力。因此，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其特征在于，上述流感嗜血桿菌偶聯(lián)物具有超過糖重量的載體，且其中載體與糖的重量比在2:1禾P4:1之間。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(ii)破傷風類毒素('T')，(iii)細胞百日咳抗原('Pw'),(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分，其中，所述流感嗜血桿菌偶聯(lián)物具有超過糖重量的載體，且載體與糖的重量比在2:1和4:1之間；和(c)將D-T-Pw-HBsAg組分與偶聯(lián)物組分混合以得到組合疫苗。Hib偶聯(lián)物具有重量過量的載體蛋白。其重量比在2:1和4:1之間，且優(yōu)選在2.5:1禾口3.5:1之間?？刹捎?.8:1和3.2:1之間的重量比，優(yōu)選重量比約為3:1。因此在典型的10)ig(以糖測量)劑量中，本發(fā)明的組合物將含有20-40嗎載體，優(yōu)選約30昭。這種比例與參考文獻5的教導完全相反。Hib偶聯(lián)物的載體蛋白優(yōu)選為破傷風類毒素，因此對于IO嗎Hib糖類而言，該組合物可包含20-40嗎來自ffib偶聯(lián)物的破傷風類毒素再加上作為'T'抗原的破傷風類毒素，以抵抗破傷風梭菌感染。優(yōu)選的組合物和方法采用來自血清組C的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。更優(yōu)選的組合物和方法采用來自血清組A和C的不同的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。它們優(yōu)選偶聯(lián)到流感嗜血桿菌D蛋白載體，但它們也可偶聯(lián)到破傷風類毒素載體、白喉類毒素載體或CRM197載體。②柳微激槽載維遂麥如參考文獻1的表14-7所示，采用了各種不同的連接化學性質(zhì)來制造Hib偶聯(lián)物。一些偶聯(lián)物是通過活化糖類形成的，一些是通過活化載體形成的，而一些是通過活化這兩者形成的。對于糖類活化，在'HbOC'產(chǎn)品中使用高碘酸鹽(periodiate)和氰基硼酸鹽(cyanoborohydrate)，在'TRP-T，產(chǎn)品中使用ADH、CNB和鹽酸碳二亞胺。所有這些偶聯(lián)物都已被用于組合疫苗，但本發(fā)明的一個方面選擇特定類型的連接用于含有腦膜炎球菌偶聯(lián)物的組合疫苗。根據(jù)本發(fā)明，多糖可首先用溴化氰活化，然后偶聯(lián)到己二酸接頭上，然后使這種接頭-糖部分與載體蛋白、尤其是與破傷風類毒素載體蛋白反應。第一個步驟涉及Hib糖類上的游離-OH基團的氰化，如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>該反應是用溴化氰(CNBr)完成的。簡言之，使CNBr在酸性條件(通常為pH10-12)下與糖反應。在這種高pH下，形成了帶有糖的羥基的氰酸酯。這種高pH使羥基電離從而對氰酸根離子上的羥基離子發(fā)動親核攻擊。由于這種高pH，可發(fā)生各種副反應，但只有氰酸酯形成是本發(fā)明的目的。使氰酸酯與雙官能試劑(異雙官能試劑或者優(yōu)選同雙官能試劑)反應以提供連接載體的間隔物。根據(jù)本發(fā)明，可采用己二酸酰肼間隔物。這通常可用己二酸二酰肼(AADH)實現(xiàn)AADH與氰酸酯的反應(形成亞氨氨基甲酸酯(imidocarbamate)連接)的機制如下所示:活化的糖然后在存在EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)時與破傷風類毒素載體反應EDAC通常以其鹽酸鹽的形式使用(CH3)2N(CH;.)3-N=C=N-CH2CH3.HCIEDAC使己二酸接頭游離端的羧基與載體蛋白(通常是氨基酸側(cè)鏈上的游離-SH、-NH2或-OH)反應形成如下所示的偶聯(lián)物，其中-X-是源于載體的-S-、-O-或-NH-:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>在含水條件下，C二NH可轉(zhuǎn)化成C二O以得到氨基甲酸酯因此，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其特征在于，流感嗜血桿菌偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)用溴化氰活化b型流感嗜血桿菌莢膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入已二酸酰肼間隔物以得到活化的糖；和(C)通過碳二亞胺縮合將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(V)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(Vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其特征在于，(V)的流感嗜血桿菌偶聯(lián)物包含具有以下兩種結(jié)構(gòu)之一的接頭<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中，-X-選自-O-、-S-或-NH-。優(yōu)選氨基甲酸酯。Hib偶聯(lián)物的載體蛋白優(yōu)選為破傷風類毒素。優(yōu)選的組合物和方法采用來自血清組C的腦膜炎球菌偶聯(lián)物，更優(yōu)選的組合物和方法采用來自血清組A和C的不同的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。它們優(yōu)選偶聯(lián)到流感嗜血桿菌D蛋白載體。Hib、MenA和MenC偶聯(lián)物的混合物可與其它疫苗混合使用或者將其本身作為疫苗使用。因此，本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物混合物，其中包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，所示流感嗜血桿菌偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)用溴化氰活化b型流感嗜血桿菌莢膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入已二酸酰肼間隔物以得到活化的糖；和(c)通過碳二亞胺縮合將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物混合物，其中包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，(i)的流感嗜血桿菌偶聯(lián)物包含具有以下兩種結(jié)構(gòu)之一的接頭其中，-X-選自-O-、-S-或-NH陽。優(yōu)選氨基甲酸酯。"蘼淑麟錄疑腫直麥麟體雜麥上述Hib偶聯(lián)物通過間隔物連接到載體蛋白。相反，在腦膜炎球菌偶聯(lián)物中優(yōu)選采用直接連接。已發(fā)現(xiàn)直接連接特別適合于腦膜炎球菌偶聯(lián)物，尤其是將D蛋白用作載體且Hib偶聯(lián)物不釆用直接連接時(以避免接頭越過其可能產(chǎn)生免疫原性的任何可能極限)。在直接連接情況中，腦膜炎球菌糖類中的-OH基團首先被氰化(例如，如上所述)以得到氰酸酯。-OCN基團然后被用來直接連接到載體中的側(cè)鏈，如游離的-NH2基團、游離-SH基團或游離的-OH基團。優(yōu)選連接賴氨酸側(cè)鏈中的游離-NH2。直接連接的機制可如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>這種反應的偶聯(lián)產(chǎn)物可如下所示在含水條件下，C=NH可被轉(zhuǎn)化成C=0以得到氨基甲酸酯:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>除了使用溴化氰作為氰化劑，氰化反應優(yōu)選使用有機氰化試劑如l-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶鎵試劑('CDAP')進行。有機氰化試劑可選自以下l-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶鏡四氟硼酸鹽、對-硝基苯基氰酸鹽('pNPC，)和N-氰基三乙基-銨四氟硼酸鹽('CTEA')。使用這些試劑意味著活化反應可在中性pH下進行，這有助于保持多糖的穩(wěn)定性和完整性。具體地說，這有助于保留-Oac基團(見下文)。在優(yōu)選的方法中，所述氰化試劑在pH6-8時在非親核緩沖液如鹽水、HEPES、磷酸鹽、水和一些有機溶劑中使用[6]。CDAP可溶于乙腈并加入糖的水溶液中。偶聯(lián)后，可加入甘氨酸終止反應，甘氨酸能封閉任何未反應的氰酸根。就腦膜炎球菌血清組A偶聯(lián)物而言，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，其特征在于，血清組A偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組A的莢膜糖以得到氰酸酯；和(b)將氰酸酯直接偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體。該疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，血清組A偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組A的莢膜糖以得到氰酸酯；和(b)將氰酸酯直接偶聯(lián)到載體蛋白。就腦膜炎球菌血清組C偶聯(lián)物而言，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，血清組C偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組C的莢膜糖以得到氰酸酯；和(b)將氰酸酯直接偶聯(lián)到載體蛋白。該疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，血清組C偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組C的莢膜糖以得到氰酸酯；和(b)將氰酸酯直接偶聯(lián)到載體蛋白。本發(fā)明還提供了疫苗和方法，其中，血清組A和血清組C的偶聯(lián)物都是用這種方法制備的，然后將它們混合。也可加入Hib偶聯(lián)物以得到含有Hib、MenA和MenC中所有三種的偶聯(lián)物混合物。wA塘資c錄凝激效0-z;鷹眾腦膜炎球菌血清組C的莢膜糖是一種a2—9-連接的唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸)的均聚物，其在C-7或C-8殘基上通常具有O-乙酰(OAc)基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>一些MenC菌株(約占侵襲性分離物的12%)產(chǎn)生缺乏這種Oac基團的多糖。Oac基團的存在或不存在產(chǎn)生獨特表位，且抗體結(jié)合糖類的特異性可影響其抗O-乙?；?OAc-)和脫-0-乙?；?OAc+)菌株的殺菌活性[7-9]。批準的MenC偶聯(lián)物疫苗包含OAc墨(NeisVac-CTM)和OAc+(Menjugate丁M和Meningitec丁M)糖類。根據(jù)本發(fā)明，可使用OAc+或OAc-菌株。因此，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg')，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，(vi)的血清組C的莢膜糖中至少50。/。的唾液酸殘基在C-7或C-8位被0-乙酰化。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，血清組C的莢膜糖來自O(shè)Ac+菌株。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg')，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，(vii)的血清組C的莢膜糖中的唾液酸殘基未被O-乙?；?。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，血清組C的莢膜糖來自O(shè)Ac-菌株。這些疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(ii)破傷風類毒素('T，)，(iii)細胞百日咳抗原(Tw')，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物和腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分，其中，(vii)的血清組C的莢膜糖中至少50%的唾液酸殘基在C-7或C-8位被O-乙?；?。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(ii)破傷風類毒素('T，)，(iii)細胞百日咳抗原(Tw，)，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分，其中，(vii)的血清組C的莢膜糖中的唾液酸殘基未被O-乙酰化。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(ii)破傷風類毒素('T，)，(iii)細胞百日咳抗原('Pw')，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg')，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分，其中，血清組C的莢膜糖來自O(shè)Ac-菌株。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(ii)破傷風類毒素('T，)，(iii)細胞百日咳抗原('Pw')，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg')，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分，其中，血清組C的莢膜糖來自O(shè)Ac+菌株。用這些方法制備的疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物混合物，其中包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iiiM禺聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，MenC偶聯(lián)物中的唾液酸殘基未被O-乙?；?。本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物混合物，其中包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，MenC莢膜糖來自O(shè)Ac-菌株。本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物混合物，其中包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，MenC偶聯(lián)物中至少50%的唾液酸殘基在C-7或C-8位被O-乙?；?。本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物混合物，其中包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，MenC莢膜糖來自O(shè)Ac+菌株。其中，血清組C偶聯(lián)物中至少50%的唾液酸殘基被O-乙?；撟畹桶俜直瓤梢暂^高，例如為60%、70%、80%、90%或更高。優(yōu)選的制造血清組C偶聯(lián)物的菌株是OAc+菌株，優(yōu)選血清型16，優(yōu)選血清亞型P1.7a,1。因此優(yōu)選C:16:P1.7a,1OAc+菌株。③^塘資^像就激游O-乙廣眾腦膜炎球菌血清組A的莢膜糖是al—6連接的N-乙酰-甘露糖胺-磷酸的均聚物，其在C-3和C-4位被部分O-乙?；?lt;formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>R=-H或-COCH:C-3位的乙?；筛哌_70-95%。用來純化糖的條件可導致脫-O-乙?；?例如，在堿性條件下)，但本發(fā)明試圖保留OAc。因此，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg')，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，其特征在于，血清組A的莢膜糖中至少50。/。的甘露糖胺殘基在C-3位被O-乙酰化。該疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(ii)破傷風類毒素('T，)，(iii)細胞百日咳抗原('Pw，)，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分，其中，血清組A的莢膜糖中至少50%的甘露糖胺殘基在C-3位被O-乙酰化。通過該方法制造的疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種偶聯(lián)物混合物，其中包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，血清組A的莢膜糖中至少50%的甘露糖胺殘基在C-3位被O-乙酰化。其中，血清組A偶聯(lián)物中至少50。/。的甘露糖胺殘基被O-乙?；?，該最低百分比可以較高，例如為60%、70%、80%、90%或更高。W錄微爐Hib-偶聯(lián)抗原的制造并不便宜，已經(jīng)開發(fā)了各種節(jié)省其用量的策略[10-12]。一種方法是以低于標準10pg/劑的劑量給予兩劑偶聯(lián)物(通常的比例為，例如，'/2、％、^等)[10,12]。例如，在參考文獻12中，以5嗎/劑或3.33嗎/劑，即正常劑量的'/2或'/3，給予Hib-偶聯(lián)物。相同的方法己用于DTP-Hib疫苗中的Hib-偶聯(lián)物。例如，參考文獻13比較了與DTwP疫苗組合使用全劑量、半劑量和三分之一劑量的Hib-偶聯(lián)物，盡管與單獨給予DTP和Hib相比，接受組合DTP-Hib疫苗的患者中抗-PRP抗體的幾何平均濃度降低，但在所有病例中都觀察到可接受的保護性抗-Hib免疫應答。參考文獻14使用了通過用10劑量瓶DTwP重建單劑Hib得到的稀釋10倍的Hib-偶聯(lián)物劑量。參考文獻2披露了用TRITANREKtmDTwP-HbsAg疫苗重建全劑量、半劑量或四分之一劑量的凍干Hib-偶聯(lián)物。未報道對組合疫苗中的腦膜炎球菌偶聯(lián)物進行過類似的劑量研究。對于本發(fā)明的組合疫苗，選擇的Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物的量為8-12(ig(以糖測量)。該量可存在于單一單位劑量中，或者可存在于每毫升疫苗中。因此，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其特征在于，該疫苗含有8-12pg/mlb型流感嗜血桿菌莢膜糖。優(yōu)選的同時包含血清組A和C的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，其特征在于，該疫苗含有8-12pg/ml腦膜炎球菌血清組A的莢膜糖。該疫苗優(yōu)選還包含(Vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(V)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該疫苗含有8-12jig/ml腦膜炎球菌血清組C的莢膜糖。該疫苗優(yōu)選還包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖。本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其特征在于，該疫苗含有8-12Mgb型流感嗜血桿菌莢膜糖/單位劑量。優(yōu)選同時包含血清組A和C的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，其特征在于，該疫苗含有8-12嗎腦膜炎球菌血清組A的莢膜糖/單位劑量。該疫苗優(yōu)選還包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該疫苗含有8-12嗎腦膜炎球菌血清組C的莢膜糖/單位劑量。該疫苗優(yōu)選還包含(Wi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖。對所有三種Hib、MenA和MenC偶聯(lián)物而言，優(yōu)選疫苗的糖劑量為8-12嗎(每毫升或每單位劑量)。0織錄欲艦,餅膽如上所述，本發(fā)明的疫苗可在使用時將以下兩種組分混合在一起而臨時制備(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含Hib偶聯(lián)物和至少一種腦膜炎球菌偶聯(lián)物的第二組分。這兩種組分宜單獨包裝，因此，通常本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含Hib偶聯(lián)物和至少一種腦膜炎球菌偶聯(lián)物的第二組分。該方法避免了在含水儲存條件下可能發(fā)生的偶聯(lián)物的解聚，而解聚是Hib和MenA偶聯(lián)物的特殊問題，尤其是當其組合時。(a)和(b)兩種組分被單獨包裝在例如分開的藥瓶中。第一個藥瓶(裝有D-T-wP-HBsAg)的內(nèi)容物優(yōu)選為水性的，而第二個藥瓶(裝有偶聯(lián)物)的內(nèi)容物優(yōu)選是凍干的，從而可通過用水性組分重建凍干組分來制備本發(fā)明的疫苗。因此，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明的疫苗組合物的方法，該方法包括以下步驟(a)以含水形式提供包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；(b)以凍干形式提供包含Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物的第二組分；和(C)將第一和第二組分混合以得到疫苗?；旌喜襟E通常在使用時發(fā)生。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(a)獲得或制備包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；(b)獲得或制備包含Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物的第二組分；和(C)將這兩種組分組合成試劑盒的形式。更具體地說，本發(fā)明提供了-一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分，其特征在于，流感嗜血桿菌偶聯(lián)物具有超過糖重量的載體，且載體與糖的重量比在2:1和4:1之間。-一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(a)制備包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；(b)制備包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分，其特征在于，流感嗜血桿菌偶聯(lián)物具有超過糖重量的載體，且載體蛋白與糖的重量比在2:1和4:1之間；和(c)將這兩種組分組合成試劑盒的形式。-一種試劑盒，其中裝有(i)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；禾口(ii)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分，其特征在于，流感嗜血桿菌偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)用溴化氰活化b型流感嗜血桿菌莢膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入已二酸酰肼間隔物以得到活化的糖；和(C)通過碳二亞胺縮合將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。-一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分，其特征在于，流感嗜血桿菌偶聯(lián)物包含具有以下兩種結(jié)構(gòu)之一的接頭:o其中，-X-選自-O-、-S-或-NH-?！环N制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(i)制備包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；(ii)制備包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分；和(iii)將這兩種組分組合成試劑盒的形式，其特征在于，流感嗜血桿菌偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)用溴化氰活化b型流感嗜血桿菌莢膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入已二酸酰肼間隔物以得到活化的糖；和(c)通過碳二亞胺縮合將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(a)制備包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；(b)制備包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分；和(c)將這兩種組分組合成試劑盒的形式，其特征在于，流感嗜血桿菌偶聯(lián)物包含具有以下兩種結(jié)構(gòu)之一的接頭o其中，-X-選自-O-、-S-或-NH-。-一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(i)制備包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；(ii)制備包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組A的莢膜糖以得到氰酸酯；和(b)將氰酸酯直接偶聯(lián)到載體蛋白。-一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(a)制備包含D、T、WP和HBsAg抗原的第一組分；(b)制備包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組c的莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組C的莢膜糖以得到氰酸酯；和(b)將氰酸酯直接偶聯(lián)到載體蛋白。-一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(i)制備包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；問制備包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組A的莢膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯與雙官能接頭反應以得到活化的糖；和(c)將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。-一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(i)制備包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；(ii)制備包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組c的莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組C的莢膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯與雙官能接頭反應以得到活化的糖；和(c)將活化的糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體。-一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；禾口(b)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組c的莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組c偶聯(lián)物中至少50%的唾液酸殘基在C-7或C-8位被O-乙?；?。-一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C偶聯(lián)物中的唾液酸殘基未被O-乙?；?。-一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖來自O(shè)Ac+菌株。-一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組c的莢膜糖的第二組分，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌血清組c的莢膜糖來自O(shè)Ac-菌株。-一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分;禾口(b)包含偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖的第二組分，其特征在于，血清組A的莢膜糖中至少50%的甘露糖胺殘基在C-3位被0-乙?；?。-一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到第一試劑盒組分；和(b)將偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖、偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖和偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖組合以得到第二試劑盒組分。優(yōu)選通過混合DTPw組分和HBsAg組分來制造試劑盒的第一組分。試劑盒的第二組分優(yōu)選為包含以下組分的三價偶聯(lián)物組分(l)偶聯(lián)到載體蛋白的流感嗜血桿菌的莢膜糖；(2)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖；和(3)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖。^織本發(fā)猶度認方法優(yōu)選的本發(fā)明七價疫苗包含以下七種抗原性組分D、T、Pw、HbsAg、Hib-X、MenA-X和MenC-X。盡管原則上可以任何順序?qū)⑺鼈兓旌?，但如上所述，特別優(yōu)選的是制備第一組分(含D、T、Pw和HBsAg抗原)和第二組分(含Hib、MenA和MenC偶聯(lián)物)并在使用時合并這兩種組分。此外，優(yōu)選將D-T-Pw組分與HBsAg組分混合以制備D-T-Pw-HBsAg組分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種混合順序(即在已有的DTPw混合物中加入HBsAg，而不是在加入D、T或Pw抗原之前加入HBsAg)對于制造組合疫苗尤其是疫苗的各組分被吸附到鋁鹽上的疫苗特別有用。這不同于參考文獻15所披露的先制備D-T-HbsAg混合物然后再加入Pw原液的混合順序。這也不同于參考文獻16所披露的將Pw-HbsAg混合物與D-T混合物合并的混合順序。因此，本發(fā)明提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(ii)破傷風類毒素('T，)，(iii)細胞百日咳抗原('Pw，)，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖('Hib-X，)，(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖('MenA-X，)，和(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖('MenC-X，)，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將Hib偶聯(lián)物與至少一種腦膜炎球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分；和(c)將四價D-T-Pw-HBsAg組分與混合的偶聯(lián)物組分混合以得到組合疫苗。所述三價D-T-Pw組分優(yōu)選包含磷酸鋁佐劑和/或氫氧化鋁佐劑。更優(yōu)選地，其同時包含磷酸鋁佐劑和氫氧化鋁佐劑。所述單價HBsAg組分優(yōu)選被吸附到磷酸鋁佐劑[17]。D和T類毒素優(yōu)選被吸附到氫氧化鋁佐劑。所述混合的偶聯(lián)物組分優(yōu)選包含來自Hib和MenA、Hib和MenC或者Hib與MenA及MenC的偶聯(lián)物。與諸如INFANRIXHEXAtm的疫苗不同，該疫苗優(yōu)選不將偶聯(lián)物組分中三種偶聯(lián)物中的任何一種吸附到鋁鹽[2]，且更優(yōu)選偶聯(lián)物組分不含鋁鹽。最優(yōu)選的偶聯(lián)物組分未經(jīng)佐劑處理。然而，它們可含有糖，如乳糖和/或蔗糖。所述四價D-T-Pw-HBsAg組分優(yōu)選為水性形式，所述三價偶聯(lián)物組分優(yōu)選為凍干形式，以便在步驟(c)中用水性D-T-Pw-HBsAg組分重建。為制造四價D-T-Pw-HBsAg組分，所述D-T-Pw和HBsAg組分在混合時優(yōu)選為水性形式。為制備三價偶聯(lián)物組分，可以任何順序混合三種偶聯(lián)物，例如，一起加入所有三種偶聯(lián)物或者先混合兩種(例如，MenA+MenC、MenA+Hib、MenC+Hib)然后再加入第三種。W微*除了包含抗原，本發(fā)明的疫苗通常包含至少一種鋁鹽佐劑。所述疫苗可同時包含氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。本發(fā)明提供了一種試劑盒，其中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原并包含氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑的第一組分；和(b)包含(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和(ii)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的第二組分。在第一組分中，HbsAg優(yōu)選被吸附到磷酸鋁佐劑。D和T類毒素優(yōu)選被吸附到氫氧化鋁佐劑。優(yōu)選通過混合DTPw組分與HBsAg組分來制造第一組分。DTPw組分優(yōu)選同時包含氫氧化鋁和磷酸鋁。HBsAg組分優(yōu)選含有磷酸鋁。在第二組分中，優(yōu)選沒有偶聯(lián)物被吸附到鋁鹽，更優(yōu)選第二組分不含鋁鹽。最優(yōu)選的第二組分是未經(jīng)佐劑處理的。然而，它們可含有糖，如乳糖或者優(yōu)選蔗糖。第一組分優(yōu)選為水性形式，第二組分優(yōu)選為凍干形式。因此，第一組分可用來重建第二組分以得到本發(fā)明的疫苗。(7"i篪炎承葳錄凝激^伊l/《腐激游教體瀞遂麥上述Hib偶聯(lián)物通過間隔物連接到載體蛋白。間隔物也可用于腦膜炎球菌偶聯(lián)物，但優(yōu)選直接連接(見上文)。當與氰化反應組合使用間隔物時，一般方案是如上所述制備氰酸酯。然后與雙官能接頭(優(yōu)選同雙官能接頭)中的一個官能團反應以活化該酯，而保留其他官能團以連接載體。因此，本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg')，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，其特征在于，(vi)的血清組A偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組A的莢膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯與雙官能接頭反應以得到活化的糖；和(c)將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。該疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，血清組A偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組A的莢膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯與雙官能接頭反應以得到活化的糖；禾n(c)將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。本發(fā)明提供了一種組合疫苗，其中包含(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，和(vi)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，(vii)的血清組C偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組C的莢膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯與雙官能接頭反應以得到活化的糖；和(c)將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。該疫苗還可包含(vii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，(iii)的血清組C偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)氰化血清組C的莢膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯與雙官能接頭反應以得到活化的糖；和(C)將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。本發(fā)明還提供了疫苗和方法，其中，血清組A和血清組C偶聯(lián)物都用這種方式制備，然后合并。可使用任何合適的雙官能接頭，只要其中的一個官能團能共價結(jié)合氰化腦膜炎球菌糖類而另一個官能團能連接載體即可。這兩個官能團可以是相同的(即同雙官能接頭)或者它們可以是不同的(即異雙官能接頭)，這取決于需要連接的基團。(7"似艦鄉(xiāng)旅疫苗通常含有防腐劑以防止有害微生物生長。在通過混合各種組分形成的組合疫苗中，熟練的技術(shù)人員必須選擇何時在何處加入防腐劑。根據(jù)本發(fā)明，不同的組分含有不同的防腐劑。因此，本發(fā)明提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D')，(ii)破傷風類毒素('T')，(iii)細胞百日咳抗原('Tw，)，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg')，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，和(vii)汞防腐劑，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分，其中，所述D-T-Pw組分還含有防腐劑；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分；和(c)將D-T-Pw-HBsAg組分與混合的偶聯(lián)物組分混合以得到組合疫苗。本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合，其中，所述D-T-Pw組分含有汞防腐劑以得到第一試劑盒組分；和(b)將偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖與至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖組合以得到第二試劑盒組分。這些方法中的步驟(a)也可以是，可通過混合(i)三價D-T-Pw組分、(ii)HbsAg和(iii)單獨的防腐劑以制備第一試劑盒組分，其中，(ii)中不含(iii)的防腐劑。所述汞防腐劑可以是乙基汞硫代水楊酸鈉(也稱為硫汞柳酸鈉或硫柳汞)或timerfonate。混合的偶聯(lián)物組分(以及第二試劑盒組分)可以含或不含防腐劑。優(yōu)選不含防腐劑。單價HBsAg組分可以含或不含防腐劑。如果已經(jīng)使用了汞防腐劑，則在用純化的HbsAg制造組合疫苗之前可進行透析(例如用半胱氨酸)[18]?；旌系呐悸?lián)物組分優(yōu)選含有Hib偶聯(lián)物、MenA偶聯(lián)物和MenC偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的組合疫苗的方法(i)白喉類毒素('D，)，(D)破傷風類毒素('T')，(in)細胞百日咳抗原('Pw')，(iv)乙肝病毒表面抗原('HBsAg，)，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，和(vii)2-苯氧乙醇防腐劑，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分，其中，所述D-T-Pw組分不含2-苯氧乙醇；(b)將流感嗜血桿菌偶聯(lián)物與腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分；和(c)將D-T-Pw-HBsAg組分與混合的偶聯(lián)物組分混合以得到組合疫苗。本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明的試劑盒的方法，其包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合，其中，所述D-T-Pw組分不含2-苯氧乙醇防腐劑以得到第一試劑盒組分；和(b)將偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖與至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖組合以得到第二試劑盒組分。這些方法中的步驟(a)也可以是，可通過混合(i)三價D-T-Pw組分、(ii)HbsAg和(iii傳獨的2-苯氧乙醇防腐劑以制備第一試劑盒組分，其中，(i)中不含(iii)的防腐劑?；旌系呐悸?lián)物組分(以及第二試劑盒組分)可以含或不含2-苯氧乙醇防腐劑。優(yōu)選不含防腐劑。單價HBsAg組分可以含或不含2-苯氧乙醇防腐劑。(72>餘去錄凝欽護游染處偶聯(lián)化學不總是精確或化學計量的，可以產(chǎn)生最終疫苗產(chǎn)品不需要的副產(chǎn)品。本發(fā)明提供了當制備混合的偶聯(lián)物組分時測定或除去這些副產(chǎn)品的方法。該組分可用來制造本發(fā)明的疫苗或作為本發(fā)明試劑盒的組分。本發(fā)明提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(m)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組c的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)用EDAC將Hib莢膜糖偶聯(lián)到破傷風類毒素，然后除去EDU;(b)用CDAP試劑將MenA莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體，然后除去DMAP;(c)用CDAP試劑將MenC莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體，然后除去DMAP;和(d)混合步驟(a)的Hib偶聯(lián)物、步驟(b)的MenA偶聯(lián)物和步驟(c)的MenC偶聯(lián)物以得到偶聯(lián)物混合物。在混合步驟之后，偶聯(lián)物混合物可被凍千例如以得到用于本發(fā)明的試劑盒的組分。在凍干之前，三價組分的pH可被降至例如6.0士0.5的范圍內(nèi)或約6.1。'EDAC'是l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙萄碳二亞胺，這是一種水溶性碳二亞胺，曾被用來交聯(lián)含有羧酸和伯胺的生物物質(zhì)(見上文)。它通常以鹽酸鹽使用。'EDU'是N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)脲，它是EDAC偶聯(lián)的可溶性反應產(chǎn)物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>偶聯(lián)反應之后可用稀酸或水洗滌以除去EDU和過量的EDAC[19]。'CDAP'試劑包含1-氰基-4-(二甲基氨萄-吡啶鈸基團并被用作氰化試劑。它們優(yōu)選以四氟硼酸鹽的形式使用<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>'DMAP'是4-二甲基氨基-吡啶，是CDAP氰化反應的一種反應產(chǎn)物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>DMAP可通過凝膠過濾、凝膠滲透層析等方法除去。凝膠滲透層析柱可用來在一次運行中分離偶聯(lián)物、未反應的載體、未反應的糖、未反應的CDAP、未反應的甘氨酸和DMAP，從而得到純化的偶聯(lián)物。偶聯(lián)反應可使用接頭等，如上所述(例如，使用已二酸酰肼間隔物以制備Hib-T)。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)用EDAC將Hib莢膜糖偶聯(lián)到載體蛋白；(b)用CDAP試劑將MenA莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體；(c)用CDAP試劑將MenC莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體；(d)混合步驟(a)的Hib偶聯(lián)物、步驟(b)的MenA偶聯(lián)物和步驟(c)的MenC偶聯(lián)物以得到偶聯(lián)物混合物；和(e)除去偶聯(lián)物混合物中的EDU禾口/或DMAP。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)用EDAC將Hib莢膜糖偶聯(lián)到破傷風類毒素，然后檢測EDU;(b)用CDAP試劑將MenA莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體，然后測定DMAP;和(c)用CDAP試劑將MenC莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體，然后測定DMAP。該方法通常還包括以下步驟(d)混合步驟(a)的Hib偶聯(lián)物、步驟(b)的MenA偶聯(lián)物和步驟(c)的MenC偶聯(lián)物以得到偶聯(lián)物混合物。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)用EDAC將Hib莢膜糖偶聯(lián)到破傷風類毒素；(b)用CDAP試劑將MenA莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體；和(c)用CDAP試劑將MenC莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體；(d)混合步驟(a)的Hib偶聯(lián)物、步驟(b)的MenA偶聯(lián)物和步驟(c)的MenC偶聯(lián)物以得到偶聯(lián)物混合物；和(e)測定偶聯(lián)物混合物中的EDU禾口/或DMAP。本發(fā)明還提供了一種制備包含以下組分的偶聯(lián)物混合物的方法(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(ii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的莢膜糖，和(iii)偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的莢膜糖，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)用EDAC將Hib莢膜糖偶聯(lián)到載體蛋白；(b)用EDAC將MenA莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體；(c)用EDAC將MenC莢膜糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體；(d)混合步驟(a)的Hib偶聯(lián)物、步驟(b)的MenA偶聯(lián)物和步驟(c)的MenC偶聯(lián)物以得到偶聯(lián)物混合物；和(e)除去偶聯(lián)物混合物中的EDU。EDAC/EDU法特別適合以破傷風類毒素作為載體蛋白的情況。CDAP/DMAP法特別適合以D蛋白作為載體蛋白的情況。(7"淳絲絲淳&游資會上面的章節(jié)(1)-(12)包括了本發(fā)明的各種特征性特征<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>p.a.至o.中的任何一種與(9)組合q.a.至p.中的任何一種與(ll)組合組合e.和f.(然后是g.、h.、i.和j.)是有利的，這是因為當使用CDAP時腦膜炎球菌糖類上脆弱的乙?；杀槐Ａ?。組合k.是有利的，這是因為混合佐劑和抗原的正確順序?qū)τ谖绞顷P(guān)鍵性的，從而對于功效和長期儲存穩(wěn)定性也是關(guān)鍵性的。組合l.是有利是，這是因為它能最小化制造過程中的多個階段加入防腐劑的需求。白喉是由白喉棒狀桿菌造成的，這是一種革蘭氏陽性非芽孢需氧菌。這種細菌表達原噬菌體編碼的ADP-核糖化外毒素('白喉毒素')，可處理這種外毒素(例如采用福爾馬林或甲醛)以得到不再具有毒性但保留抗原性并能夠在注射后刺激產(chǎn)生特異性抗-毒素抗體的類毒素。白喉類毒素在參考文獻1的第13章中有更加詳細的描述。優(yōu)選的白喉類毒素是通過甲酸處理制備的?？墒拱缀戆魻顥U菌在可添加有牛提取物的生長培養(yǎng)基(例如，F(xiàn)enton培養(yǎng)基或者Linggoud和Fenton培養(yǎng)基)中生長，然后進行甲醛處理、超濾和沉淀以得到白喉類毒素。然后用包括無菌過濾和/或滲析的方法處理類毒素化的材料。白喉類毒素優(yōu)選被吸附到氫氧化鋁佐劑上。優(yōu)選地，白喉類毒素組分基本上不含任何汞防腐劑。白喉類毒素的量可表達為國際單位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的白喉類毒素的第三國際標準1999'(DiphtheriaToxoidAdsorbedThirdInternationalStandard1999)[20,21]含有160IU/安瓿。除了IU系統(tǒng)，'Lf'單位("絮凝化單位"或"臨界絮凝化劑量")被定義為與1國際單位抗毒素混合產(chǎn)生最佳絮凝化混合物的類毒素的量[22]。例如，NIBSC提供的'簡易白喉類毒素'(DiphtheriaToxoid,Plain)[23]，其含有300LF/安瓿，并還提供了'用于絮凝試驗的白喉類毒素的第一國際參考試劑'(The1stInternationalReferenceReagentForDiphtheriaToxoidForFlocculationTest)[24〗，其含有900LF/安瓿。當采用牛材料培養(yǎng)白喉棒狀桿菌時，這些材料應獲自未患牛海綿狀腦病(BSE)或其它遺傳性海綿狀腦病(TSE)的來源。本發(fā)明的疫苗中白喉類毒素與破傷風類毒素的比例通常在2:l和3:l之間(以Lf單位測量)，優(yōu)選在2.4:1和2.6:1之間，更優(yōu)選2.5:1。本發(fā)明的疫苗中白喉類毒素的量通常為至少30IU/劑。"5J被艦類#破傷風是由破傷風梭菌造成的，這是一種革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢菌。這種菌表達一種內(nèi)肽酶('破傷風毒素')，可對其進行處理以得到不再具有毒性但保留抗原性并能夠在注射后刺激產(chǎn)生特異性抗-毒素抗體的類毒素。破傷風類毒素在參考文獻1的第27章中有更加詳細的描述。優(yōu)選的破傷風類毒素是通過甲醛處理制備的?？墒蛊苽L梭菌在生長培養(yǎng)基(例如，衍生自牛酪蛋白的Latham培養(yǎng)基)中生長，然后進行甲醛處理、超濾和沉淀以得到破傷風類毒素。然后可用包括無菌過濾和/或滲析的方法處理該材料。破傷風類毒素可被吸附到氫氧化鋁佐劑上，但這不是必須的(例如，可以使用總破傷風類毒素中0-10%的吸附)。優(yōu)選地，破傷風類毒素組分基本上不含任何汞防腐劑。破傷風類毒素的量可表達為國際單位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的破傷風類毒素的第三國際標準2000，(TetanusToxoidAdsorbedThirdInternationalStandard2000)[25,26]含有469IU/安瓿。除了IU系統(tǒng)，'Lf'單位("絮凝化單位"或"臨界絮凝化劑量")被定義為與1國際單位抗毒素混合產(chǎn)生最佳絮凝化混合物的類毒素的量[22]。例如，NIBSC提供了'用于絮凝試驗的破傷風類毒素的第一國際參考試劑'(The1stInternationalReferenceReagentforTetanuxToxoidForFlocculationTest)[24〗，其含有1000LF/安瓿。當采用牛材料培養(yǎng)破傷風梭菌時，這些材料應獲自未患牛海綿狀腦病(BSE)或其它遺傳性海綿狀腦病(TSE)的來源。本發(fā)明的疫苗中破傷風類毒素與白喉類毒素的比例通常在1:2和l:3之間(以Lf單位測量)，優(yōu)選在1:2.4和1:2.6之間，更優(yōu)選1:2.5。本發(fā)明的疫苗中破傷風類毒素的量通常為至少60IU/劑。(7"繊麗微嚴疫苗中的百日咳抗原是細胞(全細胞)或非細胞的。本發(fā)明采用細胞百日咳抗原，其形式為滅活的百日咳博德特氏菌細胞。細胞百日咳抗原的制備已經(jīng)充分論述[例如參見參考文獻1的第21章]。例如，可通過熱滅活百日咳博德特氏菌的I期培養(yǎng)物來獲得。細胞百日咳抗原可被吸附到磷酸鋁佐劑上或與該佐劑混合。wP抗原的量可表達為國際單位(IU)。例如，NIBSC提供了'百日咳疫苗的第三國際標準，(ThirdInternationalStandardForPertussisVaccine)[28]，其含有46IU/安瓿。各安瓿含有2.0ml等分水溶液的凍干殘余物，該水溶液含有10升用8升M/15Sorensen緩沖液pH7.0稀釋的細菌懸浮液(根據(jù)美國不透明度標準等于180不透明單位)。除了IU系統(tǒng)，還可使用'OU'單位("不透明單位")(例如，40U約為1IU)。本發(fā)明的疫苗中wP抗原的量通常為至少4IU/劑。乙肝病毒(HBV)是一種已知的造成病毒性肝炎的物質(zhì)。HBV病毒粒子由被外部蛋白質(zhì)外殼或衣殼包裹的內(nèi)部核心構(gòu)成。病毒核心含有病毒DNA基因組。衣殼的主要成份是一種蛋白質(zhì)，被稱為HBV表面抗原，或者更通常稱為'HBsAg'，這是一種分子量約為24kDa的由226個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。所有現(xiàn)有乙肝疫苗含HBsAg，當這種抗原被給予接種者時它能剌激產(chǎn)生抗-HbsAg抗體從而抵抗HBV感染。為制造疫苗，可用兩種方法制備HBsAg。第一種方法涉及從慢性乙肝攜帶者的血漿中純化特定形式的抗原，這是因為慢性乙肝攜帶者的肝臟中會合成大量HbsAg并在HBV感染期間釋放到血流中。第二種方法涉及通過重組DNA法表達蛋白質(zhì)。可用任何一種方法制備用于本發(fā)明方法的HBsAg，但優(yōu)選采用通過重組表達制備的HbsAg。具體地說，優(yōu)選HbsAg是通過在酵母如酵母屬(如釀酒酵母OS.cerev&ae))或漢森酵母屬(如多形漢森酵母(Hpo(ymo^Aa))中表達制備的。酵母表達的HbsAg將通常是非糖基化的。HbsAg通常為基本球形顆粒(平均直徑約20nm)的形式，其中含有包含磷脂的脂質(zhì)基質(zhì)。酵母表達的HbsAg顆粒可含有在天然HBV病毒粒子中未發(fā)現(xiàn)的磷脂酰肌醇。該顆粒也可含有非毒性量的LPS以刺激免疫系統(tǒng)[29]。HBsAg優(yōu)選來自HBV亞型adw2。盡管在最終疫苗中HbsAg可被吸附到氫氧化鋁佐劑上(如在熟知的五7VG五;Z^5TM產(chǎn)品中那樣)，但它也可保持未吸附，而通常在用于本發(fā)明的方法之前吸附到磷酸鋁佐劑上[17]。HbsAg的量通常以微克表示。每劑疫苗中HbsAg的典型含量為IO嗎。W柳錄微用于本發(fā)明疫苗的b型流感嗜血桿菌抗原含有Hib莢膜糖抗原。來自b型流感嗜血桿菌的糖類抗原是熟知的[例如，參考文獻1的第14章]。Hib糖類被偶聯(lián)到載體蛋白上以增強其免疫原性，尤其是在兒童中。Hib莢膜糖的制備已經(jīng)充分論述[例如，參考文獻30-39]。如參考文獻1的表14-7所示，各種不同的連接載體蛋白已被用于Hib偶聯(lián)物。PRP-D產(chǎn)品采用白喉類毒素載體蛋白，這種載體也可用于本發(fā)明。HbOC產(chǎn)品采用CRM197載體蛋白，這種載體也可用于本發(fā)明。PRP-OMP產(chǎn)品采用血清組B腦膜炎球菌的外膜蛋白復合物作為載體，這種載體也可用于本發(fā)明。PRP-T產(chǎn)品采用破傷風類毒素載體蛋白，這種載體也可用于本發(fā)明。流感嗜血桿菌D蛋白(見下文)也可用作Hib偶聯(lián)物的載體。優(yōu)選的用于本發(fā)明的Hib偶聯(lián)物采用破傷風類毒素作為載體蛋白以得到通常稱為'PRP-T，的產(chǎn)品。這是HIBERIXTM產(chǎn)品中的偶聯(lián)物。Hib偶聯(lián)物中的載體蛋白優(yōu)選不同于腦膜炎球菌偶聯(lián)物中的載體蛋白，但在一些實施方案中也可使用相同的載體。從Hib菌制備時偶聯(lián)物的糖部分可含有全長磷酸多核糖基核糖醇(PRP)，和/或可含有全長PRP的片段?？刹捎玫呐悸?lián)物中糖:蛋白質(zhì)的比例(w/w)在l:5(即蛋白質(zhì)過量)和5:1(即糖類過量)之間，例如，比例在1:2和5:1之間以及比例在1:1.25禾P1:2.5之間。然而，在優(yōu)選的疫苗中，糖與載體蛋白的重量比在1:2.5和1:3.5之間。在破傷風類毒素同時作為抗原和載體蛋白的疫苗中，偶聯(lián)物中糖與載體蛋白的重量比可在1:0.3和1:2之間[5]。不考慮所含作為抗原的破傷風類毒素，未偶聯(lián)的載體優(yōu)選不超過整體組合物中載體蛋白總量的5%，更優(yōu)選小于2%重量。給予Hib抗原優(yōu)選導致抗-PRP抗體濃度》0.15pg/ml，更優(yōu)選》1pg/ml。這些是標準的可接受反應閥值。Hib偶聯(lián)物的量通常以糖類的質(zhì)量表示(即偶聯(lián)物整體(載體+糖類)的劑量高于標示劑量)以避免由于載體的選擇造成的差異。每劑疫苗中Hib糖類的典型含量為按照本發(fā)明，Hib偶聯(lián)物在其使用前可被凍干。在凍干操作之前也可加入其它組分，例如作為穩(wěn)定劑?？杉尤氲膬?yōu)選穩(wěn)定劑是乳糖、蔗糖和甘露醇，以及它們的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，最終的疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。采用蔗糖/甘露醇混合物能加速干燥過程。(7力蘑蘑賴朦微激用于本發(fā)明疫苗的腦膜炎球菌抗原含有與載體蛋白偶聯(lián)的莢膜糖抗原。來自腦膜炎奈瑟氏球菌的糖類抗原是熟知的多年前便已知道二價疫苗MENCEVAXACtm和四價疫苗MENCEVAXACWYTM[40，41]。此外，抗血清組C的偶聯(lián)疫苗已被批準用于人類，其中包括MENJUGATEtm[42]、MENINGITECTM和NEISVAC-C。已知來自血清組A+C的偶聯(lián)物的混合物[43，44]，還己經(jīng)報道了來自血清組A+C+W135+Y的偶聯(lián)物的混合物[45-48]。用于本發(fā)明的產(chǎn)品和方法的腦膜炎球菌糖類可來自血清組A、C、W135和Y中的一種或多禾中，例如，A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y。優(yōu)選至少采用血清組C的糖類，且優(yōu)選采用同時來自血清組A和C的糖類。本發(fā)明可采用具有任何合適的連接化學和任何合適的間隔物(除非給出具體細節(jié))的任何合適的腦膜炎球菌偶聯(lián)物。MENJUGATEtm和MENINGITECTM產(chǎn)品采用CRM197載體蛋白，這種載體也可用于本發(fā)明。NEISVAC-CTM產(chǎn)品采用破傷風類毒素載體蛋白，這種載體也可用于本發(fā)明。特別優(yōu)選的腦膜炎球菌偶聯(lián)物的載體蛋白是來自流感嗜血桿菌的D蛋白，它不存在于任何現(xiàn)有被批準的偶聯(lián)物疫苗中。這種蛋白質(zhì)詳細描述于參考文獻49和50，將其用作偶聯(lián)物中的載體蛋白描述于參考文獻51。術(shù)語"D蛋白"包括天然的全長蛋白質(zhì)的片段，如參考文獻51所述，還包括含有全長D蛋白或這些片段的融合蛋白(例如，流感病毒NS1蛋白的片段和D蛋白的片段的融合物)。當這些片段與T-非依賴性糖類抗原偶聯(lián)時保留了將其轉(zhuǎn)變成T-依賴性抗原的能力。典型的片段至少將包括D蛋白N-端的1/3。該蛋白質(zhì)可在大腸桿菌中方便地表達[50]，且這種重組材料優(yōu)選用于本發(fā)明[51]。當使用D蛋白載體時，偶聯(lián)物被稱為'MenA-D'和'MenC-D'。優(yōu)選單獨的腦膜炎球菌偶聯(lián)物應采用單獨的載體蛋白(參見參考文獻52)，但優(yōu)選這些單獨的載體應相互相同，例如組合物中的所有腦膜炎球菌偶聯(lián)物應采用破傷風類毒素載體，或者組合物中的所有腦膜炎球菌偶聯(lián)物應采用D蛋白載體，等等。腦膜炎球菌偶聯(lián)物中的載體蛋白優(yōu)選不同于Hib偶聯(lián)物中的載體蛋白，但在一些實施方案中可采用相同的載體。當從腦膜炎球菌制備時偶聯(lián)物的糖部分可含有全長糖類，和/或可含有全長糖類的片段。可采用的腦膜炎球菌偶聯(lián)物中糖:蛋白質(zhì)的比例(w/w)在1:10(即蛋白質(zhì)過量)和10:1(即糖類過量)之間，例如，比例在1:5和5:1之間、在1:2.5禾卩2.5:1之間、或在1:1.25和1.25:1之間。給予腦膜炎球菌偶聯(lián)物優(yōu)選導致相關(guān)血清組的血清殺菌測定(SBA)效價提高至少4倍，優(yōu)選至少8倍。SBA效價可用幼兔補體或人補體測量[53]。腦膜炎球菌偶聯(lián)物的濃度通常以糖類的質(zhì)量表示(即偶聯(lián)物整體(載體+糖類)的劑量高于標示劑量)以避免由于載體的選擇而造成的差異。每劑疫苗中每種腦膜炎球菌糖類的典型含量約為5嗎或I0Mg。根據(jù)本發(fā)明，腦膜炎球菌偶聯(lián)物在其使用前可被凍千。在凍干操作之前也可加入其它組分，例如作為穩(wěn)定劑?？杉尤氲膬?yōu)選穩(wěn)定劑是乳糖和/或蔗糖。因此，最終的疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。卩W像凝激凝^激本發(fā)明提供了偶聯(lián)物混合物及其制備方法。其中通常包含(i)Hib偶聯(lián)物、(ii)MenA偶聯(lián)物和(iii)MenC偶聯(lián)物的混合物。偶聯(lián)物混合物可用作疫苗本身，也可用作與其它抗原混合的組分以制造組合疫苗。偶聯(lián)物混合物可含有三種以上的偶聯(lián)物，但優(yōu)選為三價偶聯(lián)物混合物。也可制備還含有來自腦膜炎球菌血清組W135和Y的偶聯(lián)的莢膜糖的五價偶聯(lián)物混合物。偶聯(lián)物混合物優(yōu)選為凍干形式。偶聯(lián)物混合物優(yōu)選不含以下抗原白喉類毒素；百日咳博德特氏菌抗原；脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原；HbsAg。優(yōu)選地，沒有一種偶聯(lián)物被吸附到鋁鹽上[2]，且更優(yōu)選不包含鋁鹽。最優(yōu)選的混合的偶聯(lián)物組分未經(jīng)佐劑處理。然而它們可含有糖，例如乳糖或者優(yōu)選蔗糖。(2"絲除了抗原性組分，本發(fā)明的疫苗通常會含有至少一種鋁鹽佐劑。如上所述，所述疫苗可同時含有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。當同時含有時，這兩種佐劑的重量比約為l:l，例如，氫氧化鋁:磷酸鋁的比例約為1.58:1.6。盡管鋁佐劑通常被稱為"氫氧化鋁"或"磷酸鋁"佐劑，但這些只是為方便起見而取的名字，它們都沒有準確描述所存在的實際化合物[例如參見參考文獻54的第9章]。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸鹽"佐劑。被稱為"氫氧化鋁"的佐劑通常為鋁的羥基氧化物鹽類，其通常至少部分為晶體狀的。鋁的羥基氧化物可表示為A10(OH)，通過紅外(IR)光譜可將其與其它的鋁化合物如氫氧化鋁Al(OH)3區(qū)別開，尤其是通過1070cm—1出現(xiàn)的吸收帶和3090-3100cm—1出現(xiàn)的強肩峰[參考文獻54的第9章]。被稱為"磷酸鋁"的佐劑通常為鋁的羥基磷酸鹽，經(jīng)常還含有小量硫酸鹽(即鋁的羥基磷酸鹽的硫酸鹽)。它們可通過沉淀獲得，沉淀期間的反應條件和濃度會影響磷酸根對鹽中羥基的取代程度。羥基磷酸鹽中P04/A1的摩爾比通常在0.3和1.2之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而不同于嚴格的A1P04。例如，3164cm—'處的IR光譜條帶(例如當加熱至20(TC時)證明存在結(jié)構(gòu)性羥基[參考文獻54的第9章]。佐劑可采取任何合適形式(例如，凝膠、晶體、無定形等)。磷酸鋁佐劑的P(VA產(chǎn)摩爾比通常為0.3-1.2，優(yōu)選0.8-1.2，更優(yōu)選0.95士0丄佐劑一般為無定形羥基磷酸鋁，其中P04/AI摩爾比為0.84-0.92，包含0.6mgAl3+/ml。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。磷酸鋁通常是顆粒?？乖胶笃漕w粒的直徑一般為0.5-20pm(如約5-10|im)。磷酸鋁的PZC與用磷酸根取代羥基的程度成反比，這種取代程度可隨著用于通過沉淀制備鹽的反應條件和反應物濃度而改變。也可通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=更酸性的PZC)或通過加入緩沖液如組氨酸緩沖液(使PZC的堿性更強)來改變PZC。用于本發(fā)明的磷酸鋁的PZC通常為5.0-7.0，更優(yōu)選5.5-6.0，如約5.7。優(yōu)選以加入抗原的水性溶液形式使用磷酸鋁(注一般將磷酸鋁水溶液稱為"溶液"，但是從嚴格的物理化學觀點來看，該鹽不可溶，形成的是懸液)。優(yōu)選將磷酸鋁稀釋到所需濃度，以保證在加入抗原性組分之前是均一溶液。在加入抗原之前A產(chǎn)的濃度通常為0-10mg/ml。優(yōu)選濃度為2-6mg/ml。用于制備本發(fā)明疫苗的磷酸鋁溶液可(但不必須)含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸緩沖液)。磷酸鋁溶液優(yōu)選無菌和無熱原。磷酸鋁溶液可包含游離(如以濃度為1.0-20mM，優(yōu)選為5-15mM,更優(yōu)選約為10mM存在的)的水性磷酸根離子。磷酸鋁溶液也可包含氯化鈉。氯化鈉濃度優(yōu)選為0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml，1-20mg/ml，2-10mg/ml)，更優(yōu)選約為3±1mg/ml。存在NaCl有助于在吸附抗原之前正確測定pH。當將抗原描述為被"吸附"到佐劑時，優(yōu)選至少50%(以重量計)的抗原被吸附，例如50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更多。在一些實施方式中，白喉類毒素和破傷風類毒素都被全部吸附，即在上清液中不可檢測。也優(yōu)選將HbsAg全部吸附。W資認游邀分除了含有抗原和佐劑等，本發(fā)明的組合疫苗可含有其它組分。這些組分可具有各種來源。例如，它們可存在于一種在本發(fā)明的加工過程中混合的抗原性組分中或者可在加工過程中與抗原性組分分別加入。為控制最終疫苗產(chǎn)品的張力，優(yōu)選的含有生理鹽，如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其在最終疫苗產(chǎn)品中的含量可為l-20mg/ml。由于抗原的吸附特性，最終的疫苗產(chǎn)品可以是具有絮狀外觀的懸浮液。這種外觀意味著微生物污染不容易被發(fā)現(xiàn)，因此疫苗中優(yōu)選含有抗微生物劑。當用多劑量容器包裝疫苗時這尤其重要。優(yōu)選含有的抗微生物劑是2-苯氧乙醇和硫柳汞。然而優(yōu)選在本發(fā)明的加工過程中不使用汞防腐劑(例如，硫柳汞)。然而，如果加工期間使用的抗原(例如，HBsAg)已經(jīng)用這種防腐劑處理過則不可避免地會存在痕量防腐劑。然而為安全起見，優(yōu)選最終的疫苗產(chǎn)品含有的汞少于約25ng/ml。更優(yōu)選地，最終的疫苗產(chǎn)品含有的硫柳汞不可檢測。這通常是通過在將抗原制品用于本發(fā)明方法之前除去其中的汞防腐劑或者通過在制備單獨的抗原性組分期間避免使用硫柳汞實現(xiàn)的。除了硫柳汞之類的物質(zhì)，通過本發(fā)明方法制造的最終疫苗中也可存在痕量來自各抗原的其它殘余成份。例如，如果采用甲醛來制備白喉、破傷風和百日咳的類毒素，則最終的疫苗產(chǎn)品可含有痕量甲醛(例如，少于10pg/ml，優(yōu)選〈5嗎/ml)。游離氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸和/或羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或纈氨酸)、維生素(例如膽堿、抗壞血酸等)、磷酸二鈉、磷酸二氫鉀、鈣、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、酚紅、乙酸鈉、氯化鉀等也可存在于最終的疫苗中，每種物質(zhì)的濃度《100pg/ml(例如，《50嗎/ml、《10嗎/ml)。最終疫苗中其它可能的組分來源于抗原制備中未充分純化抗原。因此可能存在小量百日咳博德特氏菌、白喉棒狀桿菌、破傷風梭菌和釀酒酵母蛋白和/或基因組DNA。為最小化這些殘余組分的量，優(yōu)選對抗原制品進行處理以除去它們，然后再將抗原用于本發(fā)明的方法。當最終的疫苗中存在鋁鹽時，鋁的總量(以八13+表示)優(yōu)選<2mg/ml(例如，1.2-1.5mg/ml，或約1.4mg/ml;或0.4-0.8mg/ml，或約0.6mg/ml)。在本發(fā)明的加工期間，稀釋組分以得到所需最終濃度將通常由WFI(注射用水)完成。為防止抗原、尤其是偶聯(lián)抗原之間的干擾，可以包含聚陰離子聚合物，如聚-L-谷氨酸[55]。。"資效艦包姿在典型的應用中，本發(fā)明的方法將用于提供適合包裝、然后適合分配和給藥的散裝組合疫苗。上述濃度通常是最終包裝疫苗中的濃度，因此散裝疫苗中的濃度可能較高(例如，需要通過稀釋以降至最終濃度)。因此，本發(fā)明的方法可包括將疫苗包裝在容器中以供使用的其它步驟。合適的容器包括藥瓶和一次性針筒(優(yōu)選無菌針筒)。當將疫苗包裝入藥瓶時，優(yōu)選這些藥瓶是用玻璃或塑料材料制成的。藥瓶在加入疫苗之前優(yōu)選被滅菌。為避免對乳膠敏感患者造成問題，可用不含乳膠的塞子密封藥瓶。藥瓶中可裝有單劑量疫苗或者可裝有一劑以上疫苗('多劑量，藥瓶)，例如，10劑。當采用多劑量藥瓶時，各劑量應在嚴格無菌條件下用無菌針頭和針筒取出，同時要小心避免污染藥瓶的內(nèi)容物。優(yōu)選的藥瓶由無色玻璃制成。當疫苗被包裝入針筒時，針筒上通常未附加針頭，但可與針筒一起提供單獨的針頭以供裝配和使用。優(yōu)選安全針頭。通常為1英寸23號、l英寸25號和5/8英寸25號針頭?？稍卺樛采咸峁┛蓜冸x的印有內(nèi)容物批號和有效期的標簽以方便保存。針筒內(nèi)的柱塞優(yōu)選有制動器以防止柱塞在抽吸過程中意外被拉出。針筒可具有乳膠橡皮帽和/或柱塞。一次性針筒裝有單劑量疫苗。針筒通常會具有針帽以在附加針頭之前密封針尖，且該針帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果針筒和針頭是獨立包裝的，則優(yōu)選為針頭配備丁基橡膠護罩。優(yōu)選灰色丁基橡膠。優(yōu)選的針筒是以商品名"Tip-Lok"TM銷售的針筒。當采用玻璃容器(例如，針筒或藥瓶)時，優(yōu)選采用由硼硅玻璃而非鈉鈣玻璃制成的容器。當單獨包裝時，偶聯(lián)抗原將通常被冷凍干燥(凍干)在單獨的容器內(nèi)，從而包裝的疫苗將含有至少兩個分開的容器。在施用于患者之前，將用另一容器內(nèi)的液體重建和稀釋這種凍干材料。因此，偶聯(lián)物容器將通常為藥瓶，而另一容器將含有裝在藥瓶或預裝針筒內(nèi)的液體。第二容器中的液體內(nèi)容物將被轉(zhuǎn)移到裝有凍干的偶聯(lián)抗原粉末的藥瓶內(nèi)，從而重建偶聯(lián)抗原以便給予患者。裝凍干偶聯(lián)物的容器優(yōu)選為具有適配蓋子的藥瓶(例如，Luer鎖緊套口)，從而可將預裝針筒插入該蓋，將針筒的內(nèi)容物排入藥瓶內(nèi)以重建其中的凍干材料，并可將藥瓶的內(nèi)容物重新吸回針筒。從藥瓶上取下針筒之后，然后可加上針頭并可將疫苗施用于患者。所述蓋優(yōu)選位于封口或覆蓋物內(nèi)側(cè)，從而在接觸蓋子之前封口或覆蓋物已被除去。本發(fā)明的組合疫苗優(yōu)選以0.5ml的劑量給予患者。因此，本發(fā)明的方法可包括從散裝疫苗中取出0.5ml樣品并將其包裝入容器的步驟。對于多劑量情況，將取出多劑用量并一起包裝入單個容器。當疫苗為包含凍干組分的試劑盒時，則重建后的最終劑量優(yōu)選為0.5ml。這里提及的0.5ml劑量應理解為平均0.5ml士0.05ml。裝疫苗的容器然后將通常被裝入盒子中以供分配，例如裝入紙板盒，盒子上還將標示疫苗的細節(jié)，例如其商品名、疫苗中抗原的組成(例如，'白喉、破傷風、滅活的全細胞百日咳和乙肝重組體，吸附疫苗'等)、容器規(guī)格(例如，'一次性預裝Tip-Lok針筒'或'10x0.5ml單劑量藥瓶')、其劑量(例如，'各含一個0.5ml劑量')、警告(例如，'僅供兒科使用')、有效期等。每個盒子可含有一個以上包裝的疫苗，例如5個或10個包裝的疫苗(尤其對于藥瓶而言)。如果疫苗是含在針筒內(nèi)的，則包裝上應顯示針筒的圖片。疫苗可包裝在一起(例如裝入同一盒子)并夾入包含疫苗細節(jié)的單頁，如給藥說明、疫苗內(nèi)抗原的細節(jié)等。說明還可包括警告，例如將腎上腺素溶液放在方便獲得的地方以應對接種后發(fā)生的過敏反應等。包裝的疫苗材料優(yōu)選是無菌的。包裝的疫苗材料優(yōu)選是無熱原的，例如含有〈1EU(內(nèi)毒素單位，標準量度)/劑，優(yōu)選<0.1EU/劑。包裝的疫苗材料優(yōu)選不含谷蛋白。任何水性包裝疫苗材料的pH優(yōu)選為6-8，例如6.5-7.5。因此，本發(fā)明的方法可包括在包裝之前調(diào)節(jié)散裝疫苗的pH的步驟。包裝疫苗內(nèi)的任何水性材料優(yōu)選為混濁的白色懸浮液。包裝的疫苗優(yōu)選儲存于2-8i:。不應冷凍。(24)疫苗的施用最終的本發(fā)明的組合疫苗適合給予人類，尤其是兒童。疫苗的典型劑量方案或者為達到完整功效將包括在初步免疫接種方案中給予一次以上的劑量。典型的初步方案將包括三次劑量，間隔約6-8周給予，其中第一次劑量在兒童6-9周時給予。優(yōu)選在6、10和14周時接種的3劑初步方案，并可在第18個月時給予第四次劑量。該疫苗也可用來完成不同疫苗的初步免疫接種方案。本發(fā)明提供了一種在患者中引起免疫應答的方法，所述方法包括給予患者本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明的組合物，該組合物用于藥物。本發(fā)明還提供了以下物質(zhì)在制造用于免疫患者的藥物中的應用(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖。本發(fā)明還提供了以下物質(zhì)在制造用于免疫患者的藥物中的應用(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，其中，所述藥物用來重建偶聯(lián)物混合物。本發(fā)明還提供了以下物質(zhì)在制造用于免疫患者的藥物中的應用(i)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖和(ii)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其中，所述藥物被凍干并在用含有至少一種其它抗原的水性疫苗重建之后施用。上面給出了各種藥物的其它具體特征。優(yōu)選的藥物是疫苗。藥物將通常直接給予患者。直接給藥可通過胃腸道外注射(如靜脈注射、皮下注射、腹腔注射、肌肉注射或注射到組織間隙)、或通過直腸給藥、口服、陰道內(nèi)給藥、局部給藥、透皮給藥、鼻內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥、耳內(nèi)給藥、肺內(nèi)吸入或其他粘膜給藥途徑來完成。然而通常通過肌內(nèi)注射給藥。優(yōu)選的注射部位是大腿前外側(cè)或上臂的三角肌。這些應用、方法和藥物優(yōu)選用于對上述病原體產(chǎn)生免疫力。所述患者優(yōu)選是人，并且可以是兒童(例如學步童或嬰兒)、青少年或成年人，但通常是兒童。優(yōu)選的患者年齡為0-36個月，例如0-24個月、0-12個月或0-6個月。檢測單獨抗原功效的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的疫苗可與口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(如例如含有1型脊髓灰質(zhì)炎病毒、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒的三價口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗)基本同時給予。第一次接受本發(fā)明的疫苗的兒童之前可接受過口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗和/或卡介苗(BCG)。因此，優(yōu)選的接受免疫接種的患者組包括但不限于(a)之前接受過口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗的兒童；(b)之前接受過卡介苗的兒童；(c)之前接受過口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗和BCG的兒童；(d)之前未接受過D、T、Pw、HbsAg、Hib偶聯(lián)物和至少一種腦膜炎球菌偶聯(lián)物中的任何一種的組(a)、(b)或(c)中的兒童；和(e)之前接受過口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗、BCG、D、T、Pw、HbsAg、Hib偶聯(lián)物和至少一種腦膜炎球菌偶聯(lián)物的兒童。這些兒童的年齡可以在任何一個上文特別指出的年齡組中，如0-36、0-24、0-12或0-6個月。因此，本發(fā)明提供了以下物質(zhì)在制造用于免疫所述(a)-(e)組之一中的患者的藥物中的應用(i)白喉類毒素，(ii)破傷風類毒素，(iii)細胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(V)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌莢膜糖，(Vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖。如果本發(fā)明的疫苗含有鋁基佐劑，則在儲存過程中可能發(fā)生組分沉淀。因此在將疫苗給予患者之前應振蕩。經(jīng)過振蕩的疫苗為混濁的白色懸浮液。概述術(shù)語"含有"包括"包含"以及"由...組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它的物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語"基本上"不排除"完全"，例如"基本上不含"Y的組合物可完全不含Y。"基本上"可視需要從本發(fā)明定義中省去。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語"約"表示，例如x±10%。偶聯(lián)技術(shù)的一般信息可在參考文獻39中找到。附圖簡述圖1顯示了組合物中HBsAg穩(wěn)定性的western印跡結(jié)果。在圖1A中，各泳道為:(1)Lae匪li加樣緩沖液(LSB);(2)MW標記；(3-5)l昭三種單獨的對照HbsAg制品；(6-8)三種單獨的五價組合物的上清液；(9-10)LSB。在圖1B中，各泳道為(l)MW標記；(2-4)l嗎三種單獨的對照HbsAg制品;(5-7)在2-8。C儲存2周的三種單獨的五價組合物的上清液；(8-10)在36-38t:儲存2周的三種單獨的五價組合物的上清液。圖2顯示了五價組合物的pH隨時間的變化情況。圖3顯示了八價組合物中HBsAg穩(wěn)定性的western印跡結(jié)果。在圖3A和3B中泳道1含MW標記；泳道2含濃度為lpg/ml的HBsAg對照；泳道3含八價組合物的上清液。在圖3B中泳道4含LSB;泳道5含與泳道2相同的對照；泳道6含DOC/TCA提取物。實施本發(fā)明的方式在鋁鹽佐劑懸浮液中加入酵母表達的HbsAg、白喉類毒素、破傷風類毒素和全細胞百日咳抗原。調(diào)節(jié)混合物的pH，然后加入Hib-CRM197偶聯(lián)物，從而它不會被吸附到鋁佐劑上。該方法得到的五價疫苗具有以下組成<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>在進一步的工作中，在加入CRM-Hib組分之后加入來自血清組C、W135和Y中每一種的單獨的腦膜炎球菌-CRM197偶聯(lián)物以得到八價疫苗<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表示疫苗穩(wěn)定性和功效的一個重要參數(shù)是Hib偶聯(lián)物的水解百分比，臨床極限為25%游離糖類(參考文獻56稱，20%不會影響臨床免疫原性)。通過HPAEC-PAD對五價疫苗測量了該參數(shù)，HPAEC-PAD能夠以最小量的分離和純化(w他minimalseparationandclean-up)直接量化皮摩爾水平的未偶聯(lián)糖類。分析針對于游離糖類的測定了糖的(a)總量，以|ig/ml表示(b)上清液中的量(即未吸附的量)，以(ig/ml表示(c)游離量(CRM197-Hib偶聯(lián)物水解得到)，以嗎/ml表示(c)值表達為(d)(b)的百分比或表達為(e)理論上總糖濃度(20嗎/ml)的百分比。結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>最多25%的游離糖是臨床上可接受的。所有的值都低于該范圍，在2-8T:儲存最多達4周時低于6.5%。在熱應激條件下(36-38"C儲存4周)觀察到較高水平，但仍舊低于25%的值，其中對第l批觀察到最大值，為11.6%。對多價Hib疫苗進行的早期工作顯示，相比在2-8t:儲存2年，在36-38。C儲存1個月使更多的CRM-Hib水解。因此可以預計，在正常儲存條件下儲存至少兩年仍有可接受的水解。還在于2-8。C儲存6個月之后對游離糖類進行了HPAEC-PAD。數(shù)據(jù)如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>對這三批抗原中的每一批，功效檢測結(jié)果都明顯高于可接受的下限，這些結(jié)果顯示這三批抗原有良好的功效。為評價HBsAg免疫原性，在第0天和第14天通過皮下注射給一組10只CD1小鼠接種五價疫苗(0.5ml，1:4稀釋于鹽水)。在第21天采集小鼠血液并用(a)"Enzygnost抗-HBII"檢驗(DadeBehring)或(b)"AusabEIA"檢驗(Abbott)通過ELISA評價HbsAg特異性抗體。這些ELISA檢驗具有不同模式和不同的HBsAg靈敏度。因此無法比較兩種檢測之間的幾何平均效價值。然而，在各檢測中，血清的GMT值是最佳的。結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>進行這種類型的小鼠免疫原性試驗獲得的所有GMT值都高于文獻中報道的值。兩種抗原的應答者的百分比始終較高，處于約100%的最佳水平。為評價Hib免疫原性，在第0天、第10天和第20天通過皮下注射給一組8只CD1小鼠接種五價疫苗(0.5ml，l:4稀釋于鹽水)。在第34天采集小鼠血液并通過ELISA評價Hib特異性抗體。結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>HbsAg在鋁佐劑上是吸附是疫苗免疫原性的重要因素，該參數(shù)是通過免疫印跡測量的。免疫印跡過程基本如下用DOC/TCA沉淀1ml疫苗懸浮液，用LSB使其變性，然后加載到12%丙烯酰胺SDS-PAGE上；加入1嗎各批次HbsAg作為對照；羊抗-HbsAg抗體制品被用作第一抗體(I:IOOO稀釋)并將抗-羊POD偶聯(lián)物(1:2500稀釋)用作第二抗體。五價疫苗的結(jié)果示于圖1。圖1A的泳道6-8顯示，在O時間點組合物中沒有可檢測的可溶性HBsAg，圖1B和1C的泳道5-10證實，在2-8。C或36-38。C儲存2周和4周后亦是如此。在三個不同批次中，在這些不同條件下約99。/。的HbsAg保持吸附在佐劑上。在2-8。C儲存6個月后再進行一次穩(wěn)定性試驗(圖1D)。三批疫苗中每一批的吸附仍約為99%。圖1所用的陽性對照含有1|igHbsAg。觀察到與S肽(24kDa)對應的單個條帶以及聚合體的特征性條帶(約45kDa)。未見Pre-S2。還用類似的方法檢測了八價疫苗的HbsAg吸附。將1ml樣品3500rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中并用DOC/TCA沉淀。將沉淀重懸于200^提取緩沖液，煮沸5分鐘并1300rpm離心10分鐘。將20|il該提取物和經(jīng)DOC/TCA沉淀的上清液加載到12%SDS-PAGE上進行Western印跡。圖3A顯示了0時點的八價疫苗，圖3B顯示了在2-8r儲存8個月后的該疫苗。圖3B的泳道3和6不存在任何明顯染色(明顯少于在對照泳道2和5中用lpgHBsAg觀察到的染色)說明，在該儲存期之后HbsAg吸附仍舊是穩(wěn)定的。七份2)-7^^-/^^-歷》-^^"J-AfwC資勞如下收集5種抗原性組分-三價D-T-Pw組分制備的D-T-Pw組分包括吸附到氫氧化鋁佐劑上的白喉類毒素、同樣吸附到氫氧化鋁佐劑上的破傷風類毒素和以磷酸鋁作為佐劑的全細胞百日咳抗原。該組分含有硫柳汞但不含2-苯氧乙醇。-HBsAg組分從重組釀酒酵母表達并純化HBsAg。將純化的蛋白質(zhì)吸附到磷酸鋁抗原[17]。-Hib偶聯(lián)物組分Hib多糖從Hib菌株20752制備，用溴化氰活化并用已二酸酰肼間隔物衍生化后通過碳二亞胺縮合共價偶聯(lián)于破傷風類毒素，糖:載體的重量比約為1:3。在涉及EDAC的反應之后測量EDU水平。-MenA偶聯(lián)物組分純化來自血清組A腦膜炎球菌的莢膜糖并用CDAP技術(shù)共價偶聯(lián)于流感嗜血桿菌D蛋白。在涉及CDAP的反應之后測量殘余的DMAP含量，證實C-3的Oac基團得以保留。同樣通過CDAP偶聯(lián)還用破傷風類毒素載體制備了偶聯(lián)物。-MenC偶聯(lián)物組分純化來自O(shè)Ac+血清組C腦膜炎球菌的莢膜糖并用CDAP技術(shù)共價偶聯(lián)于流感嗜血桿菌D蛋白。在涉及CDAP的反應之后測量殘余的DMAP含量。還從OAc-菌株制備了偶聯(lián)物。同樣通過CDAP偶聯(lián)還用破傷風類毒素載體制備了偶聯(lián)物。將D-T-Pw組分與HBsAg組分混合，并將該水性形式的四價混合物包裝入有塞的藥瓶。HbsAg水平為10嗎/劑。將三種偶聯(lián)物混合并按參考文獻2的描述凍干。將凍干的粉末包裝入有塞的藥瓶。每種偶聯(lián)物的水平為5pg/劑。還制備了含有雙倍各偶聯(lián)物劑量的混合物。該偶聯(lián)物混合物是不含佐劑的。將兩個藥瓶包裝在一個盒子中。為對患者給藥，將水性D-T-Pw-HbsAg材料吸入針筒，并注入裝有凍干偶聯(lián)物的藥瓶。在凍干材料重活化之后將其吸回針筒，這樣便可給患者給藥了。對于嬰兒第6、10和14周時通過肌內(nèi)注射給予給予一次3劑初次免疫接種。為進行比較，140名嬰兒接受GSK的TRITANRIX-HepB/Hib疫苗。該疫苗顯示出極好的免疫原性。在隨訪試驗中，嬰兒在第6、10和14周時接受七價疫苗。對照患者接受TRITANRIX-HepB/Hib或TRITANRIX-HepB/Hib加MENINGITEC疫苗。在該初次免疫接種過程之前和之后1個月時測量血清抗體水平。每次疫苗接種后記錄8天內(nèi)隨訪(solicited)的局部和全身不良反應和30天內(nèi)的一般不良反應(unsolicitedadverseevents)。初次過程之后，與TRITANRIX-HepB/Hib對照組中的100%相比，99-100%接受該七價疫苗的對象的抗-PRP水平》0.15|ig/m。99-100%接受該七價疫苗的對象的SBA-MenC效價》1:8(而接受Meningitec的對象為100%)。至少97.7%接受該七價疫苗的對象的SBA-MenA效價》1:8(而接受Meningitec的對象為<10%)。該七價疫苗誘導的抗白喉、破傷風和乙肝抗原以及抗-百日咳博德特氏菌類毒素濃縮物的血清保護水平較高并類似于對照疫苗。臨床相關(guān)的隨訪/一般不良反應的發(fā)病率較低，并在所有組中分布相同。未報道與疫苗接種有關(guān)的嚴重不良反應。該七價疫苗顯示出極好的免疫原性和良好的安全性特征，說明它是對生活在MenA和MenC流行區(qū)的嬰兒進行初次免疫接種的合適的組合疫苗。在進一步的研究中，評價了在10個月大的嬰兒中對疫苗中Hib、MenA和MenC組分的免疫記憶力和抗體持久性。在用七價疫苗初免的嬰兒中，對Hib、MenA和MenC的抗體持久性和免疫記憶力極好IO嗎各種偶聯(lián)物引起高水平的相應抗體，證明用偶聯(lián)物疫苗初免是足夠的，因為其產(chǎn)生的反應高于未初免幼兒中的反應(就MenA和MenC而言)并類似于HiberixTM(就Hib而言)。應當理解的是，本發(fā)明只是用實施例的方式進行描述，只要不偏離本發(fā)明范圍和精神，可以對本發(fā)明作出修改。參考文獻(其內(nèi)容通過弓I用納入本文)(f資度i1f^cc/"asXPlotkin禾QOrenstein編)。第四版，2004，ISBN:0-7216-9688-0。WO02/00249。Gatchalian等，(2004)第14次國際致病性奈瑟菌大會摘要SI-68。[4]Gatchalian等，(2004)第14次國際致病性奈瑟菌大會摘要SI-69。[5]W096脂42。[6]美國專利5693326。Arakere和Frasch(1991)/"/e"./wmw".59:4349A356。[8]Michon等，(2000)Dev.飾/.103:151-160。[9]Rubinstein和Stein(1998)J./mm,/.141:4357-4362。[10]Campbell等，(2002)/"/e"^CfeJ21:S22陽S26。Guimaraes等，(2002)J/"/e"Z)^6:113-117。[12]Lagos等，(1998)丄朋c"351:1472-1476。Fernandez等，(2000)爿m/TrapMec//^g62:485-490。[14]Nicol等，(2002)尸W欣/"/e"/21:138扁141。[15]WO02/05846。韓國專利92-9729(1992-0009729)。[17]W093/24148。[18]WO03/066094。Beuvery等，(1986)Dev5Zo/Sto"d63:117-28。[20]Sesardic等，(2001)歷o/og/caAs29:107-22。[21]NIBSC代碼98/560。WHO的(f關(guān)7"^i^接辨系/y方菜游i資學基欲》(T^"m附朋o/og〖c"/6fl^/or/mmwwfeaft'onsen.eyXGalazka)白勺第1部分。[23]NIBSC代碼69/017。[24]NIBSC代碼DIFT。[25]Sesardic等，(2002)所o/og〖ca^30:49-68。[26]NIBSC代碼98/552。[27]NIBSC代碼TEFT。[28]NIBSC代碼66/303。Vanlandschoot等，(2005)■/GewMro/86:323-31。Ramsay等，(2001)Z朋cW357(9251):195-196。Lindberg(1999)F固'"e17增刊2:S28-36。Buttery和Moxon(2000)/KCoZ/P/^sici.a似Z^zc34:163-168。[33]Ahmad和Chapnick(1999)A/orA13:113-133，vii。Goldblatt(1998)乂Me《M/cra&o/.47:563-567。[35]歐洲專利0477508。[36]美國專利5,306,492。[37]W098/42721。(f錄凝度箭J1(To"乂wga,eJ^cc/"es」(Cruse等編)ISBN3805549326，尤其是第10巻48-114。Hermanson(1996)(f主激腐凝皮術(shù);；5/oco"乂wgate7k:/m々wMISBN:0123423368或012342335X。Armand等，(1982)/10:335-339。Cadoz等，(1985)F固'"e3:340-342。Jones(2001)C群Qp/"/騰甜g壓，2:47-49。Costantino等，(1992)Kacc/"e10:691-8。Lieberman等，(1996)275:1499-503。WO02/058737。WO03/0079S5。Rennels等，(2002)P^fe^/"/e"/21:978-979。[48]Campbell等，(2002)J/"/e"^Cfe186:1848-1851。W091/18926和美國專利5858677、5888517、5989828、6025484和6139846[50]Janson等，(1991)/"/ec"附mw"59:119-25。[51]WO00/56360。[52]WO99/42130。紐a7fec/.鄉(xiāng).&k594:51，1976?！憾榷仍O(shè),f卓泣^7^^/^展JYK。cc^eDew.g",77^^^wmYa"c^4/wvflW^^raac/i」(Powell和Newman編)PlenumPress1995(ISBN0-306陽44867-X)。[55]WO2004/110480。Sturgess等，(1999)Facc&e17:1169-1178。權(quán)利要求1.一種疫苗組合物，所述組合物包含(i)白喉類毒素‘D’；(ii)破傷風類毒素‘T’；(iii)細胞百日咳抗原‘wP’；(iv)乙肝病毒表面抗原‘HBsAg’；(v)偶聯(lián)到載體蛋白的b型流感嗜血桿菌(‘Hib’)莢膜糖；和(vi)至少一種偶聯(lián)到載體蛋白的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其中，所述b型流感嗜血桿菌莢膜糖和腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖各自偶聯(lián)到破傷風類毒素載體蛋白上。2.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述組分(vi)包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A和C的糖類。3.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述組分(iv)的偶聯(lián)物具有重量過量的載體，且糖類與載體的重量比在1:2和1:4之間。4.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述組分(iv)的偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)用溴化氰活化b型流感嗜血桿菌莢膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入己二酸酰肼間隔物以得到活化的糖；和(c)通過碳二亞胺縮合將活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白。5.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述組分(iv)的偶聯(lián)物包含具有以下結(jié)構(gòu)的接頭<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述組分(vi)的偶聯(lián)物是通過包括以下步驟的方法獲得的(a)將腦膜炎球菌莢膜糖氰化以得到氰酸酯；和(b)將氰酸酯直接偶聯(lián)到蛋白質(zhì)載體。7.如權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述腦膜炎球菌莢膜糖來自血清組8.如權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述腦膜炎球菌莢膜糖來自血清組c。9.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述組分(vi)的偶聯(lián)物包含OAc+腦膜炎球菌血清組C的莢膜糖。10.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述組分(vi)的偶聯(lián)物包含OAc-腦膜炎球菌血清組C的莢膜糖。11.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述組分(vi)的偶聯(lián)物包含腦膜炎球菌血清組A的莢膜糖，該糖中至少80%的甘露糖胺殘基在C-3位被O-乙酰化。12.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含8-12嗎/ml組分(iv)的偶聯(lián)物。13.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的單位劑量包含8-12|ig組分(iv)的偶聯(lián)物。14.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含8-12|ig/ml組分(vi)的偶聯(lián)物。15.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的單位劑量包含8-12pg組分(vi)的偶聯(lián)物。16.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗同時包含磷酸鋁佐劑和氫氧化鋁佐劑。17.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述HbsAg被吸附到磷酸鋁佐劑上。18.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述白喉類毒素被吸附到氫氧化鋁佐劑上。19.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述破傷風類毒素被吸附到氫氧化鋁佐劑上。20.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含汞防腐劑和2-苯氧乙醇防腐劑。21.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述白喉類毒素與破傷風類毒素的比例在2:1和3:1之間，以Lf單位測量。22.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述HbsAg是非糖基化的并為顆粒形式，所述顆粒包括含有磷脂和磷脂酰肌醇的脂質(zhì)基質(zhì)。23.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述HbsAg來自HBV亞型adw2。24.如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗以0.5ml的劑量給予患者。25.—種制備如上述權(quán)利要求中任一項所述的疫苗的方法，所述方法包括以下步驟(a)將三價D-T-Pw組分與單價HBsAg組分組合以得到四價D-T-Pw-HBsAg組分；(b)將Hib偶聯(lián)物與至少一種腦膜炎球菌偶聯(lián)物組合以得到混合的偶聯(lián)物組分；和(c)將四價D-T-Pw-HBsAg組分與混合的偶聯(lián)物組分混合以得到疫苗。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述三價D-T-Pw組分同時包含氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述三價D-T-Pw組分中的D和T組分被吸附到氫氧化鋁佐劑上。28.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述單價HBsAg組分被吸附到磷酸鋁佐劑上。29.如權(quán)利要求25-28中任一項所述的方法，其特征在于，所述混合的偶聯(lián)物組分未經(jīng)佐劑處理。30.如權(quán)利要求25-29中任一項所述的方法，其特征在于，所述三價D-T-Pw組分含有汞防腐劑。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述汞防腐劑是乙基汞硫代水楊酸鈉。32.如權(quán)利要求25-31中任一項所述的方法，其特征在于，所述混合的偶聯(lián)物組分不含汞防腐劑。33.如權(quán)利要求25-32中任一項所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含2-苯氧乙醇防腐劑，但三價D-T-Pw組分不含2-苯氧乙醇防腐劑。34.如權(quán)利要求25-33中任一項所述的方法，其特征在于，所述Hib偶聯(lián)物通過以下方法制備用l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺將Hib糖類偶聯(lián)到破傷風類毒素載體；然后除去N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)脲。35.如權(quán)利要求25-34中任一項所述的方法，其特征在于，所述腦膜炎球菌偶聯(lián)物通過以下方法制備用1-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶每*將腦膜炎球菌糖類偶聯(lián)到破傷風類毒素載體；然后除去4-二甲基氨基-吡啶。36.—種用于制備如權(quán)利要求l-24中任一項所述的疫苗組合物的試劑盒，該試劑盒中裝有(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含Hib和腦膜炎球菌偶聯(lián)物的第二組分，其中，所述兩種組分在分開的容器中。37.如權(quán)利要求36所述的試劑盒，其特征在于，所述第二組分中的偶聯(lián)物是凍干的。38.如權(quán)利要求36所述的試劑盒，其特征在于，所述第二組分包括乳糖、蔗糖和/或甘露醇。全文摘要已經(jīng)研究了包含(a)D-T-Pw-HepB-Hib抗原和(b)一種或多種腦膜炎球菌偶聯(lián)物抗原的疫苗。已經(jīng)公開了關(guān)于這些疫苗的許多改進和變化?？赏ㄟ^將以下兩種組分混合在一起來臨時制備疫苗(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一組分；和(b)包含Hib偶聯(lián)物和一種或多種腦膜炎球菌偶聯(lián)物的第二組分。文檔編號A61K39/095GK101184503SQ200680014588公開日2008年5月21日申請日期2006年3月16日優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日發(fā)明者D·曼努奇,M·肯托尼申請人:諾華疫苗和診斷有限公司