一種微生物用于降低人體腔內(nèi)三甲胺水平的應(yīng)用,尤其是用于治療三甲胺尿癥或細(xì)菌性 ...的制作方法
【專利說明】-種微生物用于降低人體腔內(nèi)三甲胺水平的應(yīng)用，尤其是 用于治療三甲胺尿癥或細(xì)菌性陰道炎以及預(yù)防心血管疾病
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物的應(yīng)用，在至少一個(gè)包含可以生成三甲胺（TM)的菌群的 人體腔（以下簡(jiǎn)寫為"人腔"）中，這些微生物可以進(jìn)行TM的代謝，從而降低人腔內(nèi)的TM 水平。
[0002] 本發(fā)明涉及所述微生物在腸道內(nèi)用于降低TM水平的應(yīng)用。本發(fā)明的目的尤其是 用于治療三甲胺尿癥，和/或降低氧化三甲胺（TMAO)的水平，從而有可能防止動(dòng)脈粥樣化 斑塊的形成，以及為預(yù)防心血管疾病提供另外的方法。
[0003] 本發(fā)明還涉及用來進(jìn)行TM的代謝的酶的原位遞送。
[0004] 三甲胺尿癥（或稱為TMAU、TMA引起的尿毒癥、或臭魚綜合征）是一種遺傳性疾 病，由于患者體內(nèi)一種酶的基因缺損（含黃素單氧化酶3, FM03)，肝臟內(nèi)的TM不能被有 效地轉(zhuǎn)化為ΤΜΑ0。而在某些病例中，這種轉(zhuǎn)化能力的缺損是陣發(fā)性的，后天獲得的。從而， 三甲胺在體內(nèi)大量蓄積，最終隨著汗液、尿液和呼出的氣體排出體外，并帶有濃重的魚腥臭 味。雖然沒有實(shí)際的研宄對(duì)此病的總體發(fā)病率進(jìn)行描述，但是推測(cè)美國人群中的發(fā)病率大 概就是1%這個(gè)數(shù)字。在下文中，這樣的人被確定為TM-代謝缺陷型患者。
[0005] 腸道內(nèi)TM來源于食物，主要是取決于轉(zhuǎn)化成TMO的效率，食物引入的膽堿或卵 磷酯（主要是蛋類、肉類、肝臟、小麥胚芽、魚類等）。這些物質(zhì)在腸道內(nèi)可被腸道菌群轉(zhuǎn)化 成三甲胺。
[0006] 此外，在具有活化的FM03酶的人群中，TM在肝臟內(nèi)被轉(zhuǎn)化為ΤΜΑ0,這種代謝物 會(huì)再出現(xiàn)在血流中。Wang等人.（《Nature》2011年第472卷7341期，第57-63頁；另見 《Nature》新聞與觀點(diǎn)，2011年第472卷，第40-41頁中K Rak和D J Rader的《心血管疾 病》(Cardiovascular Disease))的研宄發(fā)現(xiàn)，血液中循環(huán)的TMAOs可能造成動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈粥 樣化斑塊的形成，從而導(dǎo)致心臟疾病。
[0007] 細(xì)菌性陰道炎是女性發(fā)生在的一種良性病變，其發(fā)病原因是陰道內(nèi)微生物菌群失 衡。這種失衡是因?yàn)槿樗釛U菌菌群的減少，造成主要包含陰道加德納氏菌的厭氧菌群大量 繁殖。細(xì)菌性陰道炎的主要特征是陰道脫落物或分泌液呈灰白色且?guī)в行瘸粑?。這些陰道 脫落物或分泌液發(fā)出腥臭味道是由于其中包含TMA (Wolrath等人，《APMIS》2002年，第110 期，第819-824頁；另見Wolrath等人，《APMIS》2005年，第113期，第513-516頁）。
[0008] 本發(fā)明還涉及所述微生物在陰道內(nèi)的應(yīng)用，用來降低陰道分泌液的TM水平。本 發(fā)明的目的尤其在于處理細(xì)菌性陰道炎發(fā)生時(shí)的陰道分泌液，或治療由于局部TM生成引 起的任何紊亂或疾病，從而有可能減少陰道脫落物或分泌液散發(fā)的強(qiáng)烈腥臭的氣味。
[0009] 本發(fā)明的目的還在于一種新型的微生物，其可以用于上述應(yīng)用。
[0010] 產(chǎn)甲烷古菌是一種能在厭氧環(huán)境下產(chǎn)生甲烷的微生物。某些特定的古菌存在于動(dòng) 物的消化系統(tǒng)中，比如反芻類動(dòng)物；也存在于特定的人群中，特別是老年人。
[0011] 因此，B. Dridi (《國際微生物分類進(jìn)化學(xué)雜志》（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)，2012 年第 62 期，第 1902-1907 頁）的 研宄團(tuán)隊(duì)報(bào)告稱，他們分離出一種名為魯米葉甲燒馬賽里球菌（Methanomassiliicoccus luminyensis)的微生物，這種古菌可在4氣體環(huán)境中將甲醇還原為甲烷。文中還描述了這 種微生物不能在CO2氣體環(huán)境中利用三甲胺和一些其它底物生成甲烷。在A.Gorlas，《細(xì) 菌學(xué)雜志》（Journal of Bacteriology)，2012年9月，第194卷17期，第4745頁上公開 并提到了這種古菌的全部基因組序列，并且該基因組序列已經(jīng)被收錄進(jìn)GenBank數(shù)據(jù)庫， 登陸號(hào)碼從 CAJE01000001 到 CAJE01000026。
[0012] 目前，尤其是在人群中，能在體內(nèi)利用和進(jìn)行TM的代謝的微生物，特別是古菌， 還未見報(bào)道。
[0013] 發(fā)明人從取自人類個(gè)體的未脫鹽標(biāo)本中，成功鑒定出一種產(chǎn)甲烷古菌的新菌種， 該菌種包含編碼TM甲基轉(zhuǎn)移酶的基因（mttB基因）和編碼可以接受從TM轉(zhuǎn)移來的甲基 基團(tuán)的類咕啉蛋白的基因（mttC基因）。某些器官或者這些器官圍成的腔室，比如腸道、人 類的結(jié)腸或陰道，會(huì)出現(xiàn)存在氫氣的厭氧環(huán)境，在這種條件下，該菌種能進(jìn)行TM的代謝， 因此本發(fā)明建議利用這些微生物來進(jìn)行TM的代謝，從而降低其水平，尤其是降低其在腸 道內(nèi)和陰道內(nèi)的水平。進(jìn)一步的研宄發(fā)現(xiàn)，該古菌菌株還包含耐膽鹽的基因，特別是編碼膽 鹽水解酶的基因，從而促進(jìn)菌株存活，維持這種微生物在腸道內(nèi)的數(shù)量。這種微生物在下文 中被確定為菌株1，或者被稱為（Methanomethylophilus alvus)。發(fā)明人還確定了另外一 種魯米葉甲燒馬賽里球菌（Methanomassiliicoccus Iuminyensis)古菌菌株，該菌株曾經(jīng) 也被D. Didri等人.（如上所述）描述過，在下文中往往被稱為菌株2,它也包含編碼TMA甲 基轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼可以接受從TM轉(zhuǎn)移來的甲基基團(tuán)的類咕啉蛋白的基因，菌株2能 在腸道內(nèi)存在氫氣的環(huán)境下進(jìn)行TM的代謝。人們相信，TM的代謝生成了甲基化蛋白（甲 基化類咕啉蛋白），即該甲基化蛋白捕獲了 TM的甲基基團(tuán)。之后，這種甲基化蛋白很可能 進(jìn)入了甲烷生成的代謝通路，從而產(chǎn)生甲烷。
[0014] 顯然地，我們這里指的是能圍成腔室的某種器官，同樣也指的腔室本身，只要它包 含厭氧微生物菌群，進(jìn)而能產(chǎn)生或者生成TMA。也可以將這種器官或腔室稱為包含能利用微 生物菌群產(chǎn)生TM的器官或腔室。通常情況下，在氫氣源存在的條件下，由微生物的代謝生 成這種TM。
[0015] 因此，本發(fā)明的目的是一種組合物，其包含表達(dá)TMA甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物。根據(jù)上 述定義，這種微生物能在存在氫氣的上述人體器官或腔室環(huán)境內(nèi)，進(jìn)行三甲胺（TMA)的代 謝。所述組合物可用作一種藥物，用來處理、降低或者抑制人體器官和腔室中的TMA，和/或 用來治療以存在TM為特征的或由于其存在而引起的任何病變、煩惱或紊亂。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明所述的一種組合物，其包含表達(dá)TMA甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物，在至少一 個(gè)包含可生成TM的菌群的人體腔中，所述TM甲基轉(zhuǎn)移酶能夠在存在氫氣的條件下進(jìn)行 TM的代謝，因此可用作處理、降低或抑制人體腔內(nèi)的TM水平的藥物。
[0017] 根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含表達(dá)TM甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物，能 在存在氫氣的腸道環(huán)境內(nèi)進(jìn)行TM (TM)的代謝，因此可用作降低或抑制腸道和/或肝臟內(nèi) 的TM水平的藥物。
[0018] 更具體地，在第一個(gè)實(shí)施例中，所述應(yīng)用旨在治療三甲胺尿癥。接受治療的患者存 在TM代謝缺陷，特別是指那些缺少活化FM03酶的人群。
[0019] 在第二個(gè)實(shí)施例中，所述應(yīng)用旨在降低肝臟內(nèi)TM代謝物的水平，即ΤΜΑ0,尤其是 血漿中的ΤΜΑ0。這種應(yīng)用的目的還在于可能防止動(dòng)脈粥樣化斑塊的形成和/或預(yù)防心血管 疾病。目標(biāo)患者或者是有能力進(jìn)行TM的代謝的患者，或者是存在TM代謝缺陷但是通過 藥物可以重建TM轉(zhuǎn)化為TMAO代謝通路的患者。例如，如果在TM代謝通路的上游應(yīng)用本 發(fā)明的所述組合物，就可以限制肝臟生成ΤΜΑ0。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明所述組合物的應(yīng)用，TM代謝缺陷型患者有可能將下面這兩種效果結(jié) 合起來，一是進(jìn)行TMA的代謝或治療三甲胺尿癥，二是降低血漿TMAO含量，防止形成動(dòng)脈粥 樣化斑塊和/或預(yù)防心血管疾病。
[0021] 本發(fā)明的目的還在于一種組合物，其包含表達(dá)TM甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物，能在存 在氫氣的腸道環(huán)境內(nèi)代謝三甲胺（TMA)，用于治療三甲胺尿癥。
[0022] 因此，本發(fā)明的目的還在于一種組合物，其包含表達(dá)TM甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物，能 在存在氫氣的腸道環(huán)境內(nèi)進(jìn)行三甲胺（TMA)的代謝，用作降低血漿TMAO水平，防止形成動(dòng) 脈粥樣化斑塊和/或預(yù)防心血管疾病的藥物。
[0023] 根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含表達(dá)TM甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物，能 在存在氫氣的陰道環(huán)境內(nèi)代謝三甲胺（TMA)，目的是處理、降低或抑制存在于陰道內(nèi)或陰道 分泌液中的TM。
[0024] 特別地，盡管不希望受理論的限制，人們相信存在于陰道內(nèi)或陰道分泌液中的TMA 來源于陰道菌群對(duì)化合物的轉(zhuǎn)化，該化合物包含一個(gè)含氮基團(tuán)，而該含氮基團(tuán)會(huì)被三個(gè)甲 基取代。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述應(yīng)用旨在處理細(xì)菌性陰道炎發(fā)生時(shí)的陰道分泌液，以及減 少或抑制該陰道分泌液中因包含TM而產(chǎn)生的腥臭味。
[0026] 本發(fā)明的目的是保證所述的微生物能進(jìn)行TM的代謝，更優(yōu)選地，將TM的甲基轉(zhuǎn) 移給其它分子。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述微生物還能表達(dá)類咕啉蛋白，該類咕啉蛋白可作為甲基受 體。特別地，所述類咕啉蛋白是可以接受從TM轉(zhuǎn)移來的甲基基團(tuán)的類咕啉蛋白。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物包括含有編碼TM甲基轉(zhuǎn)移酶基因的微生物，該基 因包括序列1(SEQ ID N0:1)或序列2(SEQ ID N0:2)，或者是與其序列一致性高于90%的 等同序列（編碼能夠作用于TM的具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的基因序列），尤其是與序列1或序 列 2 的一致性達(dá)到 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的基因序列。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物包括含有編碼TM甲基轉(zhuǎn)移酶基因的微生物，該基 因包括序列3(SEQ ID N0:3)或序列4(SEQ ID N0:4)，或者是與其序列一致性高于90%的 等同序列（編碼能夠作用于TM的具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的基因序列），尤其是與序列3或序 列 4 的一致性達(dá)到 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的基因序列。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物包括含有編碼可以接受從TM轉(zhuǎn)移來的甲基基團(tuán)的 類咕啉蛋白基因的微生物，該基因包括序列5(SEQ ID N0:5)或序列6(SEQ ID N0:6)，或者 是與其序列一致性高于90%的等同序列（在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，編碼能捕獲TM的甲基并 接受甲基基團(tuán)的類咕啉蛋白的基因序列），尤其是與序列5或序列6的一致性達(dá)到90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的基因序列。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物包括含有編碼可以接受從TM轉(zhuǎn)移來的甲基基團(tuán)的 類咕啉蛋白基因的微生物，該基因包括序列7(SEQ ID N0:7)或序列8(SEQ ID N0:8)，或者 是與其序列一致性高于90%的等同序列（在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，編碼能捕獲TM的甲基并 接受甲基基團(tuán)的類咕啉蛋白的基因序列），尤其是與序列7或序列8的一致性達(dá)到90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物包括含有編碼TM甲基轉(zhuǎn)移酶基因的微生物，該基 因包括序列1(SEQ ID NO: 1)或如上所述的序列1的等同序列，還包含編碼可以接受從TMA 轉(zhuǎn)移來的甲基基團(tuán)的類咕啉蛋白基因序列，其包括序列5(SEQ ID N0:5)或如上所述的序列 5的等同序列。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物包括含有編碼TM甲基轉(zhuǎn)移酶基因的微生物，該基