一種橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種橙皮苷的用途，特別是涉及一種橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺 纖維化疾病藥物中的用途。 二、【背景技術(shù)】：
[0002] 肺纖維化（pulmonaryfibrosis，PF)是多種彌漫性間質(zhì)性肺疾病的共同病理改 變和最終結(jié)局，臨床主要表現(xiàn)為進行性呼吸困難，最終患者因呼吸困難而死亡。細胞外基質(zhì) (ECM)中膠原蛋白、彈性纖維以及蛋白糖類的過量堆積是其特征性的病理組織學(xué)變化。目 前，認(rèn)為成纖維細胞的增殖和活化是ECM大量形成和堆積的主要原因，肺泡上皮細胞的間 質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細胞的增生是成纖維細胞的主要來源。在有害刺激、細胞因子等的作用下， 成纖維細胞活化，分泌大量的ECM。在這些因素中，TGF-0是目前公認(rèn)的致纖維化因子，能 夠誘導(dǎo)肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞；促進成纖維細胞和肌成纖維細胞大量分泌ECM。 盡管對肺纖維化的發(fā)病機制有了更深入的認(rèn)識，但臨床治療仍然不能令人滿意。
[0003] 肺纖維化確診后平均存活時間為3年，或出現(xiàn)臨床癥狀后，存活5年。在肺纖維化 的終末階段，肺移植是唯一有效的治療方法。隨著近年患者數(shù)量的增加，導(dǎo)致合適的供體的 缺乏，此外昂貴的醫(yī)療費用和移植后出現(xiàn)的免疫排斥等副作用，限制了肺移植的應(yīng)用。糖皮 質(zhì)激素類、免疫抑制劑和細胞毒類藥物是目前治療肺纖維化的藥物，10-30%的接受糖皮質(zhì) 激素治療的患者顯示出一定的療效，但沒有完全或持續(xù)緩解者。而且這些藥物治療均存在 副作用嚴(yán)重、長期療效不能確定等問題。中藥能夠在一定程度上改善肺纖維化終末期患者 的生活質(zhì)量，但也存在藥理作用機制和作用靶點不明確問題，阻礙了其在臨床的選擇應(yīng)用。 因此，具有靶點和作用機制明確、長期服用安全可靠等特點的藥物開發(fā)，具有重要的意義。
[0004] 橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、防輻射、保護心血管系統(tǒng)等藥 理活性。橙皮苷對肺癌細胞的增殖有抑制作用，機制與干預(yù)細胞周期和誘導(dǎo)癌細胞的凋亡 有關(guān)。橙皮苷對肝纖維化有抑制作用，機制涉及TGF-e/Smad信號通路。另外，橙皮苷可用 于某些呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如急、慢性支氣管炎等。截至目前，尚無橙皮苷防治肺纖維化 方面的相關(guān)研宄報道。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾 病藥物中的用途。橙皮苷通過抑制肺成纖維細胞增殖、抑制肺泡上皮細胞的上皮_間質(zhì)轉(zhuǎn) 化、抑制肺成纖維細胞活化，具有防治肺纖維化的新用途。
[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0007] 本發(fā)明提供一種橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途。
[0008] 根據(jù)上述的橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途，所述橙皮 苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中時，抑制肺成纖維細胞活化或增殖的有效濃 度為 12. 5 ~200yM。
[0009] 根據(jù)上述的橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途，所述橙皮 苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中時，抑制肺泡上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的 有效濃度為25~IOOyM。
[0010] 根據(jù)上述的橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途，橙皮苷或 以橙皮苷為主要成分的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途。
[0011] 根據(jù)上述的橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途，所述藥物 組合物為按照藥學(xué)常規(guī)方法制備成的膠囊劑、滴丸劑、片劑或顆粒劑。
[0012] 本發(fā)明所述的橙皮苷是從蕓香科柑橘屬藥材如枳實、枳殼、柑橘、檸檬、葡萄柚、橘 紅、橙等中提取出來的；或者是通過化學(xué)方法合成的橙皮苷純品。
[0013] 本發(fā)明的橙皮苷還可以與現(xiàn)有技術(shù)中具有防治肺纖維化的中藥、西藥聯(lián)合使用。 包括但不限于丹參酮、川芎嗪、漢防己甲素、大黃素、恩替卡韋、維生素E和拉米夫定等。
[0014] 為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，以下結(jié)合橙皮苷的藥理試驗實例及其結(jié) 果，說明橙皮苷在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途。
[0015] 實驗例1:橙皮苷對人胚肺成纖維細胞（MRC-5)細胞增殖的影響
[0016] 1)材料與方法:MRC-5細胞購于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。MEM培養(yǎng) 基（由武漢博士德生物工程有限公司提供該產(chǎn)品）、胎牛血清（由浙江天杭生物科技股份有 限公司提供該產(chǎn)品）。
[0017] 3.OXIO3的MRC-5細胞加入到96孔板的板孔中，培養(yǎng)24小時。吸出原培養(yǎng)液， 加入含有不同濃度（12. 5yM、25yM、50yM、100yM、200yM)的橙皮苷的完全培養(yǎng)液，以加 入不含橙皮苷的完全培養(yǎng)液作為正常對照。繼續(xù)培養(yǎng)48小時，向每孔中加入20yL的含有 5mg/mL3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT)的磷酸鹽緩沖鹽水，培養(yǎng)6 小時后，吸出每孔的培養(yǎng)液，每孔加入200yL的二甲基亞砜（DMSO)。震蕩15分鐘，在490nm 波長，檢測各孔吸光度值，計算抑制率，即（對照組吸光度值-藥物組吸光度值）/對照組吸 光度值。
[0018] 2)實驗結(jié)果：詳見表1。與未加藥物組比較，100yM、200yM的橙皮苷組抑制率顯 著增加（P〈〇. 01)。
[0019] 表1橙皮苷對人胚肺成纖維細胞（MRC-5)增殖的抑制作用（[土S)
[0020]
[0021] a'b，與 0 組比較，aP〈0. 05,bP〈0. 01。
[0022] 3)實驗結(jié)論：橙皮苷對肺成纖維細胞增殖有抑制作用。
[0023] 實驗例2:橙皮苷對肺泡上皮細胞（A549)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
[0024] 1)材料與方法:A549細胞來自于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。 1^:>]\11-1640 培養(yǎng)基（136；[」;[1^301&1'13；[03。1611。6&了6。11110108700.，1^(1.)、胎牛血清（浙江 天杭生物科技股份有限公司）、人轉(zhuǎn)化生長因子I(HumanTGF-0 1，PeproTechInc); 纖維連接蛋白-I抗體（Fibronectin(FNl)antibody;貨號BA1771)、a-平滑肌肌動蛋 白抗體（asmoothmuscleactin(a_SMA)Antibody;貨號BM0002)和I型膠原蛋白抗體 (C0L1A1(CollagenI)Antibody;貨號BA0325)均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。 即用型SABC-POD(小鼠IgG)試劑盒（貨號SA1021)、即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒（貨 號SA1022)均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。
[0025] 在24孔培養(yǎng)板的每個孔中加入玻璃片，然后在每個玻璃片上加入IXIO4細胞。將 培養(yǎng)板放入5%C02、37°C培養(yǎng)箱中，使細胞貼壁于玻璃片。2小時取出培養(yǎng)板，更換不含血 清的RPM1-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8小時。吸除培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液；分為5組，即正 常組（加入RPM1-1640完全培養(yǎng)液）、TGF-M刺激組簡稱TGF-M組（加入含有5ng/mL TGF- 0 1的RPM1-1640完全培養(yǎng)液）、藥物干預(yù)組（加入含有5ng/mLTGF- 0 1的RPM1-1640 完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)液分別含有25yM、50yM、100yM的橙皮苷提取物），繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0026]Fibronectin-I(FN)、a-SMA和Collagen-I檢測：取出細胞培養(yǎng)液后，每孔加入 4%的多聚甲醛溶液，固定然后取出孔中的玻璃片，按照試劑盒說明書分別進行FN、a-SM 和Collagen-I免疫細胞化學(xué)染色。分析上述蛋白表達，結(jié)果以陽性表達的累積光密度數(shù)值 (IOD)/細胞的面積（Area)表示。
[0027] 2)實驗結(jié)果：詳見表2。肺泡上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征性表現(xiàn)，是細胞特異性蛋白表 達的變化，特別是間質(zhì)細胞特異性蛋白如FNXollagen-I和a-SMA表達量的增加。與正常 組比較，了6?-0 1組？1^顯著升高（?〈〇.〇1)，(]〇1138611-1顯著升高（?〈〇.〇1)，(3-5敵顯著升 高（P〈0?01)。與TGF-(6l組相比，25yM橙皮苷組FN顯著降低（P〈0?05)，25yM、50yM和 100UM橙皮苷組Collagen-I均顯著降低（P〈0. 05或P〈0. 01)，25yM橙皮苷組a-SMA顯著 降低（P〈〇. 01)。
[0028] 表2橙皮苷對TGF-M誘導(dǎo)A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響（I± .s'