專利名稱：用于治療纖維化疾病或病癥的組合物的制作方法
用于治療纖維化疾病或病癥的組合物相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本專利申請(qǐng)要求于2008年6月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/074，492的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)的全文以引用方式并入本文中。
背景技術(shù)：
纖維化是由于長(zhǎng)期受損傷而可能在多種不同組織中發(fā)生的復(fù)雜疾病。纖維化的特征通常在于成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞增殖的異常增加，以及膠原和其它細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)成分的過(guò)量沉積。最終，這些變化可能破壞受影響器官的正常結(jié)構(gòu)和功能，如在慢性間質(zhì)性肝炎、肺間質(zhì)纖維化(IPF)、系統(tǒng)性硬化病(硬皮病)中的皮膚和器官、移植排斥反應(yīng)、充血性心力衰竭中的心臟以及許多其它疾病中所發(fā)生的那樣。常規(guī)的治療涉及使用皮質(zhì)甾類藥物和免疫抑制劑類藥物，這些藥物對(duì)于逆轉(zhuǎn)或防止纖維化的發(fā)展效果很低，或者沒(méi)有效果(Wynn，2007)。由于內(nèi)在病理的復(fù)雜性，已經(jīng)提出了各種治療干預(yù)方案。已經(jīng)提出減少膠原原纖維的合成、分泌或聚合可能對(duì)于減慢纖維發(fā)生是有效的。另一類解決方案是增強(qiáng)膠原酶的活性，以試圖破壞過(guò)量的ECM，而其它方案已經(jīng)提出中和或抵抗促進(jìn)膠原合成的細(xì)胞因子的策略，如β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(“TGF-β ”)。幾種公認(rèn)的抗纖維化劑已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試，但是其并沒(méi)有真正顯示出推遲纖維化的效力。據(jù)認(rèn)為，在導(dǎo)致纖維化的發(fā)生和發(fā)展的因素中，受傷部位的淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞/成肌纖維細(xì)胞的增多(Hinz等，2007)以及TGF-β的誘導(dǎo)(Wells 2000 ；Verrecchia 和Mauviel，2007)是關(guān)鍵的。因此，能夠使成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞正常移動(dòng)到受傷組織和/或調(diào)節(jié)TGF-β的功能的藥物對(duì)于治療纖維化是特別有用的。發(fā)明概述因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種治療患者內(nèi)的纖維化疾病或病癥的方法， 包括給該患者施用諾斯卡品和藥用載體。在一些實(shí)施方案中，纖維化疾病或病癥得到推遲； 在一些實(shí)施方案中，纖維化疾病或病癥得到減輕。在另一方面中，本發(fā)明提供了治療纖維化疾病的方法，包括施用以下藥物組合物， 該藥物組合物包含諾斯卡品(包括其變體)以及一種、兩種、三種或更多種抗纖維化劑，所述抗纖維化劑包括(但是不限于)ACE抑制劑、抗炎劑、吡非尼酮(Pirfenidone)、格列衛(wèi) (Gleevec)和波生坦(Bosentan)。該藥物組合物還可包含藥用載體。這種治療可使得纖維化疾病癥狀的發(fā)作得到推遲或者纖維化疾病癥狀的嚴(yán)重程度得到減輕。附圖簡(jiǎn)述

圖1示出在施用單獨(dú)劑量的博萊霉素(1. 5U/kg，經(jīng)口施用)2周后，新膠原的合成情況(標(biāo)記羥基脯氨酸(OHP)百分比或“f”)。在施用博萊霉素同一天開(kāi)始施用諾斯卡品 (ip)，并且持續(xù)2周。N = 4/組；數(shù)據(jù)以平均值+SD表示；*p < 0. 05 ；進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行Durmett檢驗(yàn)，以與博萊霉素/載劑進(jìn)行比較。圖2示出在施用單獨(dú)劑量的博萊霉素(1. 5U/kg，經(jīng)口施用)2周后，經(jīng)氯胺_t分析測(cè)量，每個(gè)肺的OHP的絕對(duì)量。在施用博萊霉素同一天開(kāi)始施用諾斯卡品，并且持續(xù)2周。 N = 4-5/組；數(shù)據(jù)以平均值+SD表示；*p < 0. 05 ；依次進(jìn)行單因素ANOVA和Dunnett檢驗(yàn)， 以與博萊霉素/載劑對(duì)照組或諾斯卡品治療組(30mg/kg和100mg/kg)進(jìn)行比較。圖3示出在施用單獨(dú)劑量的博萊霉素(1. 5U/kg，經(jīng)口施用)2周后，每個(gè)肺的新合成的膠原的絕對(duì)量(以fx
的方式計(jì)算)。與載劑對(duì)照組或諾斯卡品治療組相比，博萊霉素增加了肺內(nèi)新合成的膠原的絕對(duì)量。N = 4-5/組；數(shù)據(jù)以平均值+SD表示；*p <0.05； 進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行Durmett檢驗(yàn)，以與博萊霉素/載劑對(duì)照進(jìn)行比較。圖4示出由施用單獨(dú)劑量的博萊霉素(1.5U/kg;經(jīng)口施用；和以上圖1-3中使用相同的動(dòng)物)2周后的小鼠的肺獲得的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SM)陽(yáng)性肺細(xì)胞的代表性載玻片和半定量分析。博萊霉素顯著增加肺內(nèi)存在的含有成肌纖維細(xì)胞的激活α-SMA的數(shù)量。諾斯卡品顯著降低由博萊霉素激活的成肌纖維細(xì)胞的數(shù)量。N = 4-5/組；數(shù)據(jù)以平均值+SD表示；*ρ < 0. 05 ；進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行Durmett檢驗(yàn)，以與博萊霉素/載劑對(duì)照進(jìn)行比較。圖5示出施用單獨(dú)劑量的博萊霉素(1. 5U，經(jīng)口施用)2周后的新膠原的合成情況 (標(biāo)記OHP百分比或“f”)。在施用博萊霉素同一天開(kāi)始施用300mg/kg的諾斯卡品(經(jīng)口施用)，并且持續(xù)2周。N = 10/組；數(shù)據(jù)以平均值+SD表示；*p < 0. 05 ；依次進(jìn)行單因素 ANOVA和Durmett檢驗(yàn)，以與博萊霉素/載劑進(jìn)行比較。圖6示出施用單獨(dú)劑量的博萊霉素(1. 5U，經(jīng)口施用)2周后的新膠原的合成情況 (標(biāo)記OHP百分比或“f”)。在施用博萊霉素同一天開(kāi)始通過(guò)飲食以產(chǎn)生大致300mg/kg的劑量的濃度施用諾斯卡品，并且持續(xù)2周。諾斯卡品傾向于降低新OH-P的百分比，但是其效果并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。N = 5/組；數(shù)據(jù)以平均值+SD表示。圖7示出在單獨(dú)或與諾斯卡品組合施用(經(jīng)口施用)ANIT之后肝內(nèi)新膠原的合成情況(標(biāo)記OHP百分比或“f”)。在劑量為30和100mg/kg的條件下，諾斯卡品顯著降低ANIT誘導(dǎo)的OHP增加。N = 5/組；數(shù)據(jù)為平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ；進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行 Dunnett檢驗(yàn)，以與ANIT/載劑多個(gè)對(duì)比組進(jìn)行比較。圖8示出在單獨(dú)或與諾斯卡品組合施用(經(jīng)口施用)ANIT之后肝內(nèi)OHP的絕對(duì)量。 諾斯卡品顯著降低ANIT誘導(dǎo)的OHP含量增加。N = 5/組；數(shù)據(jù)為平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ； 進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行Durmett檢驗(yàn)，以與ANIT/載劑對(duì)照進(jìn)行多個(gè)比較。圖9示出與施用常規(guī)的食物相比，在單獨(dú)或與諾斯卡品組合施用(經(jīng)口施用)ANIT 之后肝內(nèi)新合成膠原的絕對(duì)量(以fx
的方式計(jì)算)。在經(jīng)口施用30和100mg/kg的條件下，諾斯卡品顯著降低ANIT誘導(dǎo)的膠原合成增加。N= 5/組；數(shù)據(jù)為平均值+SD ;*p < 0. 05 ；進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行Durmett檢驗(yàn)，以與ANIT/載劑對(duì)照進(jìn)行比較。圖10示出在與圖7、8和9相同的動(dòng)物中，組織學(xué)測(cè)量的膠原含量(馬森三色染色劑)的代表性載玻片和半定量分析。諾斯卡品顯著降低ANIT誘導(dǎo)的膠原含量。數(shù)據(jù)為平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ；進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行Durmett檢驗(yàn)，以與ANIT/載劑對(duì)照進(jìn)行比較。圖11示出諾斯卡品對(duì)ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膠原合成增加的效果。諾斯卡品在飲食中以2g/kg的濃度施用，以產(chǎn)生大致300mg/kg的劑量，假設(shè)20g的小鼠每天食用3g的食物。 N = 5/組；數(shù)據(jù)為平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ；進(jìn)行AN0VA，隨后進(jìn)行Durmett檢驗(yàn)，以與ANIT/ 載劑對(duì)照進(jìn)行比較。
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圖12示出諾斯卡品對(duì)ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)膠原合成增加的效果。諾斯卡品以300mg/ kg的劑量每天經(jīng)口填胃一次；N = 5/組；數(shù)據(jù)以平均值+SD表示。圖13示出諾斯卡品以及諾斯卡品類似物的結(jié)構(gòu)。發(fā)明詳述除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)施采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)均屬于本領(lǐng)域內(nèi)的技能。這些技術(shù)在以下文獻(xiàn)中具有充分闡釋，所有這些文獻(xiàn)中的所需技術(shù)均以引用的方式并入本文，所述文獻(xiàn)例如為Molecular Cloning :A Laboratory Maniml，第二版(Sambrook 等，1989) Cold Spring Harbor Press ；OligonucleotideSynthesis(Μ. J. Gait 等，1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook (J. E.CeIMs, ed.,1998)Academic Press ；Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed.,1987)； Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 禾口 P. E. Roberts,1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture :LaboratoryProcedures(A. Doyle, J. B. Griffiths 禾口 D. G. Newell, eds. ,1993-8)J. Wiley 禾口 Sons ;Methods in Enzymology(Academic Press 公司)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir 禾口 C. C. Blackwel 1, eds. ) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller 禾口M. P. Calos,eds. ,1987) ；Current Protocols in MolecularBiology (F. M. Ausubel 等，eds. , 1987) :PCR :The Polymerase ChainReaction,(MuIMs等，eds.,1994) ；Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 等，eds. , 1991) ；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；以及 Mass isotopomer distribution analysisat eight years theoretical, analytic and experimental considerations,Hellerstein 禾口 Neese 著(Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39)E1146-E1162，1999)。此外，除非另外說(shuō)明，否則通常根據(jù)制造商限定的規(guī)程進(jìn)行采用市售可得的分析試劑盒和試劑的程序。最近的體外研究已經(jīng)表明，微管(MT)動(dòng)力學(xué)在纖維化發(fā)生中可能起到以前未認(rèn)識(shí)到的作用。雖然MT并不是對(duì)于所有細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)都是必需的，但是MT的適當(dāng)功能似乎對(duì)于引導(dǎo)諸如成纖維細(xì)胞等大細(xì)胞的定向遷移是重要的。極低濃度的抑制MT動(dòng)力學(xué)的化合物就顯著降低大細(xì)胞能夠遷移到受傷部位內(nèi)的速率(Liao等，19%)。這可能是進(jìn)入受損組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞/成肌纖維細(xì)胞增多的重要因素。此外，MT通過(guò)與Smad2、Smad3和Smad4 形成復(fù)合物，從而在TGF- β /Smad信號(hào)傳導(dǎo)中提供負(fù)反饋環(huán)路，由此使rSmad與TGF- β受體隔離(Dong等，2000)。TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)及其在誘導(dǎo)纖維化中的重要性在許多出版物中有所綜述(Wells 2000 ；Verrecchia 和 Mauviel，2007)。諾斯卡品是一種口服活性藥物，其與微管蛋白結(jié)合，并且改變其構(gòu)型，從而改變MT 的解離/再組裝循環(huán)(即動(dòng)力學(xué))的速率( 等，1998)，而不影響微管蛋白的總聚合物質(zhì)量或者導(dǎo)致較大的MT變形ahou等，2002)。最近報(bào)導(dǎo)，以前用作鎮(zhèn)咳藥(Empey等，1979) 的諾斯卡品為一種對(duì)正常組織具有較低毒性或抑制免疫應(yīng)答的有效抗癌藥(Ke等，2000 ； Zhou等，2003)。已經(jīng)表明諾斯卡品有益于治療中風(fēng)，這可能是源于其能夠阻斷緩激肽活性的能力(Mahmoudian等，200 。諾斯卡品是得自鴉片的非麻醉類苯酞異喹啉生物堿。然而， 諾斯卡品不具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和呼吸抑制性能，并且不會(huì)誘導(dǎo)過(guò)度興奮或依賴性。在臨床試驗(yàn)中，諾斯卡品似乎被良好地耐受(Mahmoudian等，200；3)。此外，在本發(fā)明公開(kāi)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)
5諾斯卡品能有效地治療纖維化疾病或病癥。因此，本發(fā)明公開(kāi)提供用于治療纖維化疾病或病癥的制劑和方法。本發(fā)明涉及用于治療各種纖維化疾病或病癥的方法和組合物。在本文中，“治療” 包括推遲癥狀的發(fā)作或嚴(yán)重程度、延緩死亡和減輕癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療纖維化疾病或病癥的方法，包括向需要治療的患者施用含有諾斯卡品或其鹽的藥物組合物?！袄w維化疾病”是指具有以下特征的疾病或病狀與未患病的對(duì)照相比，在器官或組織中纖維結(jié)締組織增多，如膠原或其它細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)成分增多。“纖維化疾病”或病癥包括(但是不限于)肝硬變、充血性心力衰竭、纖維化肺病、光老化、胰腺和肺的囊腫纖維化、注射纖維化(其可能作為肌內(nèi)注射的并發(fā)癥發(fā)生)、心內(nèi)膜心肌纖維化、肺的特發(fā)性肺部纖維化、縱膈纖維化、骨髓纖維變性、腹膜后纖維化、進(jìn)行性大塊纖維化(煤礦工人肺塵癥的一種并發(fā)癥)、神原型系統(tǒng)纖維化、硬皮病、腎臟纖維化、與器官移植物相關(guān)的纖維化、傷疤、燒痕等(還請(qǐng)參見(jiàn)美國(guó)專利7，449，171和美國(guó)專利申請(qǐng)序列No. 11/064，197中對(duì)于纖維性疾病或病癥的討論，其全文以引用的方式并入本文)。如下進(jìn)一步所述，一個(gè)實(shí)施方案采用諾斯卡品作為治療劑。諾斯卡品的結(jié)構(gòu)如圖 13所示?！爸Z斯卡品”包括諾斯卡品類似物和/或衍生物，如在美國(guó)專利No. 6，376，516中所述的那樣，該專利的全文中與諾斯卡品類似物及其制備方法有關(guān)的具體內(nèi)容以引用的方式并入本文。優(yōu)選的諾斯卡品類似物如圖13所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本文所公開(kāi)的方法，諾斯卡品與其它藥劑(優(yōu)選其它抗纖維化劑)組合使用。優(yōu)選的藥劑包括(但是不限于)血管緊縮素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、抗炎劑、吡非尼酮、格列衛(wèi)或波生坦。ACE抑制劑根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可分為三組含巰基的藥劑，如卡托普利(商品名 Capoten)和佐芬普利(Zofenopri 1)。其它藥劑包括含二羧酸酯的藥劑。這是最大的一組， 包括依那普利(Vasotec/悅寧定)、雷米普利(Altace/tritace/Ramace/Ramiwin)、奎那
禾Ij (Accupril)、口；|禾Ij (Coversyl/Aceon)、1 禾Ij (Lisodur/Lopril/Novatec/ I^rinivil/Zestril)、貝那普利(Lotensin)。最后，其它ACE抑制劑包括含有磷酸酯的藥劑， 如福森普利(Monopril)?？寡讋┌惞檀碱惢蚍穷惞檀碱惪寡姿幬?NSAIDS)。優(yōu)選的抗炎劑包括(但不限于)糖皮質(zhì)激素、阿司匹林、布洛芬和萘普生。制劑在治療纖維化疾病或病癥的治療應(yīng)用中，將本發(fā)明的醫(yī)藥方法中所用的化合物以適合于實(shí)現(xiàn)治療成效的劑量水平施用給診斷患有纖維化疾病或病癥、或者處于發(fā)展為纖維性疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的患者?！爸委煶尚А笔侵富衔锏氖┯秒S著時(shí)間而在患者內(nèi)產(chǎn)生有益效果。可以由體外分析或動(dòng)物模型確定適用于施用給人類的初始劑量。例如，可以將初始劑量調(diào)配為產(chǎn)生這樣的血漿濃度，經(jīng)體外分析測(cè)量，該血漿濃度包括所施用化合物的特定代謝活性劑的IC50?；蛘?，用于人類的初始劑量可以基于確定在患有纖維性疾病或病癥的動(dòng)物模型(如博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維性小鼠模型)中有效的劑量。作為一個(gè)例子，本文所述藥物組合物中的各成分的初始劑量可以在約0. 01mg/kg/天至約3000mg/kg/天、或約
60. lmg/kg/ 天至約 2000mg/kg/ 天、或約 lmg/kg/ 天至約 2000mg/kg/ 天或約 10mg/kg/ 天至約2000mg/kg/天、或約100mg/kg/天至約2000mg/kg/天的范圍內(nèi)，或者也可以使用約 1000mg/kg/天至約2000mg/kg/天的劑量。然而，劑量可以根據(jù)患者的要求、待治療病癥的嚴(yán)重程度和所用化合物的變化而改變。還通過(guò)隨著在特定的患者內(nèi)施用特定的化合物而伴隨的各種副作用的產(chǎn)生、性質(zhì)和程度來(lái)確定劑量的水平。確定特定情況的合適劑量在執(zhí)業(yè)醫(yī)生的技能范圍內(nèi)。通常，以少于化合物的最優(yōu)劑量的較小劑量開(kāi)始治療。隨后，以小的增量增加劑量，直到達(dá)到該情況下的最優(yōu)效果。為了方便起見(jiàn)，如果需要的話，可以將每天的總劑量在日內(nèi)分份施用。藥物組合物中的活性化合物的濃度取決于該藥物的吸收、分布、失活和分泌速率以及本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的其它因素。還應(yīng)當(dāng)注意，劑量值也會(huì)隨著待減輕病癥的嚴(yán)重程度而改變。還應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于任何特定的對(duì)象，應(yīng)當(dāng)根據(jù)個(gè)體需要以及施用組合物或者監(jiān)管組合物的施用的個(gè)人的專業(yè)判斷，隨著時(shí)間而調(diào)整具體的劑量方案，并且本文所述的濃度范圍僅是示例性的，并且無(wú)意于限制所要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵤?。可以同時(shí)施用各活性成分，或者也可以將其分為多個(gè)以不同的時(shí)間間隔施用的小劑量。適用于經(jīng)口施用的制劑可以包括(a)液體溶液，如懸浮在稀釋劑(如水、鹽水或 PEG400)中的有效量的化合物；(b)膠囊、袋劑或片劑，其分別含有液體、固體、顆粒或凝膠形式的預(yù)定量的活性成分；(c)在合適的液體中的懸浮液和(d)合適的乳液。片劑形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠態(tài)二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸和其它賦形劑中的一種或多種，著色劑，填料，粘結(jié)劑，稀釋劑，緩沖劑，潤(rùn)濕劑，防腐劑，調(diào)味劑，染料、崩解劑和藥學(xué)相容的載體。錠劑形式可包括處于調(diào)味劑(例如蔗糖)中的活性成分，以及含有處于惰性基質(zhì)(如明膠和甘油)中的活性成分，或者除了活性成分外，還含有本領(lǐng)域已知的載體的蔗糖和阿拉伯膠乳、凝膠等?？诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可被包封在明膠膠囊中或者壓縮成片劑。為了進(jìn)行經(jīng)口治療施用，活性化合物可與賦形劑組合，并且以片劑、錠劑或膠囊的形式使用?？梢园帉W(xué)相容的粘結(jié)劑和/或輔助材料作為組合物的一部分?；钚曰衔锘蚱淇伤幱玫柠}可以作為酏劑、懸浮液、糖漿、包藥干糊片、口香糖等的成分施用。糖漿除了含有活性化合物之外，還含有作為甜味劑的蔗糖和某些防腐劑、染料和著色劑與調(diào)味劑?；钚曰衔锘蚱淇伤幱玫柠}還可以與不損害所需作用的其它活性材料混合，或者與補(bǔ)充所需作用的材料混合。如本文所用，術(shù)語(yǔ)可藥用的鹽是指保持上述化合物的所需生物活性并且表現(xiàn)出最低或沒(méi)有不期望的毒性效應(yīng)的鹽。所述鹽的例子包括(但不限于)與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、 氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成鹽和與有機(jī)酸形成的鹽，所述有機(jī)酸例如為乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、雙羥萘酸、褐藻酸、聚谷氨酸、 萘磺酸、萘二磺酸和半乳糖醛酸。所述化合物還可以作為本領(lǐng)域內(nèi)已知的可藥用的季鹽施用，所述季鹽具體包括由式-NR+Z-表示的季銨鹽，其中R為氫、烷基或芐基，并且Z為平衡離子，其包括氯離子、溴離子、碘離子、-0-烷基、甲苯磺酸根、甲基磺酸根、磺酸根、磷酸根或羧酸根(如苯甲酸根、琥珀酸根、乙酸根、乙醇酸根、馬來(lái)酸根、蘋果酸根、檸檬酸根、酒石酸根、抗壞血酸根、苯甲酸根、肉桂酸根、扁桃酸根、苯氧酸根和二苯乙酸根)。
可以將所選的化合物單獨(dú)或者與其它合適的成分組合制成氣溶膠制劑(即，可以將它們“噴成霧狀”)，以通過(guò)吸入施用?？梢詫馊苣z制劑置于加壓的可用拋射劑中，所述拋射劑例如為二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾?。?jīng)直腸施用的合適制劑包括(例如)栓劑，其由封裝的核酸與栓劑基質(zhì)構(gòu)成。合適的栓劑基質(zhì)包括天然或合成的三甘油酯或石蠟烴。此外，還可以使用明膠直腸膠囊，其由所選的化合物組合與基質(zhì)的組合構(gòu)成，所述基質(zhì)包括(例如)液體三甘油酯、聚乙二醇和石蠟烴。適合于腸胃外施用(例如，通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)內(nèi))、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑施用)的制劑包括水性和非水性的等滲滅菌注射溶液，該溶液可包含抗氧化劑、 緩沖劑、抑菌劑和使得該制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的滅菌懸浮液，其可以含有懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在本發(fā)明的實(shí)踐中，可以通過(guò)(例如)靜脈輸注、經(jīng)口施用、局部施用、腹膜內(nèi)施用、膀胱內(nèi)施用或胸內(nèi)施用來(lái)施用所述組合物。腸胃外施用、經(jīng)口施用、皮下施用和肌內(nèi)施用是優(yōu)選的施用方法。合適的溶液制劑的具體例子可以包含約0. l-100mg/ml的化合物和約1000mg/ml在水中的丙二醇。合適的溶液制劑的另一個(gè)具體例子可包含約0. 1或約0. 2至約100mg/ml的化合物和約800_1000mg/ ml在水中的聚乙二醇400 (PEG 400)。合適的懸浮液制劑的具體例子可包含約0. 2-30mg/ml的化合物和一種或多種選自由以下物質(zhì)組成的組中的賦形劑在水中的約200mg/ml的乙醇、約1000mg/ml的植物油 (例如，玉米油)、約600-1000mg/ml的果汁(例如，葡萄汁)、約400_800mg/ml的牛奶、約 0. lmg/ml羧甲基纖維素(或微晶纖維素)、約0. 5mg/ml芐醇(或芐醇和苯扎氯銨的組合) 和約40-50mM的pH值為7的緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，或者可以使用5%的葡萄糖代替緩沖液)。合適的脂質(zhì)體懸浮液制劑的具體例子可以包含在水中的約0. 5-30mg/ml的化合物、約100-200mg/ml的卵磷脂(或其它磷脂或磷脂混合物)、和可任選的約5mg/ml的膽固醇。對(duì)于皮下施用化合物，以下脂質(zhì)體懸浮液制劑提供良好的效果，所述制劑包含在水中的 5mg/ml的化合物以及100mg/ml的卵磷脂，和在水中的5mg/ml的化合物以及100mg/ml的卵磷脂和5mg/ml的膽固醇。化合物的制劑可以提供在單位劑量或多劑量密封容器(如安瓿和小瓶)內(nèi)。注射溶液和懸浮液可以由上述的滅菌粉末、顆粒和片劑制備。藥物制劑優(yōu)選為單位劑型。在一些形式中，制劑被細(xì)分為含有適量的化合物的單位劑量。單位劑型可以為包裝制劑，該包裝含有單獨(dú)量的制劑，如包裝片、膠囊和處于小瓶或安瓿內(nèi)的粉末。此外，單位劑型可以為膠囊、片劑、扁囊劑或錠劑本身，或者其可以為合適數(shù)量的包裝形式的任意這些劑型。如果需要的話，組合物還可以含有以下更詳細(xì)地討論的其它相容性治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物與防止該化合物從體內(nèi)快速消除的載體一起制備，如控釋制劑，其包括植入劑和微囊化遞送系統(tǒng)。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備上述制劑的方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。材料還可以商購(gòu)自Alza公司(CA)和Gilford Pharmaceuticals公司(Baltimore，Md.)。脂質(zhì)體懸浮劑還可以是可藥用的載體。可以根
8據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備這些制劑，例如美國(guó)專利No. 4，522，811(其全文以引用的方法并入本文中)所述的方法。例如，可以通過(guò)以下方法制備脂質(zhì)體制劑將合適的脂質(zhì)(如硬質(zhì)酰磷脂酰乙醇胺、硬質(zhì)酰卵磷脂、花生酰卵磷脂和膽固醇)溶解在無(wú)機(jī)溶劑中，然后將其蒸發(fā)，從而在容器的表面留下干燥脂質(zhì)的薄膜。然后可以將活性化合物或其單磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液加入到容器內(nèi)。然后用手旋動(dòng)容器，以使脂質(zhì)材料脫離容器的側(cè)面，并且分散脂質(zhì)團(tuán)聚體，從而形成脂質(zhì)懸浮液。

因此，本文所述的組合物在治療纖維化病癥方面得到應(yīng)用。受損組織的修復(fù)是存活所需的根本生物過(guò)程。然而，在重復(fù)或長(zhǎng)期受損傷的情況下，修復(fù)過(guò)程可能變得異常，并且ECM蛋白可能積聚到病理水平。在本文所述的實(shí)驗(yàn)中，組織受損由不同藥劑導(dǎo)致肺內(nèi)的博萊霉素和肝內(nèi)的ANIT。這些模型的共同點(diǎn)在于刺激物顯著地使組織膠原的合成增加到超過(guò)在非治療對(duì)照中獲得的水平。這些效應(yīng)反映在總膠原池以及在組織內(nèi)合成的新膠原的絕對(duì)量的增加。在這兩種模型中，諾斯卡品劑量依賴性地阻止新膠原合成的增加(包括分?jǐn)?shù)增加和絕對(duì)增加)，以及阻止組織內(nèi)存在的膠原的總量的增加。諾斯卡品在這些實(shí)驗(yàn)中具有2個(gè)所關(guān)注的主要藥理活性。諾斯卡品是MT調(diào)節(jié)劑 (Ye等，1998)，以及緩激肽拮抗劑(Mahmoudian等，2001)。不受理論的束縛，這種活性的組合可能使得諾斯卡品成為用于治療纖維化的特別關(guān)注的新藥劑。在正常的創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，受損的上皮細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞釋放介體，以激活成纖維細(xì)胞。當(dāng)成纖維細(xì)胞遷移到創(chuàng)傷時(shí)，其轉(zhuǎn)化為表達(dá)成肌纖維細(xì)胞的α -SMA，所述成肌纖維細(xì)胞在病理組織改造中具有關(guān)鍵的作用(參見(jiàn)Hinz等，2007)。當(dāng)大細(xì)胞發(fā)生遷移時(shí)，MT 的動(dòng)力學(xué)性能允許MT網(wǎng)絡(luò)再改方位。不受理論的束縛，據(jù)認(rèn)為，由于諾斯卡品降低MT的動(dòng)力性能，因此其可減少諸如成纖維細(xì)胞等細(xì)胞移動(dòng)到受傷部位。Liao(等人，19%)在體外發(fā)現(xiàn)，干擾MT動(dòng)力學(xué)、而不是細(xì)胞內(nèi)MT的實(shí)際水平的低濃度物質(zhì)(如諾考達(dá)唑)降低成纖維細(xì)胞遷移到成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的受傷部位的速率。然而，以前在體內(nèi)還沒(méi)有證實(shí)MT調(diào)節(jié)劑(如諾斯卡品)的抗纖維化效果。MT在負(fù)調(diào)節(jié)TGF- β /Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑方面也可具有重要作用。Liu (等人，2005) 在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，低濃度的MT干擾劑(紫杉醇)在患硬皮病的裸鼠模型中顯著抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)。紫杉醇顯著降低Smad2和Smad3磷酸化，并且減少膠原在Sk移植物內(nèi)的沉積 (Liu等，2005)。TGF-β Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑與纖維化的誘導(dǎo)具有因聯(lián)(參見(jiàn)Wells，2000 ； Verrecchia和Mauviel，2007)。例如，TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞具有趨藥性，并且誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成ECM，同時(shí)還增加防止ECM的酶破壞的蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生。TGF-β調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能，并且增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制平滑肌細(xì)胞凋亡。在體外的低濃度下，所有MT干擾劑均破壞MT動(dòng)力學(xué)，但是這些藥劑在不同的結(jié)合部位對(duì)微管作用，這使得它們具有不同的效果(Jordan，20(^)。MT干擾劑分為兩個(gè)大類抑制MT聚合的化合物，如秋水仙堿、諾考達(dá)唑和長(zhǎng)春堿；以及促進(jìn)MT聚合的化合物，如紫杉烷 (如紫杉醇)(Jordan，2002)。秋水仙堿(一種已經(jīng)用于治療通風(fēng)的抗炎藥物)結(jié)合微管蛋白，并且導(dǎo)致MT聚合中斷。已經(jīng)試驗(yàn)秋水仙堿在治療IPF時(shí)作為皮質(zhì)甾類藥物和/或免疫抑制藥物的替代物(Douglas等，1998)，并且發(fā)現(xiàn)其更安全，但是無(wú)效(S卩，不比常規(guī)的治療劑更有效，其是無(wú)效的)。雖然諾斯卡品在化學(xué)上與秋水仙堿相似，但是其結(jié)合到微管蛋白上的不同位點(diǎn)( 等，1998)。在結(jié)合后，諾斯卡品誘導(dǎo)促進(jìn)MT聚合和組裝的微管蛋白的構(gòu)型改變，而不是使聚合中斷，并且可能以常規(guī)的方式作用，以減慢MT解離/再組裝循環(huán)。已經(jīng)采用多種MT干擾劑(如類毒素)作為抗癌治療劑，因?yàn)槠淠芟拗萍?xì)胞增殖。 然而，這些藥劑的副作用特性使得它們不合適用于治療纖維化。實(shí)際上，由于這些藥劑的一些破壞MT網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致配體獨(dú)立性Smad核積聚，以及TGF-β -應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄，并且增加TGF-β 誘導(dǎo)的Smad活性，所有這些作用都會(huì)在本質(zhì)上更容易產(chǎn)生纖維化。紫杉醇治療與一些患者內(nèi)的硬皮病類綜合癥的發(fā)展有關(guān)(例如，De Angelis等，2003)。無(wú)論諾斯卡品是否會(huì)發(fā)揮促纖維化作用，其在患有纖維化疾病或病癥的動(dòng)物模型體內(nèi)的抗纖維作用或中和作用是不可預(yù)料的。除了 MT調(diào)節(jié)效果之外，諾斯卡品還可用作非競(jìng)爭(zhēng)性緩激肽拮抗劑(Mahmoudian 等，2001)，其是一種導(dǎo)致至少某種程度的咳嗽抑制劑活性的機(jī)制(Ebrahimi等，2003)。 緩激肽引起多種生物效果血壓過(guò)低，支氣管縮小，消化道和子宮收縮，氣管、消化道和外分泌腺內(nèi)的上皮細(xì)胞分泌、血管滲透、疼痛、結(jié)締組織增生、細(xì)胞因子釋放和二十酸形成(Meranka等，1989)。緩激肽可能參與誘導(dǎo)纖維化，但是也存在相反的證據(jù)(例如， Sancho-Bru等，2007 ；Helske等，2007)。通過(guò)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生、肺原纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞以及促進(jìn)膠原產(chǎn)生，緩激肽可能參與支氣管再改造，以及肺纖維化(Vancheri 等，2005)。緩激肽還增加膠原mRNA、血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的TIMP和TGF- β的分泌(Douillet 等，2000)。使用緩激肽拮抗劑治療能夠阻止在心肌再改造的模型中緩激肽對(duì)纖維化發(fā)生產(chǎn)生作用(Koike等，2005)。因此，諾斯卡品在博萊霉素和ANIT模型中的某種程度的抗纖維化作用除了由于其MT調(diào)節(jié)活性之外，還可能是由于緩激肽拮抗劑活性產(chǎn)生的?？傊Z斯卡品似乎是一種新的抗纖維化藥物，其具有治療各種纖維化病癥的潛能。諾斯卡品的抗纖維化活性可能歸因于其作為MT調(diào)節(jié)劑和/或緩激肽拮抗劑的獨(dú)特藥理學(xué)特性。以下的非限定例子對(duì)本文公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行闡釋。 實(shí)施例例I 博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種慢性和通常致命的疾病，其特征在于ECM過(guò)度沉積， 從而導(dǎo)致?lián)p害肺功能的廣泛組織再改造。常規(guī)的治療方法(如涉及免疫抑制劑的那些)對(duì)于控制或預(yù)防疾病發(fā)展是無(wú)效的。向嚙齒動(dòng)物氣管內(nèi)施用博萊霉素已經(jīng)成為人類肺間質(zhì)纖維變性癥的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。博萊霉素毒性主要發(fā)生在肺和皮膚內(nèi)(參見(jiàn)Slei jfer，2001)，因?yàn)檫@些組織內(nèi)缺乏失活酶(博萊霉素水解酶)。博萊霉素通過(guò)誘導(dǎo)自由基(然后其導(dǎo)致DNA破壞)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。IPF的許多組織學(xué)改變都是由施用博萊霉素再生的(參見(jiàn)Grande等，1998)，所述改變?yōu)榉闻蒿@著畸變、毛細(xì)管再改造和ECM的過(guò)度沉積(特別是膠原的過(guò)度沉積)。在博萊霉素模型以及IPF中，TGF-β是成纖維細(xì)胞增生和膠原合成增加的主要分子介體。通過(guò)GC/MS測(cè)量，施用博萊霉素誘導(dǎo)OHP的分?jǐn)?shù)合成至少增加3倍。通過(guò)與博萊霉素-載劑對(duì)照相比、OHP合成的降低來(lái)確定對(duì)纖維化應(yīng)答的抑制或逆轉(zhuǎn)。方法Mll 研究開(kāi)始時(shí)采用10周齡的C57BL/6雌性小鼠。在研究期限內(nèi)自由提供食物和水。研究組被列于表1中。 表1 在博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化中的試驗(yàn)組概況
權(quán)利要求
1.一種治療患者內(nèi)的纖維化疾病或病癥的方法，包括給所述患者施用諾斯卡品和藥用載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述纖維化疾病或病癥的發(fā)作得到推遲。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述纖維化疾病或病癥的嚴(yán)重程度得到減輕。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中在進(jìn)行所述施用之后，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的水平相對(duì)于所述施用之前的水平得到降低。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為膠原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述諾斯卡品為諾斯卡品類似物。
7.一種治療患者內(nèi)的纖維化疾病或病癥的方法，包括向所述患者施用微管調(diào)節(jié)劑和藥用載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其中所述的方法還包括施用選自由 ACE抑制劑、抗纖維化劑和抗炎劑組成的組中的藥劑。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用是通過(guò)經(jīng)口施用、靜脈內(nèi)施用、皮下施用、皮內(nèi)施用、局部施用、直腸栓劑施用、氣霧化施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用和肌內(nèi)施用進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療患者內(nèi)的纖維化疾病或病癥的方法，包括給所述患者施用諾斯卡品和藥用載體。
文檔編號(hào)A61K31/485GK102159211SQ200980133667
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者M·沃爾夫, S·特納 申請(qǐng)人:金尼醫(yī)療公司