專(zhuān)利名稱(chēng)：調(diào)制離子通道機(jī)能活動(dòng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般來(lái)說(shuō)涉及延緩、減少或抑制病毒機(jī)能活動(dòng)的方法，更確切地說(shuō)涉及通過(guò)減量調(diào)節(jié)Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)來(lái)減少、延緩或抑制病毒機(jī)能活動(dòng)的方法。進(jìn)而更確切地說(shuō)，本發(fā)明提供通過(guò)抑制Vpu離子通道介導(dǎo)的HIV復(fù)制來(lái)治療HIV感染或AIDS的方法。
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)中提到的公開(kāi)文獻(xiàn)按字母順序列在說(shuō)明書(shū)末尾。
目前，沒(méi)有單一的治療方法能夠完全有效地對(duì)抗HIV感染。采用把HIV復(fù)制的大量不同方面作為目標(biāo)的藥物的聯(lián)合治療已被證實(shí)是最有效的改善AIDS癥狀和延長(zhǎng)預(yù)期壽命的方式(Barry等，1998；Deeks,1998；Miles,1997；Miles,1998；Moyle等，1998；Rachlis和Zarowny,1998；Vell等，1997；Volberding和Deeks,1998；Volberdin,1998)。例如，利用把病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶作為目標(biāo)的藥物已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了一定程度的成功(Miller和Sarver,1997；Mitsuya,1992；Moore,1997；Thomas和Brady,1997)。
Vpu蛋白形成被HIV編碼的離子通道，在病毒生活周期中具有大量已知的作用，包括減量調(diào)節(jié)CD4病毒受體分子的細(xì)胞表面表達(dá)、控制gp160從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的離開(kāi)并向細(xì)胞表面的釋放、調(diào)節(jié)病毒體從細(xì)胞表膜出芽。在沒(méi)有Vpu的存在下，HIV的復(fù)制在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)被嚴(yán)重延緩了(Balliet等，1994；Westervelt等，1992)。
雖然如此，Vpu號(hào)稱(chēng)為HIV的“輔助”蛋白質(zhì)，因?yàn)樗囊阎δ苤袥](méi)有一個(gè)似乎是體外病毒復(fù)制所必需的。
為了改善治療和預(yù)防HIV感染的景況，一直需要鑒定能夠抑制各方面HIV生命周期的分子。在為本發(fā)明所做的工作中，發(fā)明人已經(jīng)意外地確定，不囿于目前的教條，抑制或減量調(diào)節(jié)Vpu離子通道的機(jī)能活動(dòng)能夠延緩病毒復(fù)制(特別是HIV復(fù)制)。進(jìn)而發(fā)明人還已確定，盡管藥物阿米洛利對(duì)HIV復(fù)制沒(méi)有作用，不過(guò)其中位于吡嗪5-位上的H2N基已被取代的阿米洛利類(lèi)似物抑制Vpu的功能，從而抑制HIV生命周期的延續(xù)。
發(fā)明概述本說(shuō)明書(shū)和其后的權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文需要，否則措辭“包括”將被理解為隱含包括所述整體或整體的一步或一組或幾步，但不排除任何其它的整體或整體的一步或一組或幾步。
本說(shuō)明書(shū)含有利用PatentIn程序第2版制備的核苷酸和氨基酸序列信息，列在文獻(xiàn)之后。每種核苷酸或氨基酸序列在序列表中用數(shù)字指示<210>加以識(shí)別，后接序列標(biāo)識(shí)符(例如<210>1、<210>2等)。每種核苷酸或氨基酸序列的序列長(zhǎng)度、類(lèi)型(DNA、蛋白質(zhì)(PRT)等)和生物來(lái)源分別用在數(shù)字指示字段<211>、<212>和<213>中所提供的信息加以表示。本說(shuō)明書(shū)所指核苷酸和氨基酸序列用在后接序列標(biāo)識(shí)符的數(shù)字指示字段<400>(例如<400>1、<400>2等)中所提供的信息加以定義。
本發(fā)明一方面提供減少、延緩或抑制病毒機(jī)能活動(dòng)的方法，該病毒已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述宿主細(xì)胞的膜離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面更確切地提供減少、延緩或抑制HIV機(jī)能活動(dòng)的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面更確切地提供減少、延緩或抑制HIV機(jī)能活動(dòng)的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述巨噬細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，使所述宿主細(xì)胞與有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物接觸一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以抑制HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用的條件下，使所述宿主細(xì)胞與有效量的HMA或其功能等價(jià)物接觸一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以抑制HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用的條件下，使所述宿主細(xì)胞與有效量的DMA或其功能等價(jià)物接觸一定時(shí)間。
還有另一方面提供哺乳動(dòng)物HIV感染或AIDS的治療和/或預(yù)防方法，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)被HIV感染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間，其中所述Vpu機(jī)能活動(dòng)的減量調(diào)節(jié)作用減少、延緩或抑制所述HIV的機(jī)能活動(dòng)。
還有另一方面提供哺乳動(dòng)物HIV感染或AIDS的治療和/或預(yù)防方法，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)被HIV感染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間，其中所述Vpu機(jī)能活動(dòng)的減量調(diào)節(jié)作用減少、延緩或抑制HIV的復(fù)制。
本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制受治療者膜離子通道機(jī)能活動(dòng)的方法，所述方法包括在足以抑制膜離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物對(duì)所述受治療者給藥一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制哺乳動(dòng)物Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的方法，所述方法包括在足以抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制哺乳動(dòng)物HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用的方法，所述方法包括在足以抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
本發(fā)明另一方面提供如前文所定義的可用于減少、延緩或抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的藥劑。
本發(fā)明另一方面提供用于減少、延緩或抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的組合物，包含如前文所定義的藥劑和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是用于大腸埃希氏桿菌內(nèi)Vpu表達(dá)的質(zhì)粒圖示。A.氨基酸序列(<400>1)是被vpu可讀框架(ORF)編碼的，后者是由PCR從HIV-1菌株HXB2 cDNA克隆生成的。Vpu ORF在p2GEX中的GST基因3’端被框架內(nèi)克隆，生成p2GEXVpu(B)。隨后克隆到pPL451中，產(chǎn)生質(zhì)粒pPL+Vpu(C)。
圖2是大腸埃希氏桿菌內(nèi)Vpu的表達(dá)和純化圖示。A.SDS-PAGE后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大腸埃希氏桿菌提取物內(nèi)被表達(dá)的Vpu。泳道1-4含有來(lái)自p2GEXVpu的被表達(dá)的Vpu在不同純化階段的樣本泳道1為用谷胱甘肽-瓊脂糖親和色譜法分離的GST-Vpu融合蛋白；泳道2為通過(guò)用凝血酶處理從融合蛋白釋放的Vpu；泳道3為用HPLC陰離子交換色譜法純化的Vpu；泳道4為通過(guò)免疫親和柱后的Vpu。泳道5和6分別為在42℃下由含有pPL+Vpu或pPL451的誘導(dǎo)細(xì)胞制備的膜囊。B．銀染色的SDS-PAGE凝膠泳道1為用HPLC陰離子交換色譜法純化的Vpu；泳道2為通過(guò)免疫親和柱后的Vpu。
圖3是在脂質(zhì)雙分子層與含有純化Vpu的等分試樣接觸后所觀察到的離子通道活動(dòng)圖示。在A和B中，CIS腔含有500mM NaCl,TRANS腔含有50mM NaCl；兩種溶液都用10mM MES緩沖在pH6.0。B顯示由類(lèi)似于A中所示數(shù)據(jù)生成的電流對(duì)電壓曲線。
圖4是細(xì)菌互養(yǎng)測(cè)定法圖示。對(duì)所有培養(yǎng)皿都使用Met-、Pro-營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，接種在軟瓊脂上。培養(yǎng)皿A和B含有缺少脯氨酸的基本培養(yǎng)基；培養(yǎng)皿C中該培養(yǎng)基減去甲硫氨酸。為了控制細(xì)胞在背景菌苔中的生存力，在標(biāo)記為P和M的盤(pán)中分別加入脯氨酸或甲硫氨酸。標(biāo)記為C和V的盤(pán)分別用含有質(zhì)粒pPL451或pPL+Vpu的Met+、Pro+大腸埃希氏桿菌細(xì)胞接種。培養(yǎng)皿在37℃(A和C)或30℃(B)下培養(yǎng)兩天，利用來(lái)自位于培養(yǎng)皿下方的熒光進(jìn)行周?chē)彰?，在黑色背景上照相。在Novaline視頻凝膠文件系統(tǒng)上記錄圖象。在所有培養(yǎng)皿上的標(biāo)記為P或M的盤(pán)周?chē)驮谂囵B(yǎng)皿A上的標(biāo)記為V的盤(pán)周?chē)臅炤喼甘颈尘熬甑纳L(zhǎng)。
圖5是潛在Vpu通道阻斷劑的藥物篩選圖示。照片顯示缺少基本培養(yǎng)基的腺嘌呤-瓊脂糖培養(yǎng)皿已經(jīng)接種了含有Vpu表達(dá)質(zhì)粒pPLVpu的XL-1藍(lán)大腸埃希氏桿菌細(xì)胞菌苔的部分。數(shù)字6-11位于不同測(cè)試藥物的用藥部位，滴入3μl藥物液滴，浸入瓊脂糖。培養(yǎng)皿然后在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，然后照相?；野当尘跋喈?dāng)于沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的區(qū)域?！?0”周?chē)拿髁镰h(huán)狀區(qū)域代表由腺嘌呤在該位置用藥引起的細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)(陽(yáng)性對(duì)照)?！?”周?chē)?xì)菌的小暈輪狀生長(zhǎng)是由5-(N,N-亞己基)阿米洛利在該位置點(diǎn)樣所引起的。
圖6是在同一平面上的脂質(zhì)雙分子層內(nèi)5-(N,N-亞己基)阿米洛利(HMA)對(duì)Vpu離子通道活動(dòng)的抑制作用圖示。三條痕跡代表在所示濃度HMA的存在下所觀察到的典型的Vpu通道活動(dòng)。實(shí)線表示零電流水平。根據(jù)至少30秒鐘的連續(xù)通道記錄所計(jì)算的平均電流(±方差)對(duì)三種藥物濃度的每一個(gè)作圖。
圖7是HMA對(duì)單核細(xì)胞和由單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞內(nèi)HIV病毒體產(chǎn)生的作用圖示。采用定量ELISA法，通過(guò)檢測(cè)p24抗原，在感染后各天測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的HIV。實(shí)心黑條代表與10μM HMA接觸的HIV感染細(xì)胞。陰影條是沒(méi)有與藥物接觸的對(duì)照細(xì)胞。
圖8是阿米洛利、HMA和DMA的化學(xué)式圖示R=H2N，阿米洛利；R=(CH3)2N,DMA；R=(CH2)6N,HMA。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明在部分程度上是基于下列意外的判定導(dǎo)致宿主細(xì)胞表達(dá)Vpu離子通道的病毒、特別是HIV的復(fù)制能夠通過(guò)抑制該離子通道的機(jī)能活動(dòng)加以延緩。此外，盡管阿米洛利對(duì)HIV復(fù)制沒(méi)有作用，不過(guò)阿米洛利類(lèi)似物通過(guò)抑制Vpu離子通道的機(jī)能活動(dòng)，能夠抑制HIV生命周期。這種判定現(xiàn)在使一些藥劑得以使用，例如但不限于阿米洛利類(lèi)似物，作為抗病毒劑，用于病毒性疾病的治療和預(yù)防。
因此，本發(fā)明一方面提供減少、延緩或抑制病毒機(jī)能活動(dòng)的方法，該病毒已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述宿主細(xì)胞的膜離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
關(guān)于“膜離子通道”，應(yīng)當(dāng)被理解為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明延伸到可以憑借被動(dòng)、滲透、主動(dòng)或交換轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮功能的離子通道。離子通道可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外方式形成。例如，離子通道可以是細(xì)胞自然形成的離子通道，以促進(jìn)正常的機(jī)能活動(dòng)。或者，離子通道也可以通過(guò)細(xì)胞外方式形成。細(xì)胞外方式例如包括離子通道的形成是由所引入的化學(xué)品、藥物或其它藥劑引起的，例如離子載體，或者是由被已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞的病毒編碼的病毒蛋白的機(jī)能活動(dòng)引起的。優(yōu)選地，本發(fā)明的離子通道是由細(xì)胞被HIV感染所導(dǎo)致形成的離子通道，更確切地說(shuō)，該離子通道是由HIV蛋白Vpu所形成的(這里稱(chēng)之為“Vpu離子通道”)。
作為本發(fā)明主體的離子通道促進(jìn)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。所述膜可以是任何膜，并不限于細(xì)胞外壁質(zhì)膜。因此“膜”涵蓋包圍任何細(xì)胞器、例如高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜、細(xì)胞外膜、包圍任何位于細(xì)胞內(nèi)的外來(lái)抗原的膜(例如病毒包膜)或位于細(xì)胞外的外來(lái)生物的膜。通常但不是必要地，膜由液體脂質(zhì)雙分子層組成。該離子通道可以是任意結(jié)構(gòu)的。例如，Vpu離子通道是由Vpu形成的，Vpu是被HIV-1編碼的固有膜蛋白，HIV-1例如與被感染細(xì)胞的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)締合。以下關(guān)于“Vpu離子通道”，應(yīng)當(dāng)被理解為包括所有其它離子通道。
因此，本發(fā)明更確切地提供減少、延緩或抑制HIV機(jī)能活動(dòng)的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
關(guān)于“HIV”，應(yīng)當(dāng)被理解為任意的HIV毒株，包括同系物和突變體。
在無(wú)論如何也不限制本發(fā)明的前提下，Vpu是包含大約80個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有N-端跨膜錨鉤和親水性胞質(zhì)C-端結(jié)構(gòu)域。C-端結(jié)構(gòu)域通常包含12氨基酸的保守序列，其中含有兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基(Schubert等，1994；Friborg等，1995)。Vpu是被HIV-1編碼的固有膜蛋白。它與被感染細(xì)胞內(nèi)的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜締合，但是在病毒包膜和細(xì)胞質(zhì)膜中都沒(méi)有檢測(cè)到，人為過(guò)度表達(dá)的除外(Schubert等，1996a)。在無(wú)論如何也不限制本發(fā)明的前提下，Vpu具有形成同源寡聚體的能力，但是天然復(fù)合物中亞單位的精確數(shù)量是未知的。Vpu胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)和第三級(jí)折疊已經(jīng)通過(guò)聯(lián)合采用NMR與CD光譜學(xué)和分子動(dòng)態(tài)計(jì)算加以測(cè)定(Willbold等，1997)，揭示了兩個(gè)含有磷酸化絲氨酸殘基的α-螺旋結(jié)構(gòu)，它們被短的柔性回環(huán)分隔開(kāi)。最近的跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(Wray等，1999)支持了該區(qū)域是α-螺旋狀的這一理論預(yù)測(cè)，說(shuō)明相對(duì)于正常雙分子層的傾斜角小于30°。已經(jīng)報(bào)道了兩項(xiàng)分子動(dòng)態(tài)學(xué)模擬研究，它們基于這樣的假定低聚反應(yīng)產(chǎn)生一束跨越膜的α-螺旋(Grice等，1997；Moore等，1998)。這兩項(xiàng)研究都有利于五聚物的生成。不過(guò)，采用不同的初始條件和限制參數(shù)，關(guān)于復(fù)合物中各螺旋的取向會(huì)得出不同的結(jié)論。因此，天然Vpu復(fù)合物的實(shí)際結(jié)構(gòu)仍有待測(cè)定。
盡管發(fā)明人已經(jīng)指出，Vpu形成離子通道，不過(guò)在本發(fā)明之前，并不知道Vpu形成的離子通道是HIV病毒生命周期的關(guān)鍵功能。
關(guān)于離子通道的“機(jī)能活動(dòng)”，應(yīng)當(dāng)被理解為離子通道所行使或參與的任意一種或多種功能。例如，Vpu蛋白編碼的離子通道除了促進(jìn)Na+、K+、Cl-和PO43-的轉(zhuǎn)運(yùn)，還在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)CD4分子降解中起到作用。Vpu蛋白編碼的離子通道也被認(rèn)為在介導(dǎo)HIV生命周期中起到作用，因?yàn)槭乖撏ǖ朗Щ羁梢种艸IV生命周期，特別是HIV的復(fù)制。不過(guò)，本發(fā)明并不限于通過(guò)抑制HIV生命周期、特別是HIV復(fù)制的機(jī)理來(lái)治療HIV感染。本發(fā)明更應(yīng)當(dāng)被理解為涵蓋任何這樣的機(jī)理，通過(guò)該機(jī)理，抑制Vpu離子通道的機(jī)能活動(dòng)，以減少、延緩或抑制HIV生存力或機(jī)能活動(dòng)。所述機(jī)能活動(dòng)優(yōu)選為HIV復(fù)制的介導(dǎo)作用。在此意義上，關(guān)于病毒的“機(jī)能活動(dòng)”應(yīng)當(dāng)被理解為病毒所行使或參與的任意一種或多種功能。例如包括病毒的復(fù)制和出芽。優(yōu)選地，所述機(jī)能活動(dòng)是HIV的復(fù)制。
關(guān)于“HIV的復(fù)制”，應(yīng)當(dāng)被理解為包括HIV生命周期的任意一個(gè)或多個(gè)階段或環(huán)節(jié)，例如抑制HIV病毒體的裝配或釋放。所述HIV復(fù)制的Vpu介導(dǎo)作用可以是直接或間接的方式。如果Vpu離子通道直接與HIV在其任意一個(gè)或多個(gè)生命周期階段發(fā)生相互作用，那么所述Vpu介導(dǎo)作用是直接的方式。所述Vpu介導(dǎo)作用是間接的條件是它作用于除HIV以外的其它分子，該其它分子直接或間接調(diào)制HIV生命周期的任意一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)或階段。因此，本發(fā)明方法涵蓋通過(guò)誘導(dǎo)步驟級(jí)聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV復(fù)制的介導(dǎo)作用，該步驟級(jí)聯(lián)可引起HIV生命周期的任意一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)或階段的介導(dǎo)作用。
按照這種優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
關(guān)于“減量調(diào)節(jié)”離子通道的機(jī)能活動(dòng)，特別是HIV復(fù)制的Vpu介導(dǎo)作用，應(yīng)當(dāng)被理解為所述活動(dòng)的任意一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)通過(guò)直接和間接機(jī)理的部分或完全抑制作用。例如，適合的藥劑可以直接與Vpu離子通道發(fā)生相互作用，以防止HIV復(fù)制，或者例如通過(guò)與除Vpu離子通道以外的其它分子發(fā)生相互作用可以間接地作用，以防止所述的復(fù)制，其中所述其它分子與Vpu離子通道發(fā)生相互作用并抑制后者的活動(dòng)。
離子通道機(jī)能活動(dòng)的抑制作用可以通過(guò)任意適合的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是熟知的，包括使病毒感染的細(xì)胞與蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子接觸，該分子能夠阻斷或減量調(diào)節(jié)受治療者離子通道的機(jī)能活動(dòng)。篩選阻斷Vpu離子通道活動(dòng)的分子可以通過(guò)任意適合的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如實(shí)施例11所述方法。還應(yīng)當(dāng)不言而喻的是，離子通道機(jī)能活動(dòng)的減量調(diào)節(jié)可以通過(guò)用核酸分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞、例如受治療者的宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，該核酸分子表達(dá)能夠阻斷或減量調(diào)節(jié)受治療者離子通道機(jī)能活動(dòng)的分子。因此，關(guān)于“藥劑”，應(yīng)當(dāng)被理解為任何直接或間接抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子，包括核酸分子。關(guān)于“藥劑”，應(yīng)當(dāng)被理解為包括所述藥劑的功能等價(jià)物及其衍生物。
關(guān)于被HIV感染的“哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞”，應(yīng)當(dāng)被理解為任何已經(jīng)被HIV感染了的細(xì)胞。例如包括被感染的CD4+細(xì)胞或被感染的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。在無(wú)論如何也不限制發(fā)明的前提下，HIV-1感染巨噬細(xì)胞并在其中高效復(fù)制的能力被認(rèn)為是AIDS發(fā)病機(jī)理的要素。事實(shí)上，有人已經(jīng)提出向巨噬細(xì)胞性HIV-1分離物可能對(duì)形成AIDS來(lái)說(shuō)是充分和必要的。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，受治療者被HIV感染的細(xì)胞是被HIV感染的巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞。
按照這種優(yōu)選的實(shí)施方式，提供減少、延緩或抑制HIV機(jī)能活動(dòng)的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述巨噬細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
另一種優(yōu)選的實(shí)施方式提供減少、延緩或抑制HIV機(jī)能活動(dòng)的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物單核細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述單核細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
在有關(guān)方面，發(fā)明人還驚人地測(cè)定，阿米洛利類(lèi)似物抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)。這是意外的結(jié)果，因?yàn)樵擃?lèi)似物的結(jié)構(gòu)與Vpu離子通道在表面上看來(lái)是不相容的。具體來(lái)說(shuō)，但是本發(fā)明又不局限于任何一種理論或作用模式，阿米洛利類(lèi)似物被認(rèn)為通過(guò)導(dǎo)致Vpu離子通道變?yōu)樽钄啵瑏?lái)抑制HIV病毒體從細(xì)胞釋放。這種阻斷作用是由取代的阿米洛利、而不是未取代的阿米洛利來(lái)實(shí)現(xiàn)的。未取代的阿米洛利是一種吡嗪?；?，在吡嗪環(huán)的3-和5-位攜帶氨基，在6-位攜帶氯。不過(guò)，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被理解為僅限于這種形式的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物。本發(fā)明涵蓋任何形式的阿米洛利類(lèi)似物，例如其它異構(gòu)形式的阿米洛利。因此，關(guān)于“阿米洛利類(lèi)似物”，應(yīng)當(dāng)被理解為任何表現(xiàn)加成、刪去或取代的阿米洛利分子，例如原子或分子的加成、刪去或取代，或者原子或分子電荷的改變，該原子或分子可以在任意位置，不過(guò)更確切地說(shuō)在吡嗪環(huán)的6個(gè)位置的一個(gè)或多個(gè)位置。優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物是表現(xiàn)吡嗪環(huán)5-位氨基取代的阿米洛利分子。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，使所述宿主細(xì)胞與有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物接觸一定時(shí)間。
優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物包含吡嗪環(huán)5-位氨基的取代或其功能等價(jià)物。進(jìn)而更優(yōu)選地，所述Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)是HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用。進(jìn)一步更優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物是5-(N,N-亞己基)阿米洛利(這里稱(chēng)之為“HMA”)或5-(N,N-二甲基)阿米洛利(這里稱(chēng)之為“DMA”)。
按照這種優(yōu)選的實(shí)施方式，提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以抑制HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用的條件下，使所述宿主細(xì)胞與有效量的HMA或其功能等價(jià)物接觸一定時(shí)間。
另一種優(yōu)選的實(shí)施方式提供減少、延緩或抑制HIV復(fù)制的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以抑制HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用的條件下，使所述宿主細(xì)胞與有效量的DMA或其功能等價(jià)物接觸一定時(shí)間。
最優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物包含下列結(jié)構(gòu) 阿米洛利類(lèi)似物的“功能等價(jià)物”和任何其它表現(xiàn)(在如前文所定義的抑制或減量調(diào)節(jié)Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的程度上)等價(jià)于阿米洛利類(lèi)似物的機(jī)能活動(dòng)的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)藥劑，包括天然、合成或重組來(lái)源的、功能上的活性衍生物、片段、局部、部分和化學(xué)等價(jià)物，包括融合蛋白?；瘜W(xué)等價(jià)物可以不必是從該藥劑衍生的，但是可以共享某些構(gòu)象相似性?；蛘?，化學(xué)等價(jià)物可以被具體地設(shè)計(jì)成模擬該藥劑的某些生理化學(xué)性質(zhì)?；瘜W(xué)等價(jià)物可以用化學(xué)方法合成，或者可以在例如天然產(chǎn)物的篩選之后進(jìn)行檢測(cè)。功能等價(jià)物還可以具有拮抗或激動(dòng)性質(zhì)，這類(lèi)分子的用途也是本發(fā)明的意圖所在。
該藥劑或功能等價(jià)物是一種蛋白質(zhì)分子，而本發(fā)明應(yīng)當(dāng)被理解為延伸至所述蛋白質(zhì)分子的功能衍生物。衍生物包括天然、合成或重組來(lái)源的片段、局部、部分、突變體和模擬物，包括融合蛋白。衍生物可以是從氨基酸的插入、刪去或置換而衍生的。氨基酸插入型衍生物包括氨基和/或羧基末端的融合以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列間插入。插入型氨基酸序列變體是其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基引入到預(yù)定的蛋白質(zhì)位點(diǎn)的那些，不過(guò)隨機(jī)的插入也是可能的，只要對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)篩選即可。刪去型變體是以從序列中除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸為特征的。置換型氨基酸變體是其中在序列中至少有一個(gè)殘基已被除去并且另一種不同的殘基插入其位置的那些。置換型氨基酸變體的例子是保守性氨基酸置換。保守性氨基酸置換通常包括在下組范圍內(nèi)的置換甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴(lài)氨酸和精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。向氨基酸序列的加成包括與其它肽、多肽或蛋白質(zhì)的融合。
這里所針對(duì)的蛋白質(zhì)同系物包括但不限于從不同物種衍生的蛋白質(zhì)。
衍生物包括具有與肽、多肽或其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子融合的完整蛋白質(zhì)局部的特定表位的片段。例如，蛋白質(zhì)(或非蛋白質(zhì)分子)或其衍生物可以與一種分子融合，以促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞。
關(guān)于“衍生物”，還應(yīng)當(dāng)被理解為包括類(lèi)似物。這里所針對(duì)的類(lèi)似包括但不限于對(duì)側(cè)鏈的修飾、在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的非天然氨基酸和/或其衍生物的摻入和其它方法的使用，這些方法把構(gòu)象上的約束強(qiáng)加于蛋白質(zhì)分子或其類(lèi)似物。
本發(fā)明所針對(duì)的側(cè)鏈修飾的例子包括氨基的修飾，例如通過(guò)與醛的反應(yīng)，然后用NaBH4還原進(jìn)行還原性烷基化；用甲基乙酰亞胺進(jìn)行胺化；用乙酸酐進(jìn)行?；?；用氰酸鹽進(jìn)行氨基的氨基甲?；?；用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)進(jìn)行氨基的三硝基芐基化；用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐進(jìn)行氨基的?；挥?-磷酸吡哆醛進(jìn)行賴(lài)氨酸的吡哆醛基化，然后用NaBH4還原。
精氨酸殘基的胍基可以這樣修飾，與諸如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛等藥劑生成雜環(huán)縮合產(chǎn)物。
羧基可以這樣修飾，通過(guò)O-?；愲宓纳蛇M(jìn)行碳二亞胺活化，然后衍生為例如對(duì)應(yīng)的酰胺。
巰基可以這樣修飾，例如用碘代乙酸或碘代乙酰胺進(jìn)行羧甲基化；過(guò)甲酸氧化為磺基丙氨酸；與其它硫醇化合物生成混合的二硫化物；與馬來(lái)酰亞胺、馬來(lái)酸酐或其它取代的馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)；用4-氯汞基苯甲酸酯、4-氯汞基苯磺酸、氯化苯基汞、2-氯汞基-4-硝基苯酚和其它汞化合物生成汞衍生物；在堿性pH下用氰酸鹽進(jìn)行氨基甲?；?。
色氨酸殘基例如可以這樣修飾，用N-溴琥珀酰亞胺進(jìn)行氧化或用2-羥基-5-硝基芐基溴或烴硫基鹵進(jìn)行吲哚環(huán)的烷基化。另一方面，酪氨酸殘基可以用四硝基甲烷進(jìn)行硝化，生成3-硝基酪氨酸衍生物。
組氨酸殘基的咪唑環(huán)可以這樣修飾，用碘代乙酸衍生物進(jìn)行烷基化或用焦碳酸二乙酯進(jìn)行N-碳乙氧基化。
在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中摻入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥(niǎo)氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。這里所針對(duì)的非天然氨基酸列在表1中。表1非常規(guī)氨基酸 代碼 非常規(guī)氨基酸 代碼α-氨基丁酸 Abu L-N-甲基丙氨酸Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸 MgabuL-N-甲基精氨酸Nmarg氨基環(huán)丙烷羧酸 Cpro L-N-甲基天冬酰胺 Nmasn氨基異丁酸 Aib L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp氨基降冰片基羧酸 Norb L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys環(huán)己基丙氨酸 ChexaL-N-甲基谷氨酰胺Nmgln環(huán)戊基丙氨酸 Cpen L-N-甲基谷氨酸 NmgluD-丙氨酸 Dal L-N-甲基組氨酸 NmhisD-精氨酸 Darg L-N-甲基異亮氨酸NmileD-天冬氨酸 Dasp L-N-甲基亮氨酸 NmleuD-半胱氨酸 Dcys L-N-甲基賴(lài)氨酸 NmlysD-谷氨酰胺 Dgln L-N-甲基甲硫氨酸NmmetD-谷氨酸 Dglu L-N-甲基正亮氨酸NmnleD-組氨酸 Dhis L-N-甲基正纈氨酸NmnvaD-異亮氨酸 Dile L-N-甲基鳥(niǎo)氨酸 NmornD-亮氨酸 Dleu L-N-甲基苯丙氨酸NmpheD-賴(lài)氨酸 Dlys L-N-甲基脯氨酸 NmproD-甲硫氨酸 Dmet L-N-甲基絲氨酸 NmserD-鳥(niǎo)氨酸 Dorn L-N-甲基蘇氨酸 NmthrD-苯丙氨酸 Dphe L-N-甲基色氨酸 NmtrpD-脯氨酸 Dpro L-N-甲基酪氨酸 NmtyrD-絲氨酸 Dser L-N-甲基纈氨酸 NmvalD-蘇氨酸 Dthr L-N-甲基乙基甘氨酸 NmetgD-色氨酸 Dtrp L-N-甲基叔丁基甘氨酸NmtbugD-酪氨酸 Dtyr L-正亮氨酸 NleD-纈氨酸 Dval L-正纈氨酸 NvaD-α-甲基丙氨酸 Dmalaα-甲基-氨基異丁酸 MaibD-α-甲基精氨酸 Dmargα-甲基-γ-氨基丁酸 MgabuD-α-甲基天冬酰胺Dmasnα-甲基環(huán)己基丙氨酸 MchexaD-α-甲基天冬氨酸Dmaspα-甲基環(huán)戊基丙氨酸 McpenD-α-甲基半胱氨酸DmcysR-甲基-α-萘基丙氨酸ManapD-α-甲基谷氨酰胺Dmglnα-甲基青霉胺 MpenD-α-甲基組氨酸 DmhisN-(4-氨基丁基)甘氨酸NgluD-α-甲基異亮氨酸DmileN-(2-氨基乙基)甘氨酸NaegD-α-甲基亮氨酸DmleuN-(3-氨基丙基)甘氨酸 NornD-α--甲基賴(lài)氨酸 DmlysN-氨基-α-甲基丁酸 NmaabuD-α-甲基甲硫氨酸 Dmmetα-萘基丙氨酸AnapD-α-甲基鳥(niǎo)氨酸DmornN-芐基甘氨酸 NpheD-α-甲基苯丙氨酸 DmpheN-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸 NglnD-α-甲基脯氨酸DmproN-(氨基甲酰甲基)甘氨酸 NasnD-α-甲基絲氨酸DmserN-(2-羧基乙基)甘氨酸 NgluD-α-甲基蘇氨酸DmthrN-(羧甲基)甘氨酸 NaspD-α-甲基色氨酸DmtrpN-環(huán)丁基甘氨酸 NcbutD-α-甲基酪氨酸DmtyrN-環(huán)庚基甘氨酸 NchepD-α-甲基纈氨酸DmvalN-環(huán)己基甘氨酸 NchexD-N-甲基丙氨酸 Dnmala N-環(huán)癸基甘氨酸 NcdecD-N-甲基精氨酸 Dnmarg N-環(huán)十二烷基甘氨酸 NcdodD-N-甲基天冬酰胺 Dnmasn N-環(huán)辛基甘氨酸 NcoctD-N-甲基天冬氨酸 Dnmasp N-環(huán)丙基甘氨酸 NcproD-N-甲基半胱氨酸 Dnmcys N-環(huán)十一烷基甘氨酸 NcundD-N-甲基谷氨酰胺 Dnmgln N-(2,2-二苯基乙基)甘氨酸 NbhmD-N-甲基谷氨酸 DnmgluD-N-甲基組氨酸 Dnmhis N-(3,3-二苯基丙基)甘氨酸 NbheD-N-甲基異亮氨酸 Dnmile N-(3-胍基丙基)甘氨酸 NargD-N-甲基亮氨酸 Dnmleu N-(1-羥基乙基)甘氨酸 NthrD-N-甲基賴(lài)氨酸 Dnmlys N-(羥乙基)甘氨酸 NserN-甲基環(huán)己基丙氨酸 Nmchexa N-(咪唑乙基)甘氨酸 NhisD-N-甲基鳥(niǎo)氨酸 Dnmorn N-(3-吲哚乙基)甘氨酸 NhtrpN-甲基甘氨酸 Nala N-甲基-γ-氨基丁酸 NmgabuN-甲氨基異丁酸 NmaibD-N-甲基甲硫氨酸 DnmmetN-(1-甲基丙基)甘氨酸 Nile N-甲基環(huán)戊基丙氨酸 NmcpenN-(2-甲基丙基)甘氨酸 Nleu D-N-甲基苯丙氨酸 DnmpheD-N-甲基色氨酸 Dnmtrp D-N-甲基脯氨酸 DnmproD-N-甲基酪氨酸 Dnmtyr D-N-甲基絲氨酸 DnmserD-N-甲基纈氨酸 Dnmval D-N-甲基蘇氨酸 Dnmthrγ-氨基丁酸 Gabu N-(1-甲基乙基)甘氨酸NvalL-叔丁基甘氨酸 Tbug N-甲基-α-萘基丙氨酸NmanapL-乙基甘氨酸EtgN-甲基青霉胺NmpenL-高苯丙氨酸Hphe N-(對(duì)羥基苯基)甘氨酸NhtyrL-α-甲基精氨酸 Marg N-(硫代甲基)甘氨酸 NcysL-α-甲基天冬氨酸 Masp 青霉胺 PenL-α-甲基半胱氨酸 Mcys L-α-甲基丙氨酸 MalaL-α-甲基谷氨酰胺 Mgln L-α-甲基天冬酸 MasnL-α-甲基組氨酸 Mhis L-α-甲基叔丁基甘氨酸 MtbugL-α-甲基異亮氨酸 Mile L-甲基乙基甘氨酸MetgL-α-甲基亮氨酸 M1eu L-α-甲基谷氨酰胺 MgluL-α-甲基甲硫氨酸 Mmet L-α-甲基高苯丙氨酸 MhpheL-α-甲基正纈氨酸 Mnva N-(2-甲硫基乙基)甘氨酸 NmetL-α-甲基苯丙氨酸 Mphe L-α-甲基賴(lài)氨酸 MlysL-α-甲基絲氨酸 Mser L-α-甲基正亮氨酸 MnleL-α-甲基色氨酸 Mtrp L-α-甲基鳥(niǎo)氨酸 MornL-α-甲基纈氨酸Mval L-α-甲基脯氨酸 MproN-(N-(2,2-二苯基乙基)氨 Nnbhm L-α-甲基蘇氨酸 Mthr基甲酰甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2,2-二苯基乙 Nmbc L-α-甲基酪氨酸 Mtyr氨基)環(huán)丙烷L(zhǎng)-N-甲基高苯丙氨酸 Nmhphe N-(N-(3,3-二苯基丙基)氨基甲 Nnbhe酰甲基)甘氨酸可以使用交聯(lián)劑，例如用于穩(wěn)定3D構(gòu)象，采用同質(zhì)雙官能交聯(lián)劑，例如具有(CH2)n間隔基(其中n=1至6)的雙官能亞氨基酯、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯，和異質(zhì)雙官能藥劑，通常含有一個(gè)氨基反應(yīng)性部分(例如N-羥基琥珀酰亞胺)和另一個(gè)基團(tuán)特異性反應(yīng)性部分。
病毒抑制作用的受治療者一般是哺乳動(dòng)物，例如但不限于人、靈長(zhǎng)類(lèi)、牲畜(例如羊、牛、馬、猴、豬)、寵物(例如狗、貓)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠)、捕獵的野生動(dòng)物(例如狐貍、鹿)。優(yōu)選地，該受治療者是人或靈長(zhǎng)類(lèi)。最優(yōu)選地，該受治療者是人。
本發(fā)明方法可用于HIV感染和AIDS的治療和預(yù)防。例如，Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的減量調(diào)節(jié)可以作用于已知被HIV感染的受治療者，目的是防止HIV的復(fù)制，從而預(yù)防AIDS的發(fā)病?；蛘?，本發(fā)明方法可用于減少血清的病毒負(fù)荷或減輕AIDS的癥狀。
本發(fā)明方法特別可用于HIV感染早期，用于防止在諸如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)建立病毒儲(chǔ)存庫(kù)，或者作為預(yù)防性處理，在接觸可能的HIV感染源之前立即施用，或在此之后施用一段時(shí)期。
因此，另一方面提供哺乳動(dòng)物HIV感染或AIDS的治療和/或預(yù)防方法，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)被HIV感染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間，其中所述Vpu機(jī)能活動(dòng)的減量調(diào)節(jié)作用減少、延緩或抑制所述HIV的機(jī)能活動(dòng)。
更確切地，本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物HIV感染或AIDS的治療和/或預(yù)防方法，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)被HIV感染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間，其中所述Vpu機(jī)能活動(dòng)的減量調(diào)節(jié)作用減少、延緩或抑制所述HIV的復(fù)制。
關(guān)于“有效量”，指至少在部分程度上達(dá)到所需應(yīng)答的必需量。
這里關(guān)于“治療”和“預(yù)防”，是從廣義上理解的。術(shù)語(yǔ)“治療”不必意味著哺乳動(dòng)物受到治療直到完全恢復(fù)時(shí)為止。類(lèi)似地，“預(yù)防”不必指受治療者最終將不感染疾病狀態(tài)。因此，治療和預(yù)防包括特定疾患癥狀的改善或者防止或減少發(fā)展為特定疾患的危險(xiǎn)。術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”可被認(rèn)為減少特定疾患發(fā)病的嚴(yán)重性?！爸委煛币部梢詼p少現(xiàn)有疾患的嚴(yán)重性或急性發(fā)作的頻率。
優(yōu)選地，所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物。進(jìn)而更優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物是HMA或DMA。
按照這種方法，可以將不止一種類(lèi)型的藥劑給藥，或者可以將該藥劑與另一種分子共同給藥，例如已知的抗病毒化合物或分子?！肮餐o藥”指經(jīng)過(guò)相同或不同的途徑，以相同的制劑或兩種不同的制劑同時(shí)給藥，或者通過(guò)相同或不同的途徑連續(xù)給藥?！斑B續(xù)”給藥指兩種類(lèi)型阿米洛利類(lèi)似物或阿米洛利類(lèi)似物與已知的抗病毒化合物或分子的給藥之間的時(shí)間差異，按秒、分鐘、小時(shí)或天計(jì)。該藥劑和已知的抗病毒化合物或分子可以按任意順序給藥。
給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、顱內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、腦內(nèi)、鼻內(nèi)、通過(guò)輸注、口服、直腸、經(jīng)過(guò)靜脈滴注、藥貼和植入。靜脈內(nèi)途徑是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明進(jìn)一步延及該藥劑在藥物制備中的用途，該藥物用于哺乳動(dòng)物HIV感染或AIDS的治療性或預(yù)防性處理，其中所述藥劑減少、延緩或抑制被HIV感染的細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)。
優(yōu)選地，所述機(jī)能活動(dòng)是HIV復(fù)制的介導(dǎo)作用。
最優(yōu)選地，所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物，進(jìn)而更優(yōu)選為HMA或DMA或其功能等價(jià)物。
已如前文所述，發(fā)明人已經(jīng)驚人地測(cè)定了盡管阿米洛利對(duì)Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)沒(méi)有作用，然而阿米洛利類(lèi)似物能夠阻斷機(jī)能活動(dòng)。
因此，本發(fā)明另一方面提供減少、延緩或抑制受治療者膜離子通道機(jī)能活動(dòng)的方法，所述方法包括在足以抑制膜離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物對(duì)所述受治療者給藥一定時(shí)間。
更確切地，本發(fā)明提供減少、延緩或抑制哺乳動(dòng)物Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的方法，所述方法包括在足以抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
進(jìn)而更優(yōu)選地，本發(fā)明提供減少、延緩或抑制哺乳動(dòng)物HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用的方法，所述方法包括在足以抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物包含吡嗪環(huán)5-位氨基的取代或其功能等價(jià)物。
進(jìn)而更優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物是HMA或DMA。
最優(yōu)選地，所述阿米洛利類(lèi)似物包含下列結(jié)構(gòu) 本發(fā)明另一方面提供如前文所定義的可用于減少、延緩或抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的藥劑。
優(yōu)選地，所述機(jī)能活動(dòng)是HIV復(fù)制的介導(dǎo)作用。
最優(yōu)選地，所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物，進(jìn)而更確切地，所述藥劑是HMA或DMA或其功能等價(jià)物。
本發(fā)明另一方面提供可用于減少、延緩或抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的組合物，包含如前文所定義的藥劑和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。該組合物也可以包含兩種不同類(lèi)型的藥劑或一種藥劑與一種已知的抗病毒化合物或分子。
優(yōu)選地，所述離子通道機(jī)能活動(dòng)的抑制作用是HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用的抑制作用。
適合于注射用途的組合物包括無(wú)菌水溶液(只要是水溶性的)和無(wú)菌粉末，用于無(wú)菌可注射溶液的臨時(shí)性制備。它們?cè)谏a(chǎn)和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須加以保護(hù)不受微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的適當(dāng)混合物和植物油。利用各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑可以防止微生物的作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等。在很多情況下，將優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。在組合物中使用延遲吸收的試劑可以實(shí)現(xiàn)可注射組合物的長(zhǎng)時(shí)間吸收，例如一硬脂酸鋁和明膠。
無(wú)菌可注射溶液是這樣制備的，將在適當(dāng)溶劑中的所需量活性化合物與上文列舉的各種其它成分結(jié)合，根據(jù)需要，隨后例如進(jìn)行過(guò)濾滅菌或其它適當(dāng)方式的滅菌。分散系也是本發(fā)明所針對(duì)的，它們可以這樣制備，將各種無(wú)菌活性成分結(jié)合在無(wú)菌載體內(nèi)，載體含有基本分散介質(zhì)和所需的上文列舉的其它成分。在用于無(wú)菌可注射溶液制備的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，得到活性成分加任何另外的所需成分的粉末，另外的成分來(lái)自以前無(wú)菌過(guò)濾的溶液。
當(dāng)活性成分被適當(dāng)保護(hù)時(shí)，它們可以口服給藥，例如與一種惰性稀釋劑或一種可同化的食用載體，或者它可以被包封在硬殼或軟殼膠囊內(nèi)，或者它可以被壓制成片。關(guān)于口服治療給藥，活性化合物可以與賦形劑結(jié)合，以可攝取的片劑、口含片、錠劑、膠囊劑、酏劑、栓劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等劑型加以使用。這樣的組合物和制劑應(yīng)當(dāng)含有至少1重量％的活性化合物。組合物和制劑的百分率當(dāng)然可以是不同的，宜在約5至約80％重量單位之間?；钚曰衔镌谶@種治療學(xué)上有用的組合物中的含量使獲得適合的劑量成為可行。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選組合物或制劑在制備后，口服單位劑型含有約0.1ng至約2000mg的活性化合物。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等還可以含有下列組分粘合劑，例如樹(shù)膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂；可以加入甜味劑，例如蔗糖、乳糖或糖精，或矯味劑，例如薄荷、冬青油或櫻桃調(diào)味劑。若單位劑型是膠囊劑，則除了上述類(lèi)型原料以外，還可以含有液體載體。還可以存在各種其它原料，作為包衣，或者改變單位劑型的物理形狀。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可以用蟲(chóng)膠、糖或二者包衣。糖漿劑或酏劑可以含有活性化合物，還含有蔗糖作為甜味劑、含有對(duì)羥基苯甲酸甲酯與丙酯作為防腐劑、含有染劑和調(diào)味劑，例如櫻桃或橙味劑。用于制備任何單位劑型的任何原料都應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)純的，并且在所用劑量下是基本無(wú)毒的。另外，活性化合物可以結(jié)合在緩釋制劑中。
本發(fā)明也延及適合于局部用藥的劑型，例如霜?jiǎng)?、洗劑和凝膠。在這些劑型中，可能需要對(duì)抗凝固肽進(jìn)行修飾，以透過(guò)皮膚屏障。
藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑包括任何所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌與抗真菌劑、等滲與吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和試劑對(duì)藥學(xué)上的活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域所熟知的。除了在常規(guī)介質(zhì)或試劑范圍內(nèi)與活性成分不相容的以外，本發(fā)明所針對(duì)的是其在治療組合物中的用途。追加的活性成分也可以結(jié)合在組合物中。
尤為有利的是配制成腸胃外組合物的單位劑型，以便給藥容易、劑量統(tǒng)一。這里所用的單位劑型指物理上離散的單元，適合作為單一劑量用于所治療的哺乳動(dòng)物；每個(gè)單元含有與所需藥物載體締合的預(yù)定量的活性物質(zhì)，含量經(jīng)過(guò)計(jì)算可產(chǎn)生所需的治療效果。關(guān)于本發(fā)明的新穎的單位劑型的說(shuō)明取決于并且直接依賴(lài)于(a)活性物質(zhì)的獨(dú)特性質(zhì)和所要達(dá)到的特定治療效果，(b)制劑領(lǐng)域固有的限制。
本發(fā)明所針對(duì)的有效量將因病痛的嚴(yán)重性和受治療者的健康狀況和年齡而異。一般來(lái)說(shuō)，有效量可以從0.01ng/kg體重至約100mg/kg體重不等。或者，有效量為約0.1ng/kg體重至約100mg/kg體重，或?yàn)?.0ng/kg體重至約80mg/kg體重。
本發(fā)明的進(jìn)一步特征更加充分地描述在下列實(shí)施例中。不過(guò)不言而喻的是，包括這些詳細(xì)說(shuō)明的目的僅僅在于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行例證。無(wú)論如何也不應(yīng)當(dāng)將實(shí)施例理解為對(duì)上述發(fā)明的廣泛說(shuō)明的限制。
實(shí)施例1重組質(zhì)粒p2GEXVpu和pPLVpu的構(gòu)建編碼Vpu的可讀框架(圖1a)通過(guò)PCR從HIV-1基因組Ndel片段的cDNA克隆(HXB2分離物，McFarlane Burnet Centre,Melbourne,Australia)擴(kuò)增。選擇天然Pfu DNA聚合酶(Stratagene；0.035U/μl)催化PCR反應(yīng)，以盡可能地減少由酶的校正活性所引起的PCR誤差。5’有意義引物AGTAGGATCCATGCAACCTATACC(<400>2)引入BamH1位點(diǎn)(帶下劃線的)，用于與p2GEX(41)中GST基因的3’端進(jìn)行框架內(nèi)克隆。這種引物也修復(fù)vpu基因的起始密碼子(粗體的T置換C)，后者是HXB2分離物中的蘇氨酸密碼子。3’反義引物TCTGGAATTCTACAGATCATCAAC(<400>3)向PCR產(chǎn)物的另一端引入EcoR1位點(diǎn)(帶下劃線的)，以便于克隆。在Perkin-Elmer熱循環(huán)裝置內(nèi)，在0.5ml薄壁Eppendorf試管中，以94℃下45秒、55℃下1分鐘和72℃下1分鐘為一個(gè)周期循環(huán)30次，將268bp片段純化，用BamH1和EcoR1消化，再與通過(guò)用相同的兩種酶消化而制得的p2GEX連接。所得重組質(zhì)粒闡述在圖1b中。使用Applied Biosystems染劑-終止劑試劑盒，將完整的Vpu可讀框架和BamH1與EcoR1連接位點(diǎn)進(jìn)行循環(huán)定序，以確定DNA序列。
為了制備Vpu可讀框架用以插入pPL451表達(dá)質(zhì)粒，首先將p2GEXVpu用BamH1消化，在dNTP的存在下，將5’堿基突出端填充Klenow DNA聚合酶。然后通過(guò)用EcoR1消化，釋放Vpu編碼片段，用瓊脂糖凝膠純化，再與已經(jīng)用Hpa1和EcoR1消化過(guò)的pPL451連接。蛋白質(zhì)印跡隨后確認(rèn)，在42℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)物以使PR和PL啟動(dòng)子的cI857阻抑物失活之后，pPLVpu構(gòu)建物(圖1c)表達(dá)Vpu。
實(shí)施例2增加用于Vpu免疫鑒定的多克隆抗體利用Applied Biosystems477A型機(jī)械，在BiomolecularResource Facility(ANU,Australia)中合成相當(dāng)于Vpu的C-端20個(gè)氨基酸殘基的肽CALVEMGVEMGHHAPWDVDDL(<400>4)。通過(guò)N-端半胱氨酸殘基，將該肽與聚賴(lài)氨酸內(nèi)核偶聯(lián)，制備多抗原肽(MAP)(Lu等，1991)。MAP用于使兔子獲得免疫，用于產(chǎn)生識(shí)別Vpu C-端的多克隆抗血清。關(guān)于免疫方法，將1mg MAP肽溶于1.25ml MTPBS(16mM Na2HPO4,4mM NaH2PO4,150mM NaCl,pH 7.3)，用1.25ml弗氏完全佐劑乳化，在多個(gè)皮下部位注射在兔子背部。強(qiáng)化注射使用弗氏不完全佐劑，與血清取樣間隔至少4周，后者是在注射后10-14天進(jìn)行的。
實(shí)施例3涉及抗體的技術(shù)利用來(lái)自Pierce的ImmunopureTMAg/Ab固定試劑盒，純化來(lái)自兔血清的肽特異性抗體。按照試劑盒的說(shuō)明，將合成肽通過(guò)其N(xiāo)-端半胱氨酸交聯(lián)在5ml Sulfo LinkTM柱的基質(zhì)上，將2.5ml Vpu免疫反應(yīng)性血清加入到20ml Tris緩沖液(10mM,pH7.4)中，通過(guò)肽柱三次，以使抗體與肽進(jìn)行最大程度的接觸。柱子用20ml 10mM TrispH7.4洗滌，然后用補(bǔ)充了500mM NaCl的20ml相同緩沖液洗滌。所結(jié)合的抗體在5ml 100mM甘氨酸/150mM NaCl,pH2.5中洗脫，立即向洗脫液中加入250μl 1M Tris pH9.0進(jìn)行中和，相對(duì)MTPBS透析過(guò)夜。
如前文所述(Harlow和Lane,1988)，利用雙官能交聯(lián)劑二甲基庚二亞胺(dimethylpimelimidate)，將200μg純化抗體與100μl蛋白A瓊脂糖珠粒(Schleicher和Schnell)共價(jià)交聯(lián)，構(gòu)建抗Vpu免疫親和柱。
在大約5倍過(guò)量的純化抗體的存在下培養(yǎng)樣本(室溫下1小時(shí))，然后加入過(guò)量的蛋白A瓊脂糖，培養(yǎng)30分鐘，離心使Vpu-抗體復(fù)合物形成顆粒，進(jìn)行Vpu的免疫沉淀法。上清液隨后在電生理學(xué)雙分子層實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照，用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行試驗(yàn)，以確認(rèn)Vpu已經(jīng)完全被除去了。利用minigel儀器和預(yù)灌注的凝膠(Novex)，在同質(zhì)18％SDS聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行電泳。裝上凝膠之前，樣本用SDS(最終濃度3.2％)和巰基乙醇(最終濃度0.8％)在60℃下處理5分鐘。用考馬斯亮藍(lán)R250或者通過(guò)銀染色法觀察蛋白質(zhì)色帶。
關(guān)于蛋白質(zhì)印跡，利用半干燥的轉(zhuǎn)移儀器(Pharmacia LKB)，將蛋白質(zhì)從丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。印跡與多克隆抗血清或純化抗體、羊抗兔堿性磷酸酶綴合物和Western BlueTM穩(wěn)定化的底物(Promega)進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)之后，檢測(cè)Vpu。
實(shí)施例4從大腸埃希氏桿菌純化重組Vpu在強(qiáng)換氣條件下，含有p2GEXVpu的大腸埃希氏桿菌菌株XL1-藍(lán)細(xì)胞培養(yǎng)物在30℃LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充有葡萄糖(6g/L)和氨芐西林(50mg/L)，生長(zhǎng)到密度大約為250克萊特單位時(shí)加入IPTG，至最終濃度為0.01mM，繼續(xù)生長(zhǎng)4小時(shí)。最終的培養(yǎng)物濃度大約為280克萊特單位。由于早期實(shí)驗(yàn)揭示被表達(dá)的GST-Vpu融合蛋白大部分與細(xì)胞碎片和膜部分締合，采用Varadhachary和Maloney的方法(Varadhachary和Maloney,1990)分離滲透性被破壞的空細(xì)胞(與細(xì)胞碎片和膜部分結(jié)合)，用于最初的純化步驟。將細(xì)胞收獲，洗滌，稱(chēng)重，再次懸浮在10ml/g濕重的MTPBS中，后者含有DTT(1mM)和MgCl2(10mM)。加入溶菌酶(0.3mg/ml；雞蛋白；Sigma)，在冰上培養(yǎng)30分鐘，同時(shí)小心地?cái)嚢?，然后?7℃下培養(yǎng)5分鐘。在12000g下使對(duì)滲透壓敏感的細(xì)胞形成顆粒，再次懸浮在水中至原始體積，使細(xì)胞破裂。懸浮液然后用10x緩沖儲(chǔ)備溶液配制成1x MTPBS/DTT，離心分離空細(xì)胞，再次懸浮在MTPBS/DTT中，然后向其中按順序加入甘油(至20％wt/vol)和CHAPS(至2％wt/vol)，最終體積為原始體積的四分之一。將該混合物在冰上攪拌1小時(shí)，然后在400000g下離心1小時(shí)，以除去不溶物。在谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂(Sigma)上通過(guò)親和色譜法，純化洗滌劑提取物中的GST-Vpu融合蛋白。將樹(shù)脂在50mM Tris pH7.5中徹底洗滌，后者含有甘油(5％)、DTT(1mM)和CHAPS(0.5％)(緩沖液A)，然后釋放融合蛋白的Vpu部分，通過(guò)將珠粒的50％(v/v)懸浮液用人凝血酶處理(100U/ml；37℃1小時(shí))，使Vpu部分從與樹(shù)脂結(jié)合的GST中洗脫。向洗脫液中加入PMSF(0.5mM)，以除去任何殘留的凝血酶活性。將該Vpu部分在與BioRad HPLC連接的MA7Q陰離子交換柱上進(jìn)一步純化，用線性NaCl梯度(0-2M)的緩沖液A洗脫。
將Vpu在免疫親和柱上純化至同質(zhì)性--用銀染色凝膠法測(cè)定--如下將含有Vpu的HPLC部分在NAP25柱(Pharmacia)上脫鹽，洗脫在緩沖液A中，然后在室溫下與抗體-瓊脂糖珠?；旌?小時(shí)。徹底洗滌珠粒，通過(guò)增加鹽濃度至2M，洗脫Vpu。利用BioRad染劑-結(jié)合測(cè)定法定量分析蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5磷脂小泡內(nèi)Vpu的重建通過(guò)洗滌劑稀釋法(New,1990)制備含有Vpu的蛋白脂質(zhì)體。將溶解在氯仿中的脂質(zhì)混合物(PE∶PC∶PS=5∶3∶2；脂質(zhì)總量1mg)在氮?dú)饬飨赂稍?，再次懸浮?.1ml含有DTT(1mM)的磷酸鉀緩沖液(50mM,pH7.4)中。加入25μl含有純化Vpu的等分試樣，然后加入辛基葡糖苷至最終濃度為1.25％(wt/vol)。將該混合物在液氮中冷凍、融化、在浴型超聲處理器中進(jìn)行超聲處理(20-30秒)，如此循環(huán)三次，然后迅速稀釋在200體積的磷酸鉀緩沖液中。在400000g下離心1小時(shí)，以收集蛋白脂質(zhì)體，再次懸浮在大約150μl的磷酸鹽緩沖液中。
實(shí)施例6測(cè)定離子通道的活動(dòng)利用別處所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Miller,1986和Piller等，1996)，試驗(yàn)了純化Vpu誘導(dǎo)平面脂質(zhì)雙分子層通道活動(dòng)的能力。利用DelrinTM塑料膜分離CIS和TRANS腔內(nèi)的溶液，塑料膜含有直徑大約100μm的微小循環(huán)孔，將脂質(zhì)雙分子層涂在該孔的對(duì)面，以形成高抗電性封口。用棕櫚酰-油酰-磷脂酰-乙醇胺與棕櫚酰-油酰-磷脂酰-膽堿(Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama)在正癸烷中的混合物(8∶2)涂雙分子層。兩腔內(nèi)的溶液含有MES緩沖液(10mM,pH6.0)，向其中加入不同濃度的NaCl或KCl。用AxopatchTM200放大器記錄電流。兩腔之間的電位可以控制在±200mV之間(相對(duì)于接地的CIS而言的TRANS)。將含有Vpu的等分試樣加入到CIS腔內(nèi)，既可作為洗滌溶液，也可在蛋白質(zhì)摻入磷脂小泡內(nèi)之后加入。
對(duì)腔進(jìn)行攪拌，直到可觀察到電流時(shí)為止。
實(shí)施例7試驗(yàn)HMA和DMA對(duì)人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)HIV復(fù)制的作用從外周血液中分離人單核細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)(一日齡單核細(xì)胞)或7天，使其分化為單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDM)。這些細(xì)胞然后與不合細(xì)胞的HIV分離物制劑接觸，在培養(yǎng)基的完全吸入之前吸附2小時(shí)，用不含病毒的培養(yǎng)基洗滌一次，再次懸浮在新鮮的培養(yǎng)基中。使細(xì)胞在感染之前24小時(shí)或感染之后與50-10μM HMA或DMA接觸。隨后在感染后的不同時(shí)間，將在與藥物接觸的細(xì)胞和不與藥物接觸的細(xì)胞內(nèi)的HIV復(fù)制與藥物(對(duì)照)進(jìn)行比較。利用HIV DNA PCR法(Fear等，1998)或ELISA法測(cè)定病毒復(fù)制的進(jìn)展和程度，以量化培養(yǎng)物上清液中的p24(Kelly等，1998)。
實(shí)施例8大腸埃希氏桿菌內(nèi)Vpu的表達(dá)和純化構(gòu)建質(zhì)粒p2GEXVpu(圖1)，以在GST與Vpu可讀框架之間造成框架內(nèi)基因融合這種系統(tǒng)使IPTG誘導(dǎo)的與GST C-端融合的Vpu多肽表達(dá)成為可能，并且可以在谷胱甘肽瓊脂糖上通過(guò)親和色譜法純化融合蛋白。
通過(guò)使培養(yǎng)物在30℃下生長(zhǎng)至細(xì)胞濃度大約為250-300克萊特單位，并用低水平IPTG(0.01mM)誘導(dǎo)，可獲得GST-Vpu表達(dá)的最佳水平。為了純化GST-Vpu，將所誘導(dǎo)的細(xì)胞用溶菌酶處理，然后進(jìn)行低速離心，可制備含有細(xì)胞碎片和質(zhì)膜的混合細(xì)胞部分。使用兩性離子洗滌劑CHAPS可以使大約50％的GST-Vpu蛋白從該部分增溶。采用谷胱甘肽-瓊脂糖珠粒的親和色譜法用于富集融合蛋白，凝血酶用于在融合配偶體之間的高親和性凝血酶位點(diǎn)裂解融合蛋白，釋放Vpu(圖2A)。在從陰離子交換柱洗脫的部分中，Vpu是在銀染色的凝膠上可見(jiàn)的主要蛋白質(zhì)(圖2B，帶1)。最后，在免疫親和柱上將Vpu純化至明顯為同質(zhì)性(圖2B，帶2)。相當(dāng)于免疫檢測(cè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)帶(從SDS-PAGE凝膠中切除)的N-端氨基酸序列經(jīng)過(guò)確認(rèn)，與Vpu是一致的。
實(shí)施例9Vpu在磷脂雙分子層內(nèi)形成離子通道為了測(cè)定Vpu的離子通道形成作用，進(jìn)行平面磷脂雙分子層的重建。當(dāng)將純化后的重組Vpu樣本(含有7至70ng蛋白質(zhì))加入到雙分子層儀器CIS腔內(nèi)的1ml緩沖液中時(shí)，攪拌從2至30分鐘不等的時(shí)間后檢測(cè)電流波動(dòng)(圖3)。觀察通道活動(dòng)所花費(fèi)的該時(shí)間大致與加入到腔內(nèi)的蛋白質(zhì)量有相互關(guān)系。當(dāng)將對(duì)照緩沖液試樣或?qū)φ罩|(zhì)小泡加入到CIS腔內(nèi)時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到通道。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，即使對(duì)腔攪拌超過(guò)一小時(shí)也可能沒(méi)有通道活動(dòng)的表現(xiàn)。
實(shí)施例10Vpu通道的性質(zhì)在超過(guò)40名個(gè)體的實(shí)驗(yàn)中觀察通道活動(dòng)，其中的Vpu樣本是從五種獨(dú)立的純化方法制備的。在不同的實(shí)驗(yàn)中，電流幅度在大范圍內(nèi)變化，同樣似乎與所加入的蛋白質(zhì)量有相互關(guān)系。所測(cè)量的最小和最大通道分別具有14pS和280pS的電導(dǎo)率。通道始終較小的條件是制備了含有Vpu的脂質(zhì)小泡并使其與雙分子層融合，而不是加入純化蛋白質(zhì)的洗滌劑溶液。這可能是因?yàn)榍罢叻椒òㄓ酶邼舛认礈靹┨幚砗拖♂尩牟襟E，這也許有利于大的聚集物破碎為單體。
電流幅度與電壓之間呈線性關(guān)系，含有十倍梯度NaCl的溶液(500mM CIS；50mM TRANS)中的逆電位為+30mV(圖3B)。若溶液含有KCl而不是NaCl，則得到近似的逆電位。在對(duì)膜的一側(cè)所進(jìn)行的5次實(shí)驗(yàn)中，溶液含有NaCl或KCl，平均逆電位為31.0±1.2mV(±SEM)。這比僅允許陽(yáng)離子透過(guò)的選擇性通道的預(yù)期值更趨于負(fù)值。采用Goldman-Hodgkin-Katz方程中的離子活動(dòng)，得到PNa/PCl比約為5.5，說(shuō)明通道也允許氯離子透過(guò)。用磷酸鹽代替氯離子，試圖降低陰離子電流。當(dāng)采用磷酸鈉梯度(150mM Na+& 100mM磷酸鹽CIS；15mM Na+& 10mM磷酸鹽TRANS,pH6.8)代替NaCl梯度時(shí)，逆電位為37.1±0.2(±SEM,n=2)，再次說(shuō)明陽(yáng)離子/陰離子透過(guò)比約為5。(關(guān)于涉及磷酸鹽溶液的計(jì)算，采用一價(jià)與二價(jià)陰離子的活動(dòng)之和，并且假定這兩種離子的透過(guò)性是相等的。)電流-電壓曲線表現(xiàn)出在NaCl溶液中所沒(méi)有見(jiàn)到的矯正?？梢缘贸鼋Y(jié)論，由Vpu所形成的通道對(duì)Na+和K+的透過(guò)性是相等的，并且也可透過(guò)氯離子以及磷酸根離子，只是程度較低而已。
實(shí)施例11用于篩選潛在的離子通道阻斷藥物的生物測(cè)定法作為阻斷Vpu離子通道的藥物研究的一部分，有人開(kāi)發(fā)了新穎的生物測(cè)定法，促進(jìn)了在雙分子層測(cè)定法中進(jìn)行緩慢的篩選過(guò)程(Ewart等，1996)。這種生物測(cè)定法基于下列觀察結(jié)果大腸埃希氏桿菌內(nèi)Vpu的表達(dá)形成位于質(zhì)膜內(nèi)的活性Vpu通道，該通道使跨膜鈉梯度消失。作為這種Vpu通道活動(dòng)的結(jié)果，被鈉依賴(lài)性協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)劑(例如脯氨酸或腺嘌呤)介導(dǎo)而蓄積在細(xì)胞內(nèi)的代謝物從細(xì)胞內(nèi)漏出的速度快于它們合成的速度，使代謝物的細(xì)胞內(nèi)水平限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，表達(dá)Vpu的大腸埃希氏桿菌細(xì)胞不能生長(zhǎng)在缺少腺嘌呤或脯氨酸的最低漏失培養(yǎng)基(minimal drop-out media)中。不過(guò)，在阻斷Vpu通道的藥物的存在下，細(xì)胞又能夠重新建立它的跨膜鈉梯度--由于膜內(nèi)其它離子泵的作用--并且防止了代謝物的滲漏，使細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。如下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以證明Vpu能夠在大腸埃希氏桿菌質(zhì)膜內(nèi)形成鈉通道為了在大腸埃希氏桿菌內(nèi)表達(dá)未融合的Vpu，將Vpu的可讀框架克隆在質(zhì)粒pPL451(19)內(nèi)，以創(chuàng)建重組質(zhì)粒pPL-Vpu(圖1b)。在這種載體中，在溫度敏感性cI857阻抑物的控制下采用強(qiáng)大的PL和PRλ啟動(dòng)子，以推動(dòng)表達(dá)，以便在30℃下生長(zhǎng)時(shí)嚴(yán)格阻抑表達(dá)，而將溫度升高至37℃與42℃之間則能夠誘導(dǎo)表達(dá)。在瓊脂培養(yǎng)皿上，含有pPL-Vpu的細(xì)胞生長(zhǎng)在30℃和37℃下，但在42℃下不生長(zhǎng)，而對(duì)照菌株在42℃下生長(zhǎng)良好。含有pPL-Vpu的液體細(xì)胞培養(yǎng)物在30℃下生長(zhǎng)至OD600=0.84，然后在42℃下生長(zhǎng)兩小時(shí)(最終細(xì)胞密度為OD600=0.75)。制備質(zhì)膜部分，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析，采用與Vpu C-端特異性結(jié)合的抗體，在大約16kDa處檢測(cè)到單一的譜帶，說(shuō)明Vpu被表達(dá)并且與膜締合(圖2A，帶5)。
實(shí)施例12交叉供應(yīng)實(shí)驗(yàn)揭示脯氨酸從表達(dá)Vpu的細(xì)胞中漏出大腸埃希氏桿菌對(duì)脯氨酸的攝取特征已被充分地描述過(guò)，氨基酸向細(xì)胞內(nèi)的活性轉(zhuǎn)運(yùn)已知利用鈉梯度作為能源(Yamato等，1994)。為了檢測(cè)是否發(fā)生脯氨酸滲漏，采用下列交叉供應(yīng)測(cè)定法播種脯氨酸與甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸埃希氏桿菌菌株(Met-Pro-)的菌苔，灌注為軟瓊脂，覆蓋在缺少脯氨酸但含有甲硫氨酸的最低漏失培養(yǎng)皿上。將無(wú)菌多孔濾片用含有pPL451對(duì)照質(zhì)?；騪PL-Vpu的Met+Pro+菌株(XL-1藍(lán))接種，放置在軟瓊脂上。然后將培養(yǎng)皿在37℃或30℃下培養(yǎng)兩天。之后，明顯看到在用含有pPL-Vpu的細(xì)胞接種并在37℃下培養(yǎng)的濾片周?chē)?，Met-Pro-菌株呈暈輪狀生長(zhǎng)(圖4A)。這種生長(zhǎng)只能由于濾片上脯氨酸從表達(dá)Vpu的細(xì)胞內(nèi)滲漏。對(duì)照菌株在37℃下顯然沒(méi)有這種滲漏，培養(yǎng)皿上的兩種菌株在30℃下也都不生長(zhǎng)(圖4B)。
與脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)相反，大腸埃希氏桿菌甲硫氨酸通透酶已知屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類(lèi)(Rosen,1987)，因此能夠由ATP提供能量。進(jìn)行上述相同的交叉供應(yīng)實(shí)驗(yàn)，但是將Met-Pro-菌株涂在缺少甲硫氨酸而含有脯氨酸的最低漏失培養(yǎng)皿上。這種菌株在所有濾片周?chē)紱](méi)有明顯生長(zhǎng)(圖4C)，說(shuō)明即使Vpu被表達(dá)，甲硫氨酸也不從XL-1藍(lán)細(xì)胞中漏出。
實(shí)施例13表達(dá)Vpu的大腸埃希氏桿菌細(xì)胞在生長(zhǎng)的外部培養(yǎng)基中需要腺嘌呤人們觀察到，由于腺嘌呤合成途徑中尚未加以特征描述的突變，表達(dá)Vpu的XL1-藍(lán)菌株大腸埃希氏桿菌在37℃下的生長(zhǎng)依賴(lài)于培養(yǎng)基中存在的腺嘌呤。這使開(kāi)發(fā)比上述脯氨酸交叉供應(yīng)測(cè)定法更為簡(jiǎn)單的Vpu離子通道活動(dòng)生物測(cè)定法成為可能將含有pPL-Vpu質(zhì)粒的XL1-藍(lán)細(xì)胞菌苔涂在培養(yǎng)基中缺少腺嘌呤的瓊脂糖培養(yǎng)皿上，將試驗(yàn)其Vpu通道抑制作用的藥物的少量試樣分散地點(diǎn)在瓊脂糖上，將培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(12-36小時(shí))。特定的藥物點(diǎn)樣位置周?chē)袝炤啝钌L(zhǎng)，說(shuō)明藥物已經(jīng)抑制了Vpu離子通道活動(dòng)的表達(dá)，后者在沒(méi)有藥物的存在下是阻止生長(zhǎng)的。
實(shí)施例14生物測(cè)定法揭示5-(N,N-亞己基)阿米洛利是潛在的通道阻斷劑利用該測(cè)定法，試驗(yàn)了大量金剛烷胺衍生物，但是發(fā)現(xiàn)它們都不影響通道活動(dòng)。不過(guò)，在試驗(yàn)大量阿米洛利衍生物時(shí)，5-(N,N-亞己基)阿米洛利(HMA)點(diǎn)樣位置周?chē)臅炤啝钌L(zhǎng)鑒定了該藥物是潛在的Vpu通道阻斷劑(圖5)。未取代的阿米洛利在這些培養(yǎng)皿上不產(chǎn)生細(xì)菌生長(zhǎng)的暈輪。
實(shí)施例15平面脂質(zhì)雙分子層實(shí)驗(yàn)確認(rèn)HMA是Vpu通道抑制劑HMA對(duì)Vpu離子通道活動(dòng)的抑制作用在平面脂質(zhì)雙分子層實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)(圖6)，其中發(fā)現(xiàn)濃度為50-250μM的HMA阻斷離子流經(jīng)通道。將母體化合物阿米洛利和另一種衍生物5-(N,N-二甲基)阿米洛利(DMA)類(lèi)似地在平面脂質(zhì)雙分子層實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DMA抑制通道活動(dòng)，不過(guò)沒(méi)有HMA那么強(qiáng)大。阿米洛利本身在這些濃度下沒(méi)有通道阻斷劑的活性。
實(shí)施例16HMA和DMA抑制人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的HIV-1復(fù)制進(jìn)行隨后的試驗(yàn)，以確定HMA和DMA是否存在抗病毒活性。進(jìn)行了兩項(xiàng)試驗(yàn)，以特征化描述藥物對(duì)人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)HIV復(fù)制的作用a)利用PCR類(lèi)測(cè)定法檢測(cè)從HIV基因組逆轉(zhuǎn)錄新近合成的DNA，這是病毒復(fù)制的早期階段；b)利用ELISA法量化病毒蛋白p24的產(chǎn)生，這反映病毒復(fù)制的晚期階段。PCR測(cè)定的結(jié)果說(shuō)明50μM的DMA抑制細(xì)胞內(nèi)HIV DNA的合成；HMA在50μM下是細(xì)胞毒性的--在該藥物的更低濃度下進(jìn)行了進(jìn)一步的試驗(yàn)。p24 ELISA結(jié)果說(shuō)明DMA(50μM，沒(méi)有用數(shù)據(jù)表示出來(lái))和非毒性水平(10μM)下的HMA(圖7)都明顯地抑制HIV病毒體的合成；圖7A顯示HMA對(duì)單核細(xì)胞的作用，圖7B顯示HMA對(duì)巨噬細(xì)胞的作用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到，這里所描述的發(fā)明容易進(jìn)行上述具體內(nèi)容以外的變化和修改。不言而喻的是本發(fā)明包括所有這樣的變化和修改。本發(fā)明也包括本說(shuō)明書(shū)中單獨(dú)或共同提到或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任意兩個(gè)或多個(gè)所述步驟或特征的所有任意組合。
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序列表<110>THE AUSTRALIAN NATIONAL UNIVERSITY<120>調(diào)制離子通道機(jī)能活動(dòng)的方法<130>2222985/TDO<140><141><160>4<170>PacentIn Ver.2.0<210>1<211>82<212>PRT<213>HIV<400>1Met Gln Pro Ile Pro Ile Val Ala Ile Val Ala Leu Val Val Ala Ile1 5 10 15Ile Ile Ala Ile Val Val Trp Ser Ile Val Ile Ile Glu Tyr Arg Lys20 25 30Ile Leu Arg Gln Arg Lys Ile Asp Arg Leu Ile Asp Arg Leu Ile Glu35 40 45Arg Ala Glu Asp Ser Gly Asn Glu Ser Glu Gly Glu Ile Ser Ala Leu50 55 60Val Glu Met Gly Val Glu Met Gly His His Ala Pro Trp Asp Val Asp65 70 75 80Asp Leu<210>2<211>24<212>DNA<213>HIV<400>2agtaggatcc atgcaaccta tacc 24<210>3<211>24<212>DNA<213>HIV<400>3tctggaattc tacagatcat caac 24<210>4<211>21<212>PRT<213>HIV<400>4Cys Ala Leu Val Glu Met Gly Val Glu Met Gly His His Ala Pro Trp1 5 10 15Asp Val Asp Asp Leu20
權(quán)利要求
1.減少、延緩或抑制HIV機(jī)能活動(dòng)的方法，該HIV已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)所述宿主細(xì)胞的膜離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述膜離子通道是Vpu離子通道。
3.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述HIV機(jī)能活動(dòng)是HIV的復(fù)制。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述宿主細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述宿主細(xì)胞是單核細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物包含吡嗪環(huán)5-位氨基的取代或其功能等價(jià)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是HMA或其功能等價(jià)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述HMA包含下列結(jié)構(gòu)
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是DMA或其功能等價(jià)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述DMA包含下列結(jié)構(gòu)
12.哺乳動(dòng)物HIV感染或AIDS的治療和/或預(yù)防方法，所述方法包括在足以減量調(diào)節(jié)被HIV感染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的藥劑對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥一定時(shí)間，其中所述Vpu機(jī)能活動(dòng)減少、延緩或抑制所述HIV的機(jī)能活動(dòng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述HIV機(jī)能活動(dòng)是HIV的復(fù)制。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述宿主細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述宿主細(xì)胞是單核細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15任意一項(xiàng)的方法，其中所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物包含吡嗪環(huán)5-位氨基的取代或其功能等價(jià)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是HMA或其功能等價(jià)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述HMA包含下列結(jié)構(gòu)
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是DMA或其功能等價(jià)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述DMA包含下列結(jié)構(gòu)
22.藥劑在藥物制備中的用途，該藥物用于哺乳動(dòng)物HIV感染和/或AIDS的治療性和/或預(yù)防性處理，該藥劑減少、延緩或抑制被HIV感染的細(xì)胞的Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述機(jī)能活動(dòng)是HIV復(fù)制的介導(dǎo)作用。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的用途，其中所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述阿米洛利類(lèi)似物包含吡嗪環(huán)5-位氨基的取代或其功能等價(jià)物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是HMA或其功能等價(jià)物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中所述HMA包含下列結(jié)構(gòu)
28.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是DMA或其功能等價(jià)物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的用途，其中所述DMA包含下列結(jié)構(gòu)
30.減少、延緩或抑制受治療者Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的方法，所述方法包括在足以抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的條件下，將有效量的阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物對(duì)所述受治療者給藥一定時(shí)間。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述Vpu離子通道活動(dòng)是HIV復(fù)制的Vpu離子通道介導(dǎo)作用。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物包含吡嗪環(huán)5-位氨基的取代或其功能等價(jià)物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是HMA或其功能等價(jià)物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述HMA包含下列結(jié)構(gòu)
35.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是DMA或其功能等價(jià)物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述DMA包含下列結(jié)構(gòu)
37.用于減少、延緩或抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的藥劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的藥劑，其中所述Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)是HIV復(fù)制的介導(dǎo)作用。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的藥劑，其中所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的藥劑，其中所述阿米洛利藥劑是HMA或其功能等價(jià)物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的藥劑，其中所述HMA包含下列結(jié)構(gòu)
42.根據(jù)權(quán)利要求39的藥劑，其中所述阿米洛利藥劑是DMA或其功能等價(jià)物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的藥劑，其中所述DMA包含下列結(jié)構(gòu)
44.用于減少、延緩或抑制Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)的藥物組合物，所述組合物包含按照權(quán)利要求1至21任意一項(xiàng)所定義的藥劑和一種或多種藥物可接受的載體和/或稀釋劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的藥物組合物，其中所述藥劑是阿米洛利類(lèi)似物或其功能等價(jià)物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是HMA或其功能等價(jià)物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所述HMA包含下列結(jié)構(gòu)
48.根據(jù)權(quán)利要求44的藥物組合物，其中所述阿米洛利類(lèi)似物是DMA或其功能等價(jià)物。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述DMA包含下列結(jié)構(gòu)
全文摘要
本發(fā)明一般性涉及延緩、減少或抑制病毒機(jī)能活動(dòng)的方法,確切地說(shuō)涉及通過(guò)減量調(diào)節(jié)Vpu離子通道機(jī)能活動(dòng)來(lái)減少、延緩或抑制病毒機(jī)能活動(dòng)的方法。更確切地,本發(fā)明提供通過(guò)抑制Vpu離子通道介導(dǎo)的HIV復(fù)制來(lái)治療HIV感染或AIDS的方法。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1323212SQ99812019
公開(kāi)日2001年11月21日 申請(qǐng)日期1999年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月12日
發(fā)明者G·考克斯, G·艾瓦特, P·蓋格 申請(qǐng)人:澳大利亞國(guó)立大學(xué)