一種電壓門控鈉離子通道Nav1.9異源表達(dá)系統(tǒng)及應(yīng)用
【專利摘要】一種電壓門控鈉離子通道Nav1.9異源表達(dá)系統(tǒng)及應(yīng)用?；诘鞍兹诤媳磉_(dá)策略，成功構(gòu)建一種在異源細(xì)胞（ND7/23細(xì)胞和CHO?K1細(xì)胞）功能性表達(dá)的Nav1.9異源表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)的電流幅度較大且穩(wěn)定、具有DRG細(xì)胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學(xué)特征，用于研究Nav1.9藥理學(xué)及作用于Nav1.9的藥物分子篩選。
【專利說明】
一種電壓門控鈉離子通道Nav1.9異源表達(dá)系統(tǒng)及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中一種表達(dá)系統(tǒng)及應(yīng)用，具體涉及一種疼痛相關(guān)鈉離子通道Nav1.9異源表達(dá)系統(tǒng)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Navl.9電流在小直徑的DRG細(xì)胞和三叉神經(jīng)等外周傷害感覺神經(jīng)元中高表達(dá)，對(duì)比另外8個(gè)鈉離子通道，Navl.9具有獨(dú)特的電生理特性使得其在神經(jīng)元中扮演著一個(gè)“閾值通道”，能放大細(xì)微的閾下刺激而介導(dǎo)動(dòng)作電位的產(chǎn)生從而引起神經(jīng)元的興奮。近年來大量的研究證明Navl.9在炎性、神經(jīng)性疼痛以及冷覺感知中扮演重要的角色。特別是隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，鑒定到多個(gè)Navl.9通道編碼基因突變引起神經(jīng)性疼痛和家族性的神經(jīng)性疾病。因此Navl.9與疼痛相關(guān)的研究是研究者聚焦的一個(gè)熱點(diǎn)。再者，目前Navl.9幾乎不能異源表達(dá)的問題是世界公認(rèn)的，并且在低溫(28°C)培養(yǎng)轉(zhuǎn)入ND7/23細(xì)胞也只有300pA左右的電流產(chǎn)生，且電流不穩(wěn)定，無論是對(duì)Navl.9的藥理學(xué)研究和藥物篩選都存在很大的限制，這實(shí)際上也是導(dǎo)致對(duì)Navl.9研究進(jìn)展相對(duì)較為緩慢的原因之一。因此，構(gòu)建一個(gè)能穩(wěn)定表達(dá)Navl.9電流的異源表達(dá)系統(tǒng)是急待解決的關(guān)鍵技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明旨在于提供一種Nav1.9的異源表達(dá)系統(tǒng)及應(yīng)用，該表達(dá)系統(tǒng)能夠穩(wěn)定表達(dá)電流幅度大的Nav1.9電流，以解決Nav1.9疼痛相關(guān)研究中電流表達(dá)的關(guān)鍵問題。
[0004]下面結(jié)合附圖對(duì)本研究作進(jìn)一步的說明說明書附圖
圖1 Nav1.9-GFP蛋白框架圖；
圖2 Nav1.9-GFP在ND7/23細(xì)胞中表達(dá)的電生理特征圖譜；
圖3 Nav1.9-GFP在CHO-Kl細(xì)胞中表達(dá)的電流圖。
[0005]跨膜蛋白的功能性表達(dá)與翻譯修飾后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)主要是由于跨膜蛋白的胞內(nèi)段所影響(N-端、C-端和三個(gè)胞內(nèi)連接區(qū))。以CDSa為模式分子研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留情況，我們將五個(gè)胞內(nèi)區(qū)分別嵌入⑶8α的C-端，發(fā)現(xiàn)Nav1.9的C-端存在顯著的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)。由于通道的C-端自身柔性大，存在多個(gè)調(diào)控位點(diǎn)，可能C-端是影響Nav1.9異源表達(dá)的一個(gè)重要原因。據(jù)這一點(diǎn)，我們經(jīng)過數(shù)年探索，基于蛋白融合表達(dá)策略，成功構(gòu)建了一個(gè)在異源細(xì)胞(ND7/23細(xì)胞和CHO-Kl細(xì)胞)功能性表達(dá)的Nav1.9異源表達(dá)體系，其表達(dá)的電流幅度較大且穩(wěn)定、具有DRG細(xì)胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學(xué)特征；
本發(fā)明構(gòu)建的Nav1.9表達(dá)系統(tǒng)具有易操作，電流幅度大且穩(wěn)定，背景干擾小，可對(duì)Nav1.9的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究等優(yōu)勢(shì)，是一個(gè)研究Nav1.9藥理學(xué)及作用于Nav1.9的藥物分子篩選的理想工具。
[0006]【具體實(shí)施方式】:
ND7/23細(xì)胞是大鼠DRG細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的雜交細(xì)胞，CHO-Kl細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞，這兩種細(xì)胞易于培養(yǎng)且相對(duì)穩(wěn)定，在電生理研究中常被用來各種離子通道的表達(dá)。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)Nav1.9的融合蛋白(稱為Nav1.9-GFP)，表達(dá)于ND7/23細(xì)胞中，培養(yǎng)36h后進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。
[0007]1.本發(fā)明關(guān)鍵技術(shù)
1.1以pEGFP-ΝΙ表達(dá)載體為模板，構(gòu)建hNavl.9(p.V165I )-linker_GFP融合蛋白，簡(jiǎn)稱Nav1.9-GFP。如圖1所示，人類Nav1.9(p.V165I)蛋白和通過短的I inker (ARDPPAA)連接綠色熒光蛋白GFP;
1.2異源細(xì)胞表達(dá):根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的要求，將4yg Nav1.9-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入密度約90%的ND7/23或CHO-Kl細(xì)胞中，6小時(shí)后用胰酶消化更換成正常培養(yǎng)基放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)，然后再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入29 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)20小時(shí)后即可進(jìn)行電生理分析和其他Nav1.9相關(guān)研究。
[0008]
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 Nav1.9-GFP在ND7/23細(xì)胞中表達(dá)的電生理特征
如圖2所示，轉(zhuǎn)染Nav1.9通道后通過膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄的最大電流只有200pA左右(圖2A左)，而轉(zhuǎn)染Nav1.9-GFP通道的最大激活電流近1.5nA(圖2A右)，電流密度顯著增大(圖28，20。表明似￥1.9-6??能在仰7/23細(xì)胞中表達(dá)幅度大且穩(wěn)定的似￥1.9電流。并且Nav1.9-GFP表達(dá)的電流在記錄的十分鐘內(nèi)保持穩(wěn)定(圖2D);
Nav1.9-GFP的激活曲線和穩(wěn)態(tài)失活曲線，兩者有較大重疊區(qū)，這與文獻(xiàn)報(bào)道類似(圖
2E)；
2.2圖3所示，Nav1.9-GFP在CHO-Kl細(xì)胞中表達(dá)也能產(chǎn)生大的電流。
[0009]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過蛋白融合表達(dá)策略構(gòu)建的Nav1.9異源表達(dá)體系在ND7/23細(xì)胞以及CHO-Kl細(xì)胞中均能表達(dá)幅度較大且穩(wěn)定的電流，具有DRG細(xì)胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學(xué)特征。并且利用該系統(tǒng)驗(yàn)證了已報(bào)道的致病突變的電生理特點(diǎn)，跟報(bào)道的結(jié)果一致。因此，本發(fā)明構(gòu)建的鈉離子通道Nav1.9異源表達(dá)系統(tǒng)，是研究Nav1.9與疼痛疾病相關(guān)的分子機(jī)制以及作用于Nav1.9的藥物分子篩選的理想工具。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鈉離子通道Navl.9異源表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，基于蛋白融合表達(dá)策略構(gòu)建一種在異源細(xì)胞功能性表達(dá)的Nav1.9異源表達(dá)系統(tǒng)。2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白框架為圖1所示。3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，表達(dá)的電流幅度較大且穩(wěn)定、具有DRG細(xì)胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學(xué)特征。4.一種如權(quán)利要求1?3中所述Navl.9異源表達(dá)系統(tǒng)在Nav1.9藥理學(xué)研究及Nav1.9的藥物分子篩選中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK106047929SQ201610460598
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】劉中華, 梁宋平, 周熙
【申請(qǐng)人】湖南師范大學(xué)