專利名稱：聚乙二醇－grf偶聯(lián)物的位點(diǎn)特異性制備的制作方法
分明領(lǐng)域本發(fā)明涉及位點(diǎn)特異性制備聚乙二醇-GRF偶聯(lián)物的方法。所述偶聯(lián)物相對(duì)每分子hGRF含一個(gè)或多個(gè)PEG單元，它們與Lys12和／或Lys21和／或Nα共價(jià)連接，所述方法的特征在于hGRF肽與活化PEG之間的偶聯(lián)反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，所需hGRF-PEG偶聯(lián)物用層析法純化。
本發(fā)明的目的還包括用所述方法制備此偶聯(lián)物，以及它們?cè)谥委?、預(yù)防或診斷生長(zhǎng)激素相關(guān)性疾病方面的應(yīng)用。
GRF(又稱Somatorelin)是下丘腦分泌的一種肽，作用于受體促進(jìn)垂體前葉分泌生長(zhǎng)素(GH)。其存在形式為44，40或37氨基酸的肽，44氨基酸形式可生理轉(zhuǎn)化成較短的形式。三種形式據(jù)報(bào)道都有活性，活性主要位于前29個(gè)氨基酸殘基。據(jù)歐洲專利EP105759所述，已經(jīng)用重組DNA技術(shù)制備了對(duì)應(yīng)于人GRF1-29氨基酸序列的一種合成肽[hGRF(h-29)]，又稱Sermorelin。
Sermorelin乙酸鹽已被用于診斷和治療生長(zhǎng)素缺乏。
GRF的確具有治療某些生長(zhǎng)素相關(guān)疾病的醫(yī)療價(jià)值。用GRF刺激GH釋放是促進(jìn)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成代謝的一種生理方法。
GRF應(yīng)用中的一個(gè)問(wèn)題是它的生物半衰期很短(約12-30分鐘)。在血漿中，hGRF(1-29)-NH2被二肽基肽酶IV(DPP-IV)在Ala2和Asp3殘基之間切斷，迅速降解。
所以，為了防止或減緩酶降解，有必要對(duì)GRF特殊化學(xué)修飾以開(kāi)發(fā)出生物穩(wěn)定的長(zhǎng)效GRF類似物。
聚乙二醇是一種親水性、生物相容性無(wú)毒聚合物，其通式為H(OCH2CH2)nOH，其中n≥4。其分子量為200至20，000道爾頓不等。
已經(jīng)證明單甲氧基化形式的PEG與蛋白質(zhì)和／或肽化學(xué)偶聯(lián)顯著延長(zhǎng)后者的生物作用。象糖蛋白中的糖基一樣，PEG提供保護(hù)性包膜，使分子增大，因而減少其代謝降解并降低腎清除速度。
PEG偶聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)是一種成熟的肽及蛋白質(zhì)傳遞技術(shù)，進(jìn)行最初基礎(chǔ)研究的是Davis和Abuchowski(Abuchowski等，1977a和1977b)。PEG與肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)一般形成PEG與一個(gè)以上氨基酸殘基的非特異性化學(xué)固著。所以，所述技術(shù)的關(guān)鍵之一是找到合適的化學(xué)方法使PEG分子與特定氨基酸殘基共價(jià)偶聯(lián)。
例如，三氯三嗪活化的PEG具有毒性且反應(yīng)無(wú)特異性，但在被多種帶化學(xué)接頭(linker)的PEG試劑取代后能夠特異性地與氨基(Benchamp等，1983；Veronese等，1985；Zalipsky等，1983；Zalipski等，1990；Delgado等，1990)，巰基(sulphydryl)(Sartore等，1991；Morpurgo等，1996)或胍基殘基反應(yīng)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多PEG-蛋白偶聯(lián)物受到保護(hù)而不被蛋白酶解，而且／或者免疫原性降低(Monfardini等，1995；Yamsuki等，1988)。
蛋白質(zhì)PEG化中的另一技術(shù)難題是因?yàn)镻EG-蛋白偶聯(lián)物一般含不同數(shù)量的固著PEG分子，于是形成PEG蛋白質(zhì)化學(xué)計(jì)量不等的偶聯(lián)物混合物。位點(diǎn)特異性PEG化仍是一個(gè)化學(xué)難題。PEG與GH的偶聯(lián)是上述問(wèn)題的典型例子(Clark等，1996)。已經(jīng)證明，GH任意位置上的Lys殘基均可被PEG化。
為了避免和減少酶活損失，可預(yù)先對(duì)活性位點(diǎn)加保護(hù)，這樣，可以使酶性PEG化發(fā)生在非活性位點(diǎn)(Caliceti等，1993)。
最近，提出了另一種方法，將PEG與固相肽合成制備的低分子量肽(例如GRF)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。在所述偶聯(lián)物中，在固相合成過(guò)程中，將預(yù)先制備的PEG化氨基酸引入肽序列。但是，這一方法大大增加了產(chǎn)品純化的難度，而產(chǎn)品純化是固相合成中的關(guān)鍵步驟。PEG因其高分子量和多分散性使得其存在導(dǎo)致最終產(chǎn)品的純度無(wú)法接受，和／或得到有氨基酸缺失的產(chǎn)品，據(jù)認(rèn)為，后一種情況在Merrifield法中常發(fā)生。
最近的文獻(xiàn)報(bào)道了單PEG化法，即用固相合成法僅將一個(gè)PEG分子固著于[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2特定氨基酸殘基(Felix等，1995)。該項(xiàng)研究顯示第21或25位被PEG化的[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2完全保留親本[Ala15]-hGRF(1-29)-NH2的體外活性。但是，其中沒(méi)有說(shuō)明PEG化偶聯(lián)物是否比非PEG化偶聯(lián)物作用更持久的體內(nèi)數(shù)據(jù)。
最近，已經(jīng)在豬模型和小鼠模型中證明與非PEG化的相比，不同分子量PEG與幾種hGRF類似物C末端固著增強(qiáng)作用持久性(Campbell等，1997)。
已知，hGRF微溶于中性／堿性緩沖液，而這正是PEG化反應(yīng)最有效的化學(xué)條件。在hGRF稀溶液中，活化PEG(例如PEG酯)的水解會(huì)降低PEG化反應(yīng)的得率。
我們發(fā)現(xiàn)在hGRF具有高溶解度的合適溶劑中，有可能進(jìn)行液相的位點(diǎn)特異性PEG化反應(yīng)。如此，即使起始hGRF未被保護(hù)，PEG鏈也會(huì)高得率地幾乎只結(jié)合Lys12、Lys21和／或Nα的伯氨基(ε-氨基)，這取決于反應(yīng)條件。我們得到了同屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的以下4種偶聯(lián)物，其中的hGRF∶PEG化學(xué)計(jì)量主要取決于PEG比hGRF的摩爾比hGRF-PEG偶聯(lián)物其中1分子PEG與Lys12共價(jià)結(jié)合，hGRF-PEG偶聯(lián)物其中1分子PEG與Lys21共價(jià)結(jié)合，hGRF-2PEG偶聯(lián)物其中2分子PEG與Lys12和Lys21共價(jià)結(jié)合，hGRF-3PEG偶聯(lián)物其中3分子PEG與Lys12、Lys21和Nα共價(jià)結(jié)合。
“Nα”在本發(fā)明中表示肽N末端(Tyr)的氨基。
上述步驟之后，可對(duì)反應(yīng)所得偶聯(lián)物進(jìn)行簡(jiǎn)單的層析分離，用凝膠過(guò)濾或直接上到C18 HPLC柱上，用水／乙腈梯度洗脫。優(yōu)選第二種方法，因?yàn)樗捎糜诋a(chǎn)品的大規(guī)模制備和純化。
所以，本發(fā)明的主要實(shí)施例是一種位點(diǎn)特異性制備不同hGRF-PEG偶聯(lián)物的方法，所述偶聯(lián)物，相對(duì)每分子hGRF，含有一個(gè)或多個(gè)與Lys12與和／或Lys21和／或Nα共價(jià)結(jié)合的PEG，所述方法的特征在于PEG化在溶液中進(jìn)行，所需的hGRF-PEG偶聯(lián)物用層性法純化。
含有一個(gè)或多個(gè)與Lys12與和／或Lys21和／或Nα共價(jià)結(jié)合的PEG的PEG-hGRF偶聯(lián)物也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)選化合物是一分子PEG與Lys12或Lys21共價(jià)結(jié)合的hGRF-PEG偶聯(lián)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例，如果上述PEG鏈所結(jié)合的3個(gè)氨基中一個(gè)以上被某些化學(xué)基團(tuán)可逆保護(hù)而不參與PEG化反應(yīng)，將得到特定位點(diǎn)PEG化的所需偶聯(lián)物，然后可用例如超濾或其他層析法從反應(yīng)混合物中分離出這些偶聯(lián)物。此時(shí)，制備方法還可以包括去保護(hù)反應(yīng)。
去保護(hù)反應(yīng)宜根據(jù)要去除的化學(xué)保護(hù)基根據(jù)已知方法進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，如非另作說(shuō)明，“hGRF”包括各種人GRF肽，較好的是1-44，1-40，1-29肽及其對(duì)應(yīng)的酰胺(N末端或C末端具有酰胺基團(tuán))。優(yōu)選的hGRF肽是hGRF(1-29)-NH2，氨基酸序列見(jiàn)SEQ IN NO．1。
“活化PEG”(或“PEG化劑”)是任何因?yàn)榫哂心軌蚺c蛋白質(zhì)／肽內(nèi)某些官能團(tuán)反應(yīng)生成PEG-蛋白質(zhì)／肽而被用作蛋白質(zhì)修飾劑的PEG衍生物。有關(guān)可用作蛋白質(zhì)修飾劑的PEG衍生物可參見(jiàn)Harris(1985)?；罨疨EG可以是烷基化劑，例如PEG醛，PEG環(huán)氧化物或PEG tresylate，或者可以是?；瘎?，例如PEG酯。
最好使用單甲氧基化形式的PEG。其分子量最好在2，000至20，000之間。根據(jù)本發(fā)明，制備活化PEG，最好使用單甲氧基化PEG5，000。
如果活化PEG是?；瘎詈煤型ㄟ^(guò)酰胺鍵與PEG連接的正亮氨酸或鳥(niǎo)氨酸殘基。這些殘基允許準(zhǔn)確測(cè)定每摩爾肽所連接PEG單元(參見(jiàn)Sartore等，1991)。所以，更具體地說(shuō)，優(yōu)選的活化PEG是通過(guò)酰胺鍵與正亮氨酸α氨基結(jié)合的單甲氧基化PEG5，000。
也常使用分支PEG。分支PEG可表示為R(-PEG-OH)m，其中R是諸如戊赤蘚糖醇或甘油之類核心部分，m是分支數(shù)。分支數(shù)m可從3至100以上?？蓪?duì)羥基進(jìn)行化學(xué)修飾。
另一種分支形式例如PCT專利申請(qǐng)WO96／21469所述，僅一個(gè)末端接受化學(xué)修飾。這種PEG可用(CH3O-PEG-)PR-X表示，其中P等于2或3，R是諸如賴氨酸或甘油的核心，X是接受化學(xué)修飾的官能團(tuán)，例如羧基。另一種分支形式，“懸垂式PEG”沿著PEG骨架，而不是位于PEG鏈的末端，具有羧基之類反應(yīng)性基團(tuán)。
所有上述分支PEG都可以如上所述“活化”。
“層析法”指上樣在支持體(固定相)上，溶劑(移動(dòng)相)從中流過(guò)，如此將混合物各組分分開(kāi)的各種技術(shù)。層析法的分離原理是基于固定相和移動(dòng)相的不同物理性質(zhì)。
已知的部分特定類型層析方法包括液相層析，高壓液相層析，離子交換層析，吸附層析，親和層析，分配層析，疏水層析，反相層析，凝膠過(guò)濾層析，超濾層析或薄層層析。
“PEG化”即，通過(guò)該反應(yīng)，由活化PEG和相應(yīng)的蛋白質(zhì)／肽得到PEG-蛋白質(zhì)／肽偶聯(lián)物。
根據(jù)需要高得率得到的是什么偶聯(lián)物，PEG∶hGRF摩爾比可以是1∶1，2∶1或3∶1。
PEG化反應(yīng)的溶劑選自高濃縮煙酰胺水溶液，解折疊劑(例如尿素)的緩沖水溶液或選自二甲基亞砜、二甲基甲酰胺／緩沖液或乙腈／緩沖液的極性有機(jī)溶劑。
溶液的pH一般保持在7至9之間。
Lys12和Lys21的化學(xué)保護(hù)基包括但不限于Alloc(烯丙基氧基羰基)，Dde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧環(huán)己-1-內(nèi)鎓烯)乙基)，Adpoc(1-(1’-金剛烷基)-1-甲基-乙氧基羰基)或2-Cl-Z(2-氯芐基氧基羰基)。Alloc是優(yōu)選的賴氨酸保護(hù)基。
PEG化后，可按照Greene T．W．等1991所述方法之一去除Alloc。Dde可用DMF配制的2％肼溶液去除(W．C．Chan等，1991)。Adpoc的去除與Alloc相似(另可參見(jiàn)Dick F等1997)。2-Cl-Z可能需要更強(qiáng)的酸去保護(hù)(HF、TFMSA、HBr)或j加氫(參見(jiàn)Tam等，1987)。
Nα的保護(hù)基可以是烷基，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基，芐基或環(huán)己基。優(yōu)選異丙基。所述烷基可用還原烷基化反應(yīng)引入(參見(jiàn)Murphy等，1988或Hocart等，1987)。-hGRF和[Lys(Alloc)12，21]-hGRF也是本發(fā)明認(rèn)為有用的新的PEG化中間體。
已知本發(fā)明的PEG化反應(yīng)1．不改變肽的構(gòu)象，2．增強(qiáng)對(duì)蛋白酶解的抗性，3．根據(jù)PEG化程度，不影響，或僅輕微降低生物活性，4．能夠得到在緩沖水溶液中溶解度更高的產(chǎn)物(偶聯(lián)物)。
本發(fā)明的另一目的是提供基本純的hGRF-PEG偶聯(lián)物，使它們適合用作藥物組合物的活性成分。
另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明偶聯(lián)物在制造治療、預(yù)防或診斷生長(zhǎng)素相關(guān)疾病所用藥物中的用途，例如生長(zhǎng)素缺乏(GHD)，尤其是兒童生長(zhǎng)素缺乏。
所述藥物的形式最好是藥物組合物，其中含有本發(fā)明的偶聯(lián)物和一種或多種藥學(xué)上認(rèn)可的載體和／或賦形劑。所述藥物組合物是本發(fā)明的另一項(xiàng)內(nèi)容。
本發(fā)明實(shí)施例之一是將藥學(xué)活性量的本發(fā)明偶聯(lián)物給予可能患生長(zhǎng)素相關(guān)疾病或已經(jīng)顯現(xiàn)出此類病癥的個(gè)體。
本發(fā)明的另一目的是治療、預(yù)防或診斷生長(zhǎng)素相關(guān)疾病的方法，包括給予有效量的本發(fā)明偶聯(lián)物和一種或多種藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑。
“有效量”指活性成分的量足以影響上述疾病的病程和嚴(yán)重性，結(jié)果緩解或壓制所述病癥。有效量取決于給藥途徑和患者情況。
“藥學(xué)上認(rèn)可的”包括任何不干擾活性成分生物活性，對(duì)接受個(gè)體無(wú)毒的載體。例如，若是胃腸外給予，所述活性成分可用諸如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液等運(yùn)載體配制成注射用單位劑型。
除藥學(xué)上認(rèn)可的載體之外，本發(fā)明組合物還可包含少量諸如穩(wěn)定劑、賦形劑、緩沖劑和防腐劑等添加劑。
任何適合主要活性成分的給藥途徑均可使用。優(yōu)選胃腸外給藥，例如皮下、肌內(nèi)或靜脈注射?；钚猿煞值慕o予劑量取決于根據(jù)患者年齡、體重和個(gè)體反應(yīng)所做的處方。
治療人的活性成分劑量約為5-6，000μg／kg體重，更好的是10-300μg／kg體重。
以上參照實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但其內(nèi)涵覆蓋本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明宗旨和范圍內(nèi)所能進(jìn)行的各種修改和替換。
以下，將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，這些實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的限定。


圖1是hGRF(1-29)-NH2的氨基酸序列。箭頭所指是可發(fā)生PEG化的位點(diǎn)。
圖2顯示如實(shí)施例1所述，在DMSO中進(jìn)行PEG化所得混合物的反相HPLC層析。前兩個(gè)主峰是含1分子PEG鏈／摩爾hGRF的偶聯(lián)物。后面的副峰是hGRF∶2PEG偶聯(lián)物，最后面的副峰是hGRF∶3PEG偶聯(lián)物。
圖3a是本發(fā)明hGRF(1-29)和PEG偶聯(lián)物受枯草桿菌蛋白酶的降解。
圖3b是本發(fā)明hGRF(1-29)和PEG偶聯(lián)物受糜蛋白酶的降解。
圖4顯示[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21-hGRF(1-29)-NH2]的圓二色性光譜特征描述。該光譜與“天然”hGRF的重疊。
圖5顯示各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第一DMSO制劑)在CHO-hGRFR-LUC體外試驗(yàn)的生物作用。
圖6告知各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第二DMSO制劑)在CHO-hGRFR-LUC體外試驗(yàn)的生物作用。數(shù)據(jù)代表兩次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。
圖7顯示各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(煙酰胺制劑)在CHO-hGRFR-LUC體外試驗(yàn)的生物作用。數(shù)據(jù)代表兩次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。
圖8說(shuō)明各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第一DMSO制劑)在體外對(duì)大鼠垂體細(xì)胞釋放GH的生物作用。
圖9顯示各種hGRF-PEG偶聯(lián)物(第二DMSO制劑)在體外對(duì)大鼠垂體細(xì)胞釋放GH的生物作用。
圖10顯示給雄性大鼠靜脈注射hGRF(400μg／大鼠)后，血漿hGRF水平和血清GH水平的時(shí)間-反應(yīng)曲線。各點(diǎn)代表9只大鼠的平均值±SEM。
圖11A(該頁(yè)第一圖)顯示給雄性大鼠靜脈注射hGRF(400μg／大鼠)后，血清GH水平的時(shí)間-反應(yīng)曲線。各點(diǎn)代表3只大鼠的平均值。
圖11B(該頁(yè)第二圖)顯示給雄性大鼠靜脈注射hGRF(400μg／大鼠)后，血漿hGRF水平的時(shí)間-反應(yīng)曲線。各點(diǎn)代表3只大鼠的平均值。
圖12評(píng)價(jià)GRF活性的報(bào)導(dǎo)基因試驗(yàn)所用質(zhì)粒pcDNA3-hGRF-R的限制性酶切圖。
圖13顯示評(píng)價(jià)GRF活性的報(bào)導(dǎo)基因試驗(yàn)所用質(zhì)粒pTF5-53LUC的限制性酶切圖。
人GRF1-29hGRF(1-29)-NH2來(lái)自Bachem，用作hGRF肽。
因?yàn)閔GRF(1-29)在PEG化所需中性或微堿性pH下在水溶液中的溶解度很低，所以采用替代反應(yīng)條件A至EA．二甲基亞砜20mg肽溶于1ml DMSO，立即加入適量PEG化劑。
B．體積比1∶1，pH8．0的二甲基甲酰胺／0．2 M硼酸緩沖液立即加入肽和適量PEG化劑。
C．高濃縮煙酰胺水溶液(200mg／ml)將200mg煙酰胺加入40mg hGRF(1-29)在1ml 10mM乙酸中所成溶液。在所述酸性溶液中加pH8．0的0．2M硼酸緩沖液1ml，達(dá)所需pH，然后加適量PEG化劑。
D．立即加入體積比1∶1，pH8．0的乙腈／0．2M硼酸緩沖液和適量PEG化劑。
E．立即加入0．2M硼酸緩沖液，5M尿素，pH8．0和適量PEG化劑。
在優(yōu)選實(shí)施例中，攪拌加入無(wú)水PEG化劑，直至最后的PEG∶hGRF摩爾比為1∶1，2∶1或3∶1。優(yōu)選2∶1。
使用不同的PEG∶hGRF摩爾比能夠制備出以所需偶聯(lián)物為主要偶聯(lián)物的反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物室溫下放置5小時(shí)，然后純化。得到以下4種hGRF-PEG偶聯(lián)物(A1-A4)A1[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2]，A2[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2]，A3[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21-hGRF(1-29)-NH2]，A4Nα-(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12，21hGRF(1-29)-NH2] 。
用1，000D截留值的濾膜凝膠過(guò)濾去除過(guò)量DMSO，二甲基甲酰胺，乙腈或脲以及反應(yīng)副產(chǎn)物(羥基琥珀酰亞胺)。用10mM乙酸將體積調(diào)定為10ml，然后減少到1ml。以上過(guò)程重復(fù)3次。
凝膠過(guò)濾層析或反相層析分離hGRF-PEG偶聯(lián)物。實(shí)施例2凝膠過(guò)濾層析通過(guò)凝膠過(guò)濾層析，產(chǎn)物各組分根據(jù)分子量不同而分離(此時(shí)，偶聯(lián)物hGRF-PEG1∶1的MW=8，358，hGRF-PEG1∶2的MW=13，358，hGRF-PEG1∶3的MW=18，358)。用Superdex 75-Superose 12樹(shù)脂串聯(lián)柱系統(tǒng)(Biotech，Pharmacia)，10ml乙酸，1．5ml／min流速洗脫進(jìn)行分離。
取收集到的流分1m在280nm處OD法分析蛋白質(zhì)含量，碘試驗(yàn)測(cè)定PEG含量(Sims等，1980)。
在DMSO中用摩爾比1∶1的hGRF-PEG PEG化后，得到3個(gè)峰洗脫體積132ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(主峰)；洗脫體積108ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)；和洗脫體積108ml處的非軛體hGRF(副峰)。
在DMSO中用摩爾比1∶2的hGRF-PEG PEG化后，得到3個(gè)峰；洗脫體積108ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(主峰)；洗脫體積132ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)；和洗脫體積73ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)。
在DMSO中用摩爾比1∶3的hGRF-PEG PEG化后，得到2個(gè)峰
洗脫體積73ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(主峰)；和洗脫體積108ml處的hGRF-PEG偶聯(lián)物(副峰)。
收集洗脫峰，用截留值1，000D的濾膜超濾濃縮，冷凍干燥，溶于10mM乙酸，鑒定并定量后進(jìn)行特征描述。
發(fā)現(xiàn)，洗脫體積73ml處的峰對(duì)應(yīng)于化合物A4。
洗脫體積132ml處的峰對(duì)應(yīng)于化合物A3。
洗脫體積108ml處的峰對(duì)應(yīng)于化合物A2和A1的混合物。
232ml處的洗脫峰被發(fā)現(xiàn)是非偶聯(lián)hGRF。
然而，所述方法無(wú)法分離分子量相同僅PEG化位點(diǎn)不同的hGRF-PEG偶聯(lián)物(位點(diǎn)異構(gòu)體)。
實(shí)施例3反相層析用RP-HPLC C18柱進(jìn)行特異性更高的疏水層析。該方法能分開(kāi)分子量相同的異構(gòu)體。實(shí)際上，用這種方法，凝膠過(guò)濾所得對(duì)應(yīng)于共價(jià)結(jié)合1分子PEG的偶聯(lián)物的1個(gè)峰分成了2個(gè)峰。
用RP-HPLC C18制備柱(Vydac)進(jìn)行反相層析，用H2O／0．05％TFA(洗脫液A)和乙腈／=0．05％TFA(洗脫液B)如下梯度洗脫0-5分鐘35％A5-35分鐘 35％A→2％A35-38分鐘 2％A38-40分鐘 2％A→35％B流速10ml／min；環(huán)(loop)1μl；UV-Vis．檢測(cè)器280nm。在DMSO中用摩爾比1∶1的hGRF-PEG PEG化后，得到4個(gè)峰1．13．2分鐘，主峰；2．13．7分鐘，主峰；3．14．4分鐘，副峰；和4．8．9分鐘，副峰。在DMSO中用摩爾比1∶2的hGRF-PEG PEG化后，得到4個(gè)峰1．13．2分鐘，副峰；2．13．7分鐘，副峰；3．14．4分鐘，主峰；和4．15．5分鐘，副峰。
在DMSO中用摩爾比1∶3的hGRF-PEG PEG化后，得到2個(gè)峰1．14．4分鐘，副峰；2．15．5分鐘，主峰。
收集洗脫峰，蒸發(fā)去除乙腈和TFA，然后冷凍干燥。將凍干產(chǎn)品溶于10mM乙酸溶液，如后文所述進(jìn)行分離物的鑒定和定量分析。發(fā)現(xiàn)13．2分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對(duì)應(yīng)于A1化合物(GRF-1PEG，第1峰)。
13．7分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對(duì)應(yīng)于A2化合物(GRF-1PEG，第2峰)。
14．4分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對(duì)應(yīng)于A3化合物(GRF-2PEG)。
15．5分鐘洗出的hGRF-PEG偶聯(lián)物對(duì)應(yīng)于A4化合物(GRF-3PEG)。
8．9分鐘洗出的峰是非偶聯(lián)hGRF。
作為典型實(shí)施例，圖2顯示了用2∶1的PEG∶hGRF摩爾比所得PEG化產(chǎn)物的反相層析。
通過(guò)溶劑蒸發(fā)／冷凍干燥獲得干燥產(chǎn)物。實(shí)施例3a用PEG10，000進(jìn)行的hGRF液相PEG化此實(shí)施例使用分子量為10，000Da，以賴氨酸為間隔基的分支單甲氧基PEG(得自Shearwater Polymer，Inc．)。所述分支PEG為PEG5，000與賴氨酸各氨基連接而得。
賴氨酸間隔基的羧基被活化成琥珀酰亞胺酯，在DMSO中，以0．9摩爾PEG比1摩爾GRF之比與hGRF(1-29)-NH2的氨基反應(yīng)。
去除溶劑，在Superose 12 TM制備柱上凝膠排阻層析分離殘留物。洗出2個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于兩種hGRF-PEG偶聯(lián)物。第一個(gè)副峰對(duì)應(yīng)于2單位PEG10，000與hGRF結(jié)合的偶聯(lián)物，第二個(gè)主峰對(duì)應(yīng)于含1單位PEG10，000／hGRF的偶聯(lián)物。實(shí)施例3a用PEG20，000進(jìn)行的hGRF液相PEG化此實(shí)施例使用分子量為20，000Da，以賴氨酸為間隔基的分支單甲氧基PEG(得自Shearwater Polymer，Inc．)。
所述分支PEG為MPEG10，000與賴氨酸各氨基連接而得。
賴氨酸間隔基的羧基被活化成琥珀酰亞胺酯，在DMSO中，以0．9摩爾PEG比1摩爾GRF之比與hGRF(1-29)-NH2的氨基反應(yīng)。
去除溶劑，在Superose 12 TM制備柱上凝膠排阻層析分離殘留物。只得到1個(gè)峰。這個(gè)峰對(duì)應(yīng)于1單位PEG20，000／hGRF的偶聯(lián)物。實(shí)施例4hGRF-PEG偶聯(lián)物的分析性特征說(shuō)明根據(jù)以下試驗(yàn)，檢測(cè)以上所得產(chǎn)物所結(jié)合的PEG鏈1．用三硝基苯磺酸鹽比色法檢測(cè)游離氨基(參見(jiàn)Habeed等，1966)；2．用碘比色法檢測(cè)PEG含量(參見(jiàn)Sims等，1980)。
3．在氨基酸分析中根據(jù)作為鏈標(biāo)記的正亮氨酸使用PEG鏈數(shù)(參見(jiàn)Sartore等，1991)。
4．用質(zhì)譜法測(cè)定偶聯(lián)物的分子量。
用MALDI質(zhì)譜儀測(cè)定偶聯(lián)物的分子量和由于起始物PEG多分散性造成的多分散性。
根據(jù)氨基酸序列分析hGRF-PEG偶聯(lián)物的PEG結(jié)合位點(diǎn)。每份樣品稀釋100倍。然后將10μl溶液溶液(約50pmol)加入測(cè)序儀。
用RP-HPLC分析型層析測(cè)定最終產(chǎn)品的純度。
分析使用C18分析柱(Vydac)，用H2O／0．05％TFA(洗脫液A)和乙腈／0．05％TFA(洗脫液B)如下梯度洗脫0-5分鐘 80％A5-50分鐘 80％A→5％A50-52分鐘 5％A52-54分鐘 5％A→80％B流速1ml／min；環(huán)20μl；UV-Vis．檢測(cè)器226nm。
20．7分鐘時(shí)洗出的是非偶聯(lián)hGRF。
22．9分鐘時(shí)洗出化合物A1，23．4分鐘時(shí)洗出化合物A2，24．4分鐘時(shí)洗出化合物A3，25．5分鐘時(shí)洗出化合物A4。
用圓二色性分析進(jìn)行“天然”和結(jié)合有聚合物的肽的構(gòu)象特征描述。
用190-300nm范圍內(nèi)的圓二色性分析進(jìn)行非偶聯(lián)hGRF與hGRF-PEG偶聯(lián)物的光譜特征描述。樣品(50μg／ml)溶于10mM乙酸或甲醇／10mM乙酸，摩爾比為30∶70和60∶40。在上述溶液中，如化合物A3的圖4A所示，非偶聯(lián)hGRF與hGRF-PEG偶聯(lián)物的表現(xiàn)可重疊。在乙酸溶液中，肽具有隨機(jī)構(gòu)象，但隨甲醇濃度升高，肽呈現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)。
以上結(jié)果證明PEG偶聯(lián)物不顯著改變肽的結(jié)構(gòu)特征。實(shí)施例 5hGRF-PEG偶聯(lián)物的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)用例如枯草桿菌蛋白酶和糜蛋白酶等蛋白酶考察hGRF和hGRF-PEG偶聯(lián)物的抗蛋白酶解穩(wěn)定性。
用枯草桿菌蛋白酶所做研究為肽在0．1M Tris HCl 0．005M CaCl2pH8．0中所成的0．297mM溶液，以1∶50，000的肽／蛋白酶摩爾比，4℃保溫。
在糜蛋白酶研究中，肽溶于0．08M Tris HCl 0．1M CaCl2pH7．8中，肽／蛋白酶的摩爾比是1∶15，000。
用分析型RP-HPLC跟蹤肽的降解，用的是C18柱，實(shí)施例4中的洗脫條件。在與蛋白酶保溫前和保溫一定的時(shí)間后計(jì)算對(duì)應(yīng)于起始化合物的峰高。估算一定時(shí)間后的殘留峰高百分比，記錄在圖3a和b中。實(shí)施例6使用烷基化PEG的PEG化用不同的酰化基團(tuán)和烷化基團(tuán)活化單甲氧基化PEG，hGRF與之偶聯(lián)。
烷基化PEG具有所得偶聯(lián)物保留賴氨酸上正電荷的優(yōu)點(diǎn)。
如實(shí)施例1-4所述進(jìn)行分離和特征描述。實(shí)施例7hGRF-PEG偶聯(lián)物活性的評(píng)價(jià)材料測(cè)試化合物人GRF1-29hGRF(1-29)-NH2，批號(hào)1299201，Bachem提供；人GRF3-29hGRF(1-29)-NH2，Bachem提供；人GRF3-29，ISL提供；和以上制備的hGRF-PEG偶聯(lián)物。反應(yīng)試劑CHO-hGRF-LUC體外試驗(yàn)含核糖核苷和脫氧核糖核苷(Gibco)，并補(bǔ)充了10％胎牛血清(Gibco)加600μg／ml硫酸遺傳霉素G418(Gibco)的MEMα培養(yǎng)基；細(xì)胞培養(yǎng)物裂解劑(Promega)；熒光素酶試劑(Promega)；和Luclite(Packard)。體外大鼠垂體細(xì)胞生物試驗(yàn)
補(bǔ)充了50μg／ml硫酸慶大霉素(Sigma)的Earle’s平衡鹽溶液(EBSS)(Gibco)。
含Earle’s平衡鹽(Gibco)，12．5％胎牛血清(FBS)(Gibco)和50μg／ml硫酸慶大霉素的199培養(yǎng)基(M199)。
Amersham的大鼠GH試驗(yàn)試劑盒。
用于組織消化的酶溶液(定容至30mlEBBS)120mg膠原酶(Sigma)30mg透明質(zhì)酸酶(Sigma)900mgBSA(Sigma)再生后，溶液過(guò)濾滅菌，保存于37℃。體內(nèi)生物試驗(yàn)Amersham的大鼠GH試驗(yàn)試劑盒。Phoenix Pharmaceutical的人GRF(1-44)放射性免疫試驗(yàn)試劑盒。動(dòng)物SPF成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200-250g，Charles River提供，適應(yīng)至少7天后使用。方法CHO-hGRF-LUC體外試驗(yàn)CHO-hGRF-LUC(克隆1-11-20)是載體pcDNA3-hGRF-R和pTF5-53LUC共轉(zhuǎn)染到CHO-DUKX細(xì)胞系內(nèi)獲得的一個(gè)克隆細(xì)胞系。
質(zhì)粒pcDNA3-hGRF-R是將人生長(zhǎng)素釋放因子受體(hGRF-R)的cDNA插入表達(dá)載體pcDNA3構(gòu)建而成的。含hGRF-R cDNA的Bluescript是Dr．B．Gaylinn(University of Virginia)提供的，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3得自Invitrogen。hGRF-R編碼序列由人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。其限制性酶切圖見(jiàn)圖12。
質(zhì)粒pTF5-53LUC是將c-fos cAMP應(yīng)答元件與熒光素酶編碼序列上游的內(nèi)源性啟動(dòng)子一起插入質(zhì)粒poLuc構(gòu)建而成。cAMP應(yīng)答元件和c-fos啟動(dòng)子來(lái)自質(zhì)粒pTF5-53(參見(jiàn)Fish等，1989)。具有多克隆位點(diǎn)的熒光素酶編碼序列上游的無(wú)啟動(dòng)子報(bào)導(dǎo)基因載體(poLuc)由Dr．Brasier(University of Texas，Galveston)提供。其限制性酶切圖見(jiàn)圖13。
上述共轉(zhuǎn)染得到的CHO-DUKX細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在MEMα培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含核糖核苷和脫氧核糖核苷，并補(bǔ)充了10％胎牛血清加600μg／ml硫酸遺傳霉素G418。
細(xì)胞接種(40，000細(xì)胞／孔)到白色96孔板(Dynatech)上，試驗(yàn)前在200μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-18小時(shí)。
次日，去除培養(yǎng)基，換以含不同濃度hRGF(1-29)室內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)(Bachem)或不同hRGF-PEG偶聯(lián)物的培養(yǎng)基，然后孔板在37℃，5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用200μl PBS(Sigma)洗滌CHO-hGRF-LUC細(xì)胞2次，然后每孔加50μl細(xì)胞培養(yǎng)裂解劑(Promega)裂解。再室溫培養(yǎng)15分鐘后，加入150μl熒光素酶試劑(Promega)，在發(fā)光光度計(jì)(Dynatech)中讀數(shù)。
另一種方法是，50，000細(xì)胞／孔接種CHO-hGRF-LUC細(xì)胞，與不同hRGF-PEG偶聯(lián)物一起培養(yǎng)后，如前所述用PBS洗滌。每孔加入100μl含鈣離子和鎂離子的PBS，然后加100μl Luclite(Packard)。室溫培養(yǎng)10分鐘后，孔板在發(fā)光光度計(jì)(Lumicount-Packard)中讀數(shù)。
結(jié)果表示為相對(duì)光單位(RLU)。hGRF(1-29)的體外大鼠垂體細(xì)胞生物試驗(yàn)用CO2吸入殺死動(dòng)物(SPF雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200g)取出垂體。將組織切碎，裝入瓶中，用酶溶液消化。瓶在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置1小時(shí)。
回收消化后的組織，洗滌細(xì)胞2次，計(jì)數(shù)細(xì)胞，校正到5×105／ml濃度。細(xì)胞接種(200μl／孔)到48孔板上，板在培養(yǎng)箱中放置72小時(shí)。
72小時(shí)后，細(xì)胞與不同濃度hGRF一起培養(yǎng)4小時(shí)。結(jié)束時(shí)，收集上清液，保存于-80℃。
用購(gòu)得的大鼠GH放射性免疫試驗(yàn)試劑盒測(cè)定各份樣品中的GH含量。體內(nèi)試驗(yàn)給動(dòng)物靜脈注射hGRF(1-29)(400μg／大鼠)。(氯胺酮-賽拉嗪)麻醉動(dòng)物，幾分鐘后收集血液。每鼠從下腔靜脈抽2ml血。將樣品分成2等份收集1ml，37℃保溫3小時(shí)后離心獲取血清；另1ml收集在含50μl 4mg／ml肝素的小管中，立即保存于冰上，4℃離心獲取血漿。
給不同動(dòng)物注射測(cè)試化合物后，在不同時(shí)刻收集血液樣品。每次試驗(yàn)，每一時(shí)刻共用3只大鼠。
血漿和血清樣品立即冷凍，保存于-20℃。
用購(gòu)得的RIA試劑盒測(cè)定血清GH水平；用購(gòu)得的測(cè)定hGRF(1-44)的RIA試劑盒測(cè)定血漿hGRF水平。結(jié)果注在這一部分和相關(guān)附圖中，“GRF-1PEG第一峰”對(duì)應(yīng)于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-1 PEG第二峰”對(duì)應(yīng)于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-2PEG”對(duì)應(yīng)于[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12．21-hGRF(1-29)-NH2]，“GRF-3PEG”對(duì)應(yīng)于Nα-(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5，000-CH2-CO-Nle-CO)12．21-hGRF(1-29)- NH2]。CHO-hGRF-LUC體外試驗(yàn)圖5和6顯示用DMSO制備的兩批hGRF-PEG偶聯(lián)物在CHO-hGRF-LUC體外試驗(yàn)中的活性。
我們發(fā)現(xiàn)，所有制劑都有活性，但程度略低于“天然”hGRF(hGRF接受與PEG化化合物相同的純化步驟)，GRF-1PEG(第一峰和第二峰)的活性高于GRF-2PEG和GRF-3PEG。hGRF與“天然”hGRF之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有區(qū)別(未給出數(shù)據(jù))。
我們觀察到兩批DMSO制備的hGRF-PEG偶聯(lián)物(圖5和圖6)與兩批煙酰胺溶液制備的偶聯(lián)物(圖7)具有相似的體外生物活性。圖6還顯示與hGRF(1-29)相比，兩種不同的hGRF(3-29)制劑沒(méi)有顯著的體外活性。hGRF1-29的體外大鼠垂體細(xì)胞生物試驗(yàn)在用兩種DMSO制劑中的hGRF-PEG進(jìn)行的試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，GRF-1PEG第一峰是最具活性的化合物，其次是GRF-1PEG第二峰，GRF-2PEG，接著是GRF-3PEG(圖8和9)。以上發(fā)現(xiàn)與報(bào)導(dǎo)基因試驗(yàn)所得非常一致。體內(nèi)試驗(yàn)在初步實(shí)驗(yàn)中，給大鼠靜脈注射400μg hGRF后測(cè)定血清GH水平和血漿hGRF水平。結(jié)果見(jiàn)圖10。如圖所示，GH和hGRF水平都在hGRF注射后10分鐘達(dá)到最高值。然后，血清GH水平迅速下降，60分鐘后回到基線，但在以上時(shí)段，血漿hGRF水平卻維持恒定。
圖11A和11B中顯示的是給大鼠靜脈注射400μg GRF-1PEG第一峰及第二峰、GRF-2PEG和GRF-3PEG(DMSO制劑)后48小時(shí)內(nèi)不同時(shí)刻的血液GH和GRF水平。
與hGRF1-29相似，靜脈注射后10分鐘，上述PEG化制劑都誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)血清GH峰。然而，GRF-1PEG第一峰及第二峰和GRF-2PEG所誘導(dǎo)的GH水平與hGRF1-29的相當(dāng)，GRF-3PEG仍和體外試驗(yàn)結(jié)果一樣，活性較低。
就血漿GRF水平而言，不論使用何種制劑(DMSO或煙酰胺)，用GRF-1PEG第一峰及第二峰所得的情況與GRF-2PEG和GRF-3PEG完全不同。注射GRF-1PEG第一峰及第二峰后48小時(shí)，血漿GRF水平回到基線，而GRF-2PEG和GRF-3PEG水平則較持久。
實(shí)施例8PEG化起始化合物即位點(diǎn)保護(hù)hGRF(1-29)-NH2衍生物的固相合成本實(shí)施例固相合成了在賴氨酸12和21的伯氨基各有一個(gè)特定保護(hù)基(N-烯丙基氧基羰基)的hGRF(1-29)-NH2衍生物。這樣就可以在Nα-末端進(jìn)行位點(diǎn)特異性PEG化。另一種氨基被保護(hù)的衍生物通過(guò)?；忾]Nα-末端和N-烯丙基氧基羰基封閉賴氨酸12制備而得。這種衍生物用于賴氨酸21處的位點(diǎn)特異性PEG化。材料和方法肽合成在Applied Biosystems Inc．431A型肽合成儀上用Fmoc化學(xué)法組裝各種hGRF衍生肽-樹(shù)脂，對(duì)每個(gè)殘基使用低取代(0．16mmol／g)PAL-PEG-PS樹(shù)脂和雙偶聯(lián)及加帽法以獲得最佳的粗產(chǎn)物產(chǎn)量和純度。此外，通過(guò)還原性烷基化人工給[N-異丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-NH2]肽-樹(shù)脂添加一個(gè)N末端異丙基。
全部肽樹(shù)脂用TFA／1，2-乙二硫醇／苯硫醇甲烷／水[10∶0．5∶0．5∶0．5(v／v)]混合物剪切2小時(shí)，MTBE沉淀和離心分離出粗肽。反相梯度HPLC純化冷凍干燥的肽，用Vydac18C制備柱和0．1％TFA水／乙腈緩沖液系統(tǒng)。全部純化肽用分析型反相HPLC和MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行特征描述。材料Fmoc-L-氨基酸(Bachem Bioscience，Perseptive Biosystem，NovaBiochem)，DMF，20L轉(zhuǎn)鼓(drum)(J．T．Baker)，哌啶(Applied Biosystems，Chem-Impex)，HBTU(Rainin，Richelieu Biotechnologies)，NMM(Aldrich)，AceticAnhydride(Applied Biosystems)，樹(shù)脂(Perseptive Biosystems Novabiochem)，芥子酸(Aldrich)，2-氰-4-羥-肉桂酸(Sigma)，乙腈(J．T．Baker)，TFA(Sigma，Pierce)，去離子水(Millipore Mille-Q Water System)。其他溶劑和試劑如下試劑／溶劑 供應(yīng)商N(yùn)MP Applied Biosystems Inc．，J．T．BakerHBTUApplied Biosystems Inc．Richelieu Biotechnologies Inc．0．5M HOBt的DMF溶液 Applied Biosystems Inc．2．0M DLEA的NMP溶液 Applied Biosystems Inc．哌碇Applied Biosystems Inc．二氯甲烷Applied Biosystems Inc．乙酸酐 Applied Biosystems Inc．氨基酸ABI 431A合成儀上使用的大多數(shù)FMOC氨基酸是購(gòu)自AppliedBiosystems的已稱重1．0mmol管裝品。FMOC-Lys(Alloc)-OH是購(gòu)自PerseptiveBiosystems(Framignham，MA)的散裝品和室內(nèi)管裝品。所用的全部氨基酸都是L構(gòu)形。
樹(shù)脂用于hGRF類似物的的基本樹(shù)脂是PAL-PEG-PS(肽酰胺接頭-聚乙二醇-聚苯乙烯)樹(shù)脂。PAL-PEG-PS支持體購(gòu)自Perseptive Biosystems，一致具有良好的粗產(chǎn)物得率和純度。0．16mmol／g的低取代樹(shù)脂用于全部衍生物。低取代樹(shù)脂一般用于長(zhǎng)、難序列，通過(guò)減少成長(zhǎng)肽鏈中的空間障礙和β平面形成確保更好的偶聯(lián)。方法鏈組裝-Applied Biosystems Inc．431A型肽合成儀先在Applied Biosystems Inc．431A型肽合成儀上用Fmoc法組裝被保護(hù)肽鏈，該合成儀使用快速FMOC循環(huán)程序(FastMocTM)。用HBTU活化和偶聯(lián)，用20％哌碇去保護(hù)，NMP是用于去保護(hù)、氨基酸溶解和樹(shù)脂洗滌的主要溶劑。氨基酸以已稱重1．0mmol管裝形式引入。0．25mmol FastMocTM循環(huán)使用1．0mmol管和40ml反應(yīng)管。鏈組裝-過(guò)程
0．25mmol程序化循環(huán)的步驟可概括如下1．哌碇去保護(hù)-先用NMP洗滌樹(shù)脂，然后加入18％哌碇／NMP溶液，去保護(hù)3分鐘。倒去反應(yīng)管中的溶液，加入20％哌碇溶液，繼續(xù)去保護(hù)約8分鐘。
2．溶解氨基酸-在小管中加入NMP(2．1g)和0．9mmol 0．45M HBTU／HOBt的DMF(2．0g)溶液，混合6分鐘。
3．NMP洗滌-倒干反應(yīng)容器，樹(shù)脂用NMP洗滌5次。
4．活化氨基酸并轉(zhuǎn)移倒反應(yīng)管(RV)-在小管中加入1m 2M DIEA的NMP溶液開(kāi)始活化已溶解的氨基酸，然后從小管中轉(zhuǎn)移倒RV中。
5．偶聯(lián)和最后洗滌-活化氨基酸和N末端去保護(hù)的肽-樹(shù)脂之間的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行約20分鐘，然后倒干RV，用NMP洗滌樹(shù)脂。
6．加帽反應(yīng)(如有必要)-在反應(yīng)管中加入約12ml 0．5M乙酸酐，0．125MDIEA和0．015M HOBt的NMP溶液，渦流攪拌15分鐘。這將?；瘶?shù)脂上任何未偶聯(lián)的位點(diǎn)，得到截?cái)嘈蛄卸侨笔蛄?，這簡(jiǎn)化了后面的純化步驟。
完整的上述循環(huán)可見(jiàn)Applied Biosystems告使用者書(shū)No．35(431A型上的FastMocTM0．25和0．10)。一次典型合成的標(biāo)準(zhǔn)步驟第1步用DFM洗滌樹(shù)脂3次。
第2步用20％哌碇／DMF進(jìn)行2次5分鐘的去保護(hù)。
第3步用DMF洗滌樹(shù)脂6次。
第4步用HBTU／NMM的DMF溶液活化的氨基酸偶聯(lián)45分鐘。
第5步用DMF洗滌樹(shù)脂3次。
對(duì)于難序列，在偶聯(lián)之后可另外插入一步加帽反應(yīng)，該反應(yīng)用70％乙酸酐的DMF溶液進(jìn)行20分鐘，?；?樹(shù)脂上任何未偶聯(lián)的位點(diǎn)，得到的最終粗產(chǎn)物是截?cái)嘈蛄卸侨笔蛄?。剪切／萃取用于去除?cè)鏈保護(hù)基和從樹(shù)脂上釋放肽的剪切混合物是用于含精氨酸和／或甲硫氨酸肽的標(biāo)準(zhǔn)混合物。用于0．1-1．5g肽-樹(shù)脂的是10ml三氟乙酸，0．5ml去離子水，0．5ml苯硫醇甲烷，0．5ml乙二硫醇(87％三氟乙酸，4．3％去離子水，4．3％苯硫醇甲烷，4．3％乙二硫醇)。剪切過(guò)程將100mg-1g肽-樹(shù)脂裝入20ml玻璃管，冰浴冷卻。制備剪切混合物，也冰浴冷卻，然后加入肽-樹(shù)脂，使得最終體積達(dá)到約10ml。
從冰浴中取出試管，溫?zé)嶂潦覝?。蓋上試管，反應(yīng)混合物室溫下攪拌2小時(shí)。
2小時(shí)后，溶液經(jīng)中孔-粗孔濾膜真空過(guò)濾到30ml冷MTBE中。用1ml TFA洗滌反應(yīng)管，經(jīng)同一過(guò)濾漏斗過(guò)濾到冷MTBE中。然后將整個(gè)懸浮系轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，室溫下2，000rpm離心約10分鐘。吸出上清液，沉淀重懸在40ml冷MTBE中，再次離心。重復(fù)該步驟一次以上。吸出最后的上清液，在沉淀中吹入氮?dú)庖哉舭l(fā)掉大部分殘留的醚。
然后將肽溶于20-30ml 1％-10％乙酸水溶液，用去離子水稀釋至約100-150ml，夾套冷凍(shell frozen)，冷凍干燥。純化RP-HPLC法系統(tǒng)-Waters Delta Prep 4000柱-Vydac反相C18柱，10μm，2．2×25cm(分類號(hào)218TP1022)緩沖液-A水／0．1％TFA，B乙腈／0．1％TFA流速-15ml／min檢測(cè)-Waters 484 UV檢測(cè)器，220nm梯度-可變，一般為0．2％B／min至1．0％B／min將50-100mg冷凍干燥的粗肽溶于200ml 0．1％TFA水溶液。然后通過(guò)“A”緩沖液儲(chǔ)備管將肽溶液直接上到制備柱上，開(kāi)始梯度程序。
收集到的組分在自動(dòng)取樣儀分析型HPLC系統(tǒng)上運(yùn)行通宵。集合經(jīng)峰積分判斷純度高于92％的重疊組分，用去離子水按4∶1稀釋，夾套冷凍，然后在Virtis 25SL Freezedryer上冷凍干燥。特征描述反相HPLC條件系統(tǒng)-Waters 510泵，717自動(dòng)取樣儀，490多波長(zhǎng)UV檢測(cè)儀柱-Vydac C18，5μm，0．46×25cm(分類號(hào)218TP54)緩沖液-A水／0．1％TFA，BACN／0．1％TFA流速-1ml／min檢測(cè)-UV214nm，280nm梯度-2％B／min將0．2-1．0mg／ml冷凍干燥的肽溶于0．1％TFA水溶液至0．5-1．0mg／ml的濃度，制成純化肽樣品。
將15-18μl注射到柱上，用0-50％CAN梯度程序，在25分鐘內(nèi)洗脫。用WatersExpert-Ease軟件收集層析數(shù)據(jù)并保存。質(zhì)譜類型MALDI-TOF(基質(zhì)輔助的激光吸收／離子化飛行時(shí)間)系統(tǒng)Perseptive Biosystems Voyager Elite基質(zhì)用67％ACN／0．1％TFA配制的10mg／ml a-氰基4-羥基肉桂酸溶液，或用50％ACN／0．1％TFA配制的10mg／ml芥子酸溶液將肽樣品溶于50％ACN／0．1％TFA，制備成1-20μmol濃度。在分析板各孔中先加入0．5μl基質(zhì)溶液，然后加入0．5μl肽樣品，然后自然干燥。將分析板放入儀器中，用對(duì)肽優(yōu)化過(guò)的反射器延遲-萃取法(Reflector Delayed-Extraction)掃描和分析樣品。收集并分析每份樣品激光擊打32-128次的累計(jì)數(shù)據(jù)信號(hào)。每次運(yùn)行包括一份樣品和一份用于校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)肽。特異性合成[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-NH2的制備先在Applied Biosystems 431A型肽合成儀(參見(jiàn)前文合成方法部分)上用Fmoc化學(xué)法組裝[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS樹(shù)脂，包括N末端殘基的Fmoc基團(tuán)去保護(hù)。
肽-樹(shù)脂用TFA1，2-乙二硫醇∶苯硫醇甲烷∶水[10∶0．5∶0．5(v／v)]剪切2小時(shí)，MTBE沉淀分離出肽，得到240mg粗肽。Vydac C18柱(22×250mm)制備型反相HPLC純化得到60mg純化產(chǎn)物(分析型HPLC測(cè)得純度＞95％)。MALDI-TOF質(zhì)譜算得3523．8，測(cè)得3524．2。[Nα-異丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-NH2的制備先組裝[Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS樹(shù)脂先在Applied Biosystems 431A型肽合成儀(參見(jiàn)前文合成方法部分)上用Fmoc化學(xué)法組裝[Lys(Alloc)12，21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS樹(shù)脂，包括N末端殘基的Fmoc基團(tuán)去保護(hù)。通過(guò)還原性烷基化進(jìn)行的Nα-異丙基化如Hocart等1987年所述，用氰基硼氫化鈉和對(duì)應(yīng)的酮(丙酮)進(jìn)行肽-樹(shù)脂的還原性烷基化，添加Nα-異丙基。880mg肽-樹(shù)脂(約70μmol)在5ml DCM中溶脹30分鐘，然后加入10mmol(174μl)丙酮在7ml MeOH／1％HOAc中所成溶液，環(huán)境溫度下間或攪拌2小時(shí)。然后加入溶于12ml MeOH／1％HOAc的2mmol(129mg)氰基硼氫化鈉，混合物間或攪拌2小時(shí)，然后靜置過(guò)夜(15小時(shí))。定性水合茚三酮監(jiān)測(cè)顯示反應(yīng)完全(無(wú)蘭色)。肽-樹(shù)脂用TFA1，2-乙二硫醇∶苯硫醇甲烷∶水[10∶0．5∶0．5(v／v)]剪切2小時(shí)，MTBE沉淀分離出肽，得到200mg粗肽。Vydac C18柱(22×250mm)制備型反相梯度HPLC純化，用水／乙腈／0．1％TFA溶液，得到50mg純化產(chǎn)物(分析型HPLC測(cè)得純度＞95％)。MALDI-TOF質(zhì)譜算得3481．9，測(cè)得3481．8。
實(shí)施例9被保護(hù)hGRF(1-29)的PEG化如實(shí)施例8所述制備的hGRF衍生物與實(shí)施例1和6所述的活化PEG偶聯(lián)。
此時(shí)的純化只需分離掉過(guò)量的試劑和副產(chǎn)物，不必進(jìn)行實(shí)施例2和3所述的過(guò)程。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名Applied Research Systerms ARS Holding N．V．(B)街道14 John B．Gorsiraweg(C)城市Curacao(E)國(guó)家The Netherland Antilies(F)郵政編碼無(wú)(G)電話639300(H)傳真614129(ⅱ)發(fā)明名稱GRF-PEG偶聯(lián)物的液相位點(diǎn)特異性制備(ⅲ)序列數(shù)量1(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1．0，1．30版(EPO)(2)SEQ ID NO．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．1Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1510 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg20 2權(quán)利要求
1．一種位點(diǎn)特異性地制備相對(duì)每分子hGRF含一個(gè)或多個(gè)與Lys12和／或Lys21和／或Nα共價(jià)結(jié)合的PEG單元的hGRF-PEG偶聯(lián)物的方法，其特征在于，在溶液中進(jìn)行hGRF肽與活化PEG之間的偶聯(lián)反應(yīng)，從反應(yīng)混合物中分離出所需的hGRF-PEG偶聯(lián)物并純化。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中的溶液是煙酰胺濃縮水溶液或解折疊劑的緩沖水溶液。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中的溶劑是極性有機(jī)溶劑，選自二甲基亞砜，二甲基甲酰胺／緩沖液或乙腈／緩沖液。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中，從反應(yīng)混合物中分離出hGRF-PEG偶聯(lián)物，用層析法純化。
5．根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中的hGRF-肽是hGRF(1-29)- NH2。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中，在PEG化反應(yīng)之前，hGRF在一個(gè)或多個(gè)以下位置被保護(hù)Nα，Lys12和Lys21。
7．根據(jù)權(quán)利要求1或6所述方法，還包括PEG化后去保護(hù)。
8．根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中的活化PEG是單甲氧基化形式的烷基化或?；疨EG。
9．一種相對(duì)每分子hGRF含一個(gè)或多個(gè)與Lys12和／或Lys21和／或Nα共價(jià)結(jié)合的PEG單元的hGRF-PEG偶聯(lián)物。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，1個(gè)PEG單元與Lys12共價(jià)結(jié)合。
11．根據(jù)權(quán)利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，1個(gè)PEG單元與Lys21共價(jià)結(jié)合。
12．根據(jù)權(quán)利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，各有1個(gè)PEG單元與Lys21和Lys21共價(jià)結(jié)合。
13．根據(jù)權(quán)利要求9所述hGRF-PEG偶聯(lián)物，其中，各有1個(gè)PEG單元與Lys21、Lys21和Nα共價(jià)結(jié)合。
14．權(quán)利要求1所述PEG化反應(yīng)的中間體，即[Lys(Alloc)12，21]-hGRF。
15．權(quán)利要求1所述PEG化反應(yīng)的中間體，即[Nα-異丙基-Tyr1，Lys(Alloc)12]-hGRF。
16．權(quán)利要求9至13所述hGRF-PEG偶聯(lián)物作為藥物的用途。
17．權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)所述hGRF-PEG偶聯(lián)物在制造治療、預(yù)防或診斷生長(zhǎng)素相關(guān)疾病所用藥物的用途。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述用途，是用于制造治療或診斷生長(zhǎng)素缺乏(GHD)所用藥物。
19．一種藥學(xué)組合物，含權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)所述hGRF-PEG偶聯(lián)物和一種或多種藥學(xué)上認(rèn)可的載體和／或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種位點(diǎn)特異性地制備相對(duì)每分子hGRF含一個(gè)或多個(gè)與Lys
文檔編號(hào)A61K38/04GK1280483SQ98811759
公開(kāi)日2001年1月17日 申請(qǐng)日期1998年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月3日
發(fā)明者F·M·韋羅內(nèi)塞, P·卡利克埃蒂, O·斯基亞沃內(nèi) 申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司