專利名稱：酸敏空前體脂質(zhì)體及制備和在包封生物技術(shù)產(chǎn)品中應(yīng)用的制作方法
該發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，更具體地說是一種加藥物溶液后，形成等滲的脂質(zhì)體混懸液的空pH-敏感前體脂質(zhì)體，為一種干燥的產(chǎn)品藥物制劑及用途發(fā)明。
pH-敏脂質(zhì)體是一種具有細(xì)胞內(nèi)靶向和控制藥物或生物活性物質(zhì)如基因、核酸、肽、蛋白質(zhì)釋放的功能性載體。在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成后幾分鐘內(nèi)，進(jìn)入溶酶體之前，pH從7.4減至5.3～6.3左右時(shí)，pH-敏脂質(zhì)體膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，促使脂質(zhì)體膜與核內(nèi)體/溶酶體膜的融合，將包封的物質(zhì)導(dǎo)入胞漿及主動(dòng)靶向病變組織，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除(Chu Chun-Jung，Dijkstra Jan，Lai Ming-Zong，et al.Efficiency of cytoplasmic delivery by pH-sensitiveliposomes to cells in culture. PharmaceuticalResearch，1990，7(8)824～834。)細(xì)胞攝取脂質(zhì)體主要通過胞吞途徑，脂質(zhì)體與其內(nèi)含物遇到溶酶體即被降解。能避免降解并能到達(dá)細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)靶向部位的DNA或RNA、核酸量實(shí)際上很少。制成pH敏脂質(zhì)體可在一定程度上避免溶酶體降解并增加包封物攝取量、提高穩(wěn)定性、有效地將包封物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿。用pH敏脂質(zhì)體包封寡核苷酸國(guó)外已有報(bào)道其中與本發(fā)明較相關(guān)的有C.Ropert，M.Lavignon，C.Dubernet，et al..Oligonucliotides Encapsulated in pHSensitive liposomes are efficient toward friend retrovirus.Biochemical andBiophysical Research Communications，1992，183(2)879～885。
前體脂質(zhì)體(Proliposome)為一種干燥的產(chǎn)品，在加入水或藥物水溶液后，分散或溶解形成一個(gè)等滲脂質(zhì)體混懸液，適用于靜脈或其它途徑給藥的新型工藝制品。
脂質(zhì)體中被動(dòng)包封DNA的可行性在70年代末期已用幾種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。例如，大分子量DNA包封于蛋黃磷脂酰膽堿脂質(zhì)體(用DNA溶液水脂膜)。反相蒸發(fā)方法制備獲得多復(fù)層載體粒度大，DNA包封率低，通?；蜣D(zhuǎn)染率低。擠壓法制備的多復(fù)層DNA脂質(zhì)體的粒徑減小，但導(dǎo)致DNA脂質(zhì)體中的回收率低；而且這種運(yùn)載DNA的陽離子脂質(zhì)體通常產(chǎn)生不穩(wěn)定的陽離子脂類的和質(zhì)粒DNA復(fù)合物的異源混合物。這種復(fù)合物的異源性和不穩(wěn)定性無疑造成當(dāng)靜脈注射給藥時(shí)體內(nèi)轉(zhuǎn)染活性差。
將質(zhì)粒DNA包入相對(duì)小并且穩(wěn)定的脂類顆粒中或者脂質(zhì)體中，這避免了質(zhì)粒DNA被核酶破壞。但以往陽離子脂質(zhì)體，例如，將聚賴氨酸或其它聚陽離子聚合物先混合在一起，形成陽離子脂質(zhì)體后毒性大、顯異源性。
本發(fā)明的目的在于提供一種不僅能包封蛋白類藥物和核酸類藥物，并且能靜脈注射、鼻腔給藥或其它途徑給藥，可以廣泛用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)以及臨床的新型前體脂質(zhì)體制劑，并且提供制備此制劑的工藝。
實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)途徑主要有
根據(jù)本發(fā)明，空pH-敏感前體脂質(zhì)體基本組成為大豆磷脂和DC-膽固醇，二者摩爾之比為6∶4；還包括有甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮和維生素E。其中大豆磷脂可以為其它種類的磷脂，甘露醇可以為其它種類的多元醇、多糖，也可以為右旋糖苷、乳糖、蔗糖等。制備中采用聚乙烯吡咯烷酮的濃度范圍0.1-2％；甘露醇的濃度范圍0.5-8％。
根據(jù)本發(fā)明，該脂質(zhì)體的制備工藝為將6.9毫克注射用大豆磷脂與3.1毫克3β[N-N′，N′-二甲氨基乙基-羧基]-膽固醇(DC-膽固醇)二者摩爾比為6∶4、溶解在1毫升乙醇中，置于5毫升茄形瓶，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，制得脂膜。在此脂膜上加入1.0毫升水相(用摩爾濃度為0.01的磷酸鹽緩沖液0.9毫升溶解3.3毫克聚乙烯吡咯烷酮的溶液及含甘露醇16.6毫克的水溶液)，系統(tǒng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下震蕩溶解，再經(jīng)過超聲波分散，在氮?dú)鉀_沖保護(hù)下通過0.2微米孔徑聚碳酸酯微孔濾膜，得脂類溶液，在無菌條件下分裝、冷凍干燥、充氮?dú)夂竺芊?，即得pH敏前體脂質(zhì)體，避光、低溫儲(chǔ)藏。
本發(fā)明通過空白加質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因溶液進(jìn)行水合包封，形成包封質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因pH-敏感脂質(zhì)體混懸液，保持了較高的質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因活性并有增加轉(zhuǎn)染效率。所制備包封質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因脂質(zhì)體比原來質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因轉(zhuǎn)染效率提高。即質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因脂質(zhì)體(空白前體脂質(zhì)體加質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因得)能顯著提高質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因轉(zhuǎn)染效率，其效果優(yōu)于質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因轉(zhuǎn)染效率L-門冬酰胺酶。另外，對(duì)無明顯影響；而質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因高劑量組(1∶10)與對(duì)照組相比有顯著提高基因轉(zhuǎn)染率的作用(P＜0.05)。體外細(xì)胞毒性研究結(jié)果表明，包封質(zhì)粒pGl3報(bào)告基因pH-敏感脂質(zhì)體混懸液，細(xì)胞毒性明顯小于商品化的基因轉(zhuǎn)染劑。
根據(jù)本發(fā)明，采用藥用組成制備出不包封藥物的空pH-敏感前體脂質(zhì)體，既區(qū)別于由藥物和脂類組成的常規(guī)前體脂質(zhì)體，克服其包封藥物穩(wěn)定性問題(藥物本身降解或被氧化)；又區(qū)別于常規(guī)脂質(zhì)體混懸液，克服其混懸液穩(wěn)定性問題(與脂類相關(guān)或藥物從脂質(zhì)體中泄漏)同時(shí)區(qū)別于以往pH-敏感脂質(zhì)體，適合包封多種藥物的空pH-敏感前體脂質(zhì)體。
本發(fā)明研制新方法在于采用藥用脂類和半合成物質(zhì)制備空pH-敏感前體脂質(zhì)體，毒性低、基因轉(zhuǎn)染效率高、包封率高。本發(fā)明將pH敏前體脂質(zhì)體凍干品與DNA、RNA、反義寡核苷酸分別包裝，然后用DNA、RNA、或反義寡核苷酸溶解液將pH敏前體脂質(zhì)體水合制成質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸pH敏脂質(zhì)體混懸液，在制備上是可行的，運(yùn)輸、貯存方便。臨用前調(diào)配，穩(wěn)定性得以提高。由于調(diào)配的pH敏脂質(zhì)體粒徑較小，易于細(xì)胞吞噬后與溶酶體融合，釋放反義寡核苷酸發(fā)揮阻斷基因表達(dá)的生物效應(yīng)。
本發(fā)明可實(shí)施于基因轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，為一種基因治療載體。
本發(fā)明用以下實(shí)施例予以解釋，這些實(shí)施例的目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實(shí)施方法圖1 空pH-敏感前體脂質(zhì)體加硫代反義寡核苷酸溶液形成pH-敏脂質(zhì)體的透射電鏡照片(×1000,000)圖2 空pH-敏感前體脂質(zhì)體加L-門冬酰胺酶溶液形成脂質(zhì)體的粒經(jīng)分布圖3 雞紅細(xì)胞與脂質(zhì)體孵育1.5小時(shí)上清溶血素的釋放依賴于紅細(xì)胞與脂質(zhì)體膜在不同pH值緩沖液中的融合情況實(shí)施例實(shí)施例一pH敏前體脂質(zhì)體水合形成pH敏脂質(zhì)體的形態(tài)和粒度分布觀查采用透射電子顯微鏡觀察空白pH敏前體脂質(zhì)體加入反義寡核苷酸溶液后形成的反義寡核苷酸pH敏脂質(zhì)體的外觀形態(tài)；這種pH敏前體脂質(zhì)體水合后形成pH敏脂質(zhì)體，形態(tài)圓整規(guī)則見圖1，透射電子顯微鏡觀察可見外壁為多層型。
粒徑分布將空白pH敏前體脂質(zhì)體加反義寡核苷酸溶液，水合得到反義寡核苷酸pH敏脂質(zhì)體混懸液，用透射電鏡照相和激光粒度儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒度，結(jié)果表明水合形成的pH敏脂質(zhì)體粒徑大小分布均勻。平均粒徑22.7納米，粒徑分布在12.3納米-389.9納米范圍內(nèi)，粒徑為17.0納米的脂質(zhì)體數(shù)目所占體積百分率為98.51％，見圖2。
實(shí)施例二pH-敏感脂質(zhì)體的體外基因轉(zhuǎn)染將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞，培養(yǎng)液為含10％胎牛血清(FBS)的DMEM，以50％細(xì)胞懸液接種到96孔板上，使實(shí)驗(yàn)組含細(xì)胞pGL3基因0.25微克/孔(50微升)、pH敏脂質(zhì)體按1∶2；1∶4；1∶8；1∶10；1∶12；重量比/孔加入，置于5％CO2培養(yǎng)箱37℃孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。從培養(yǎng)孔中吸棄培養(yǎng)上清，加入新鮮培養(yǎng)液、從培養(yǎng)孔中吸棄上清，重復(fù)三次。加入蟲熒光素酶，立即在多標(biāo)記檢測(cè)儀上讀取熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體組比質(zhì)粒DNA組基因轉(zhuǎn)染率高，分別為質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體組/質(zhì)粒DNA組＝4.438，脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA重量比為1∶2；質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體組/質(zhì)粒DNA組＝10.144，脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA重量比為1∶4；質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體組/質(zhì)粒DNA組＝19.665，脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA重量比為1∶8。即當(dāng)脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA重量比為1∶8時(shí)，質(zhì)粒pGl3基因pH-敏感脂質(zhì)體比原來質(zhì)粒pGl3基因轉(zhuǎn)染效率提高20倍。實(shí)施例三pH敏脂質(zhì)體特性的測(cè)定將雞紅細(xì)胞，以1％個(gè)細(xì)胞懸液加到0.5毫升離心管內(nèi)，使每管100微升紅細(xì)胞、100微升新鮮不同pH值的緩沖液(pH值分別為4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4)。置37℃振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；于1.5小時(shí)，從培養(yǎng)離心管中吸取50微升紅細(xì)胞懸液，離心5000轉(zhuǎn)/分鐘；吸取上清，于96孔板內(nèi)，在多標(biāo)記檢測(cè)儀上540納米讀取吸收值。
在18種pH值緩沖液中雞紅細(xì)胞與脂質(zhì)體孵育5小時(shí)上清溶血素的吸收變化見圖3。圖3表明，雞紅細(xì)胞受到980603、980625脂質(zhì)體作用后溶血素在pH4.2-6.0范圍內(nèi)釋放比空白對(duì)照組顯著增加，而在pH6.2-7.4范圍內(nèi)溶血素釋放比空白對(duì)照組低。進(jìn)而說明在pH4.0-6.0范圍內(nèi)，雞紅細(xì)胞膜與這種脂質(zhì)體膜融合良好。實(shí)施例四脂質(zhì)體對(duì)反義寡核苷酸抗流感病毒活性的影響以106細(xì)胞/孔的量把MDCK細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc)，細(xì)胞生長(zhǎng)液為含10％FBS的DMEM。37℃培養(yǎng)過夜，
權(quán)利要求
1.一種酸敏感前體脂質(zhì)體，其特征在于其組成主要有大豆磷脂和3β[N-N′，N′-二甲氨基乙基-羧基]-膽固醇(DC-膽固醇)及聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇。其中大豆磷脂和3β[N-N′，N′-二甲氨基乙基-羧基]-膽固醇摩爾比為6∶4。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1中的空pH-敏感前體脂質(zhì)體，其中甘露醇可以為其它種類的多元醇，多糖可以為右旋糖苷、乳糖、蔗糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1中的空pH-敏感前體脂質(zhì)體的制備工藝，其特征是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-薄膜水化、超聲-擠壓、凍干三步法完成pH敏前體脂質(zhì)體的制備，而且用乙醇為溶劑，磷酸緩沖液pH為5.4，類脂液經(jīng)過超聲，為制備基本條件。
4.根據(jù)權(quán)利要求書3中的空pH-敏感前體脂質(zhì)體的制備方法，制備中采用聚乙烯吡咯烷酮的濃度范圍0.1-2％；甘露醇的濃度范圍0.5-8％。
5.根據(jù)權(quán)利要求書3中的空pH-敏感前體脂質(zhì)體的制備方法，制備中采用聚乙烯吡咯烷酮的最佳濃度為0.33％；甘露醇的最佳濃度為1.66％。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1中的空pH-敏感前體脂質(zhì)體，可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)生物大分子、DNA、RNA、核酸進(jìn)入細(xì)胞漿，也可以作為基因治療載體因而適用于轉(zhuǎn)運(yùn)多種物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求書1中的空pH-敏感前體脂質(zhì)體，不僅能包封藥物和核酸類藥物，并且能靜脈注射、鼻腔給藥或其它途徑給藥，可以廣泛用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和臨床領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域,采用藥物組成制備出不包封藥物的空酸敏前體脂質(zhì)體,該脂質(zhì)體主要由大豆磷脂和DC膽固醇組成,本發(fā)明還公開了制備工藝和應(yīng)用領(lǐng)域,不僅能包封藥物和核酸類藥物,并且能靜脈注射、鼻腔給藥或其它途徑給藥,可以廣泛用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和臨床領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1256915SQ9812319
公開日2000年6月21日 申請(qǐng)日期1998年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月11日
發(fā)明者王弘, 王志清, 王升啟 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所