專利名稱：Rho gtp酶鳥嘌呤交換因子和編碼該因子的核酸的制作方法
背景技術：
Ras超家族的成員調節(jié)不同的信號傳遞傳遞途徑。該家族的原型Ras與細胞生長和細胞分化的調節(jié)有關(1)。Rho亞家族(Rho,Rac,Cdc42)還涉及細胞生長的調節(jié)以及控制粘著斑的形成和生長因子刺激后所發(fā)生的肌動蛋白細胞骨架方面的改變(2,3,4,5,6,7)。所有Ras家族成員的共同特征是其在無活性(GDP結合的)和活性(GTP結合的)狀態(tài)之間循環(huán)的能力。就此而言，這些GTP酶作為分子開關起作用，能夠加工信息并傳遞信息以控制具體的途徑。
這種在GTP和GDP狀態(tài)之間循環(huán)的特性為鑒定和純化調節(jié)Ras和Ras-相關GTP酶之核苷酸狀態(tài)的蛋白質提供了方法(1)。通過監(jiān)測GTP水解為GDP的情況，已經表征了Ras家族的許多成員的GTP酶激活蛋白(GAP)(1,8,9)?；谄湟种艷DP解離的能力鑒定鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑(GDI)。結果表明它們還與GTP狀態(tài)結合，抑制內在的和GAP刺激的GTP水解(1)?？傊珿AP和效應物對于GTP-結合狀態(tài)有高度的親和性，而GDI蛋白質與GDP-結合狀態(tài)結合最緊密。已經研究了這些特性以純化Cdc42Hs(10,11,12),Ras(13,14)和Rho(15,16)的效應物。一種親和方法也已與Cdc42Hs-GTP一起使用并表征了IQGAPI，所觀察到的Cdc42誘導的細胞骨架過程的一種可能的介導物。
另外，還用這種親和方法的修飾方法鑒定并純化了鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)。GEF因其優(yōu)先與G-蛋白的核苷酸-缺失(depleted)狀態(tài)相互作用的能力而不同于其它調節(jié)蛋白(18,19)。通過刺激GDP的解離和隨后GTP的結合，GEF在Ras樣蛋白質的激活中起重要作用。例如，通過生長因子刺激的Sos運輸，Ras被轉變成其GTP-結合形式，Ras特異性GEF(20)。表征特異性激活Rho家族成員的GEF將有助于說明其中有這些GTP酶參與的信號傳遞傳遞途徑。通過將裂解物與核苷酸-缺失的Rho一起保溫，我們純化了Rho特異性GEF并分離了編碼115kDa蛋白質的cDNA，該cDNA與dbl(21)和lbc癌基因同源(22)。本發(fā)明描述本發(fā)明涉及鳥嘌呤交換因子(GEF)的所有方面，具體地講，GEF為Rho-GEF，如p115Rho-GEF。在體外和體內，GEF通過調節(jié)GTP酶的活性來調節(jié)細胞信號傳遞途徑。為了說明，描述了調節(jié)RhoA GTP酶活性的p115Rho-GEF。但是，本發(fā)明還涉及其它GEF，特別是其它Rho-GEF。本發(fā)明具體涉及分離的p115Rho-GEF多肽或其片段，編碼p115Rho-GEF的核酸和其片段，該多肽和核酸的衍生物。本發(fā)明還涉及例如在治療、診斷中使用所述多肽、核酸或其衍生物的方法，以及用所述多肽、核酸或其衍生物作為研究工具的方法。本發(fā)明的另一方面涉及識別p115Rho-GEF的抗體和其它配體，p115Rho-GEF活性和其它GEF的調節(jié)物，以及治療與Rho GTP酶有關的疾病的方法。本發(fā)明還涉及通過測量其對GEF活性的影響，例如對與GTP酶的結合和/或核苷酸交換活性的影響，用于檢測和/或鑒定調節(jié)GEF之試劑的方法。附圖簡述

圖1是人p115GEF-Rho基因編碼之多肽的完整核苷酸序列(SEQID NO:1)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。發(fā)明詳述根據本發(fā)明，鑒定和分離了一種編碼p115Rho-GEF的新多肽和核酸。文中所用p115Rho-GEF指多肽或編碼p115Rho-GEF多肽的核酸，該多肽對于G-蛋白的鳥嘌呤核苷酸-缺失狀態(tài)(具體是RhoA)有特異性結合親和性，該多肽有鳥嘌呤核苷酸交換活性，癌基因轉化活性和致免疫活性。特異性結合親和性指所述多肽與G-蛋白的核苷酸-缺失狀態(tài)優(yōu)先結合，相反，例如其他調節(jié)蛋白與G-蛋白的GDP-或GTP-結合狀態(tài)優(yōu)先結合。鳥嘌呤核苷酸交換活性指多肽刺激或催化GDP與G-蛋白，例如Rho解離，以及隨后與GTP的結合。細胞癌基因轉化活性指編碼p115Rho-GEF的核酸導入細胞系如NIH3T3細胞后，賦予所述細胞以所轉化的表型。通過例如由Eva and Aronosn，自然316:273-276,1985表征和描述的轉化灶形成可測量所轉化的表型。免疫原性指所述多肽與p115Rho-GEF特異性抗體結合或者能夠引發(fā)p115Rho-GEF特異性的免疫反應。免疫原性將在下文討論，例如按下文實施例所述或本領域技術人員已知的方法，可以檢測p115Rho-GEF多肽的上述活性。p115Rho-GEF多肽或編碼該多肽的相應核酸指可從天然來源分離的多肽。因此，它包括天然正常和突變體等位基因。天然來源包括例如從組織或整個生物體得到的活細胞和培養(yǎng)的細胞系。
人p115Rho-GEF的分子量約為115kDa，含有圖1所列的912個氨基酸(SEQ ID NO:2)?？蓮奶烊粊碓捶蛛x人p115Rho-GEF或其相應基因。下文和實施例中將描述人p115Rho-GEF的表征。
本發(fā)明還涉及p115Rho-GEF的多肽片段。優(yōu)選所述片段有生物活性。生物活性指多肽片段在活系統(tǒng)內具有活性或含有活系統(tǒng)的組分。生物活性包括與G-蛋白特別是RhoA之鳥嘌呤核苷酸-缺失狀態(tài)的特異性結合親和性，鳥嘌呤核苷酸交換活性，癌基因轉化活性，免疫原性，調節(jié)Rho-GEF和Rho GTP酶之間的結合，或作為Rho GTP酶活性的激動劑或拮抗劑。例如按上文和下文所述方法可常規(guī)檢測所述活性。可制備各種片段。例如含有圖1(SEQ ID NO:2)所示氨基酸249-912的多肽(ΔN-p115)具有鳥嘌呤核苷酸缺失的Rho的特異性結合親和性，鳥嘌呤核苷酸交換活性，細胞轉化活性和免疫原性。有關進一步討論參見下文實施例。還可選擇與p115Rho-GEF相比消除或改變了一種或多種所述活性的片段。如在實施例中所討論的，例如通過重組方法或分離多肽的蛋白水解裂解可常規(guī)制備所述片段，然后檢測所需活性。下文表1列出了與各種p115Rho-GEF片段有關的癌基因轉化活性。如下所說明的，缺失p115Rho-GEF N-末端1-82氨基酸可形成含有圖1(SEQ ID NO:2)所示氨基酸83-912的多肽，該多肽消除了轉化活性。另一方面，較大的缺失(249-912)修復了轉化活性(ΔN-p115)。在另一含有N-末端氨基酸和C-末端氨基酸缺失的片段(ΔN-p115Δc)中，與其他片段相比轉化活性有所提高。但是，所述N-和C-末端截短基本上不影響鳥嘌呤核苷酸交換活性。
本發(fā)明還涉及選自圖1(SEQ ID NO:2)所示氨基酸1-912之序列的人p115Rho-GEF特異性氨基酸序列。含所述序列的克隆已于1996年9月10日以No.98164保存于ATCC。p115Rho-GEF特異性氨基酸序列指在所列舉的p115Rho-GEF序列中發(fā)現的，但在另一氨基酸序列中不存在的確定氨基酸序列。用計算機程序的BLAST設置，通過基因/蛋白質數據庫檢索即可常規(guī)發(fā)現特異性氨基酸序列。所述特異性序列包括例如氨基酸803-912。p115Rho-GEF特異性氨基酸序列可用于產生作為抗原的肽，以產生p115Rho-GEF特異性的免疫反應?？蓪⒂盟雒庖叻椒ǖ玫降目贵w作為p115Rho-GEF蛋白的特異性探針用于診斷或研究目的。還可將所述肽用于抑制p115Rho-GEF與Rho的結合以調節(jié)細胞疾病。
可用已知方法分析例如含圖1(SEQ ID NO:2)所示多肽序列的本發(fā)明多肽以鑒定所述多肽的結構和/或功能區(qū)域。例如，當用計算機算法分析圖1所列序列(SEQ ID NO:2)時，鑒定了含有下列區(qū)域的連續(xù)編碼序列膠原蛋白-樣卷曲螺旋，氨基酸1-410；Dbl同源區(qū)域，氨基酸420-637；血小板-白細胞C激酶底物同源區(qū)域，氨基酸646-762?？捎酶鞣N程序分析所述多肽的結構，包括EMBL Protein Predict；Rrost and Sander,Protein,19:55-72,1994；Kyte and Doolittle,J.Mol.Bio.:157:105,1982。
本發(fā)明多肽與SEQ ID NO:2所列氨基酸序列有100％或較低的氨基酸序列同一性。為了進行下列討論序列同一性指在圖1所列序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)中發(fā)現的相同核苷酸或氨基酸在相比較序列的相應位置也可以見到。用各種方法，例如通過保守氨基酸可取代與圖1所列氨基酸序列有低于100％序列同一性的多肽。有關保守氨基酸取代的實施例見下文。相同和保守殘基的總數除以被比較p115Rho-GEF多肽序列中的殘基總數等于序列相似百分比。為了計算序列同一性和相似性，可將被比較序列按照任何所需方法，算法，計算機程序等，包括例如FASTA,BLASTA排列和計算。與圖1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)有低于100％氨基酸序列同一性的多肽可具有約60,65，優(yōu)選67,70,78,80,90,92,96,99等同一性。
p115GEF多肽，片段或取代的p115GEF多肽可含有各種修飾，其中所述修飾包括糖基化，共價修飾(例如氨基酸的R基團)，氨基酸取代，氨基酸缺失，或氨基酸增加?？捎酶鞣N方法，包括重組，合成、化學方法等完成對所述多肽的修飾。
可選擇對p115Rho-GEF多肽的突變以具有p115Rho-GEF生物活性，例如對G-蛋白突變是RhoA鳥嘌呤核苷酸-缺失狀態(tài)的特異性結合親和性，鳥嘌呤核苷酸交換活性，癌基因轉化活性和免疫原性。下文討論p115Rho-GEF突變的選擇和制備。
可以各種方式使用本發(fā)明多肽(例如p115Rho-GEF，其片段，其突變體)，例如作為下文所述抗體的免疫原，作為生物活性劑(例如具有一種或多種p115Rho-GEF相關活性)，作為p115Rho-GEF抑制劑。例如，在p115Rho-GEF與Rho結合后，在細胞中引發(fā)事件的級聯反應，例如促進細胞增殖和/或細胞骨架重排。用p115Rho-GEF的肽片段，例如作為p115Rho-GEF與Rho相互作用(例如結合)之位點的抑制劑的肽片段，可調節(jié)Rho-GEF和Rho之間的相互作用。所述片段可用于調節(jié)與Rho信號傳遞途徑相關的疾病。通過檢測全長p115Rho-GEF重疊片段抑制p115Rho-GEF活性的能力，例如抑制鳥嘌呤核苷酸交換活性、與Rho的鳥嘌呤核苷酸缺失狀態(tài)的結合和癌基因轉化活性的能力，可用常規(guī)方法鑒定有用的片段。在下文和實施例中描述了這些活性的測量方法。也可按EP496162所述，鑒定并制備這些肽。所述肽也可以是經化學修飾的，等等。
在自然中沒有的，即非天然的排列中，例如在正常p115Rho-GEF基因，或從活生物體如動物，優(yōu)選哺乳動物，例如人、小鼠或其細胞系的基因組制備的基因組片段中，可將編碼p115Rho-GEF多肽的核苷酸序列或其衍生物或其片段與一個或多個結構區(qū)域、功能區(qū)域、可檢測區(qū)域、抗原性區(qū)域和/或所需的多肽組合。具有所述特征的多肽是嵌合或融合多肽。所述嵌合多肽可通過各種方法制備，包括化學法、合成法、似合成法和/或重組方法。在例如含內含子、剪接位點、增強子等的連續(xù)的或間斷的開放閱讀框架中，編碼所述嵌合多肽的嵌合核酸可含有各種區(qū)域或所需多肽。嵌合核酸可用各種方法生產。參見，例如美國專利5439819。區(qū)域或所需多肽可具有任何所需的特性，包括生物功能例如催化、信號傳遞、生長促進、細胞導向功能等，結構功能例如疏水、親水、跨膜等，受體-配體功能和/或可檢測功能，例如與酶、熒光多肽、綠熒光蛋白GFP結合(Chalfie等，1994，科學，263:802；Cheng等1996自然生物技術(Nature Biotechnology),14:606；Levy等，1996，自然生物技術，14:610等)。另外，在導入宿主細胞時，可將p115Rho-GEF核酸或其部分用作選擇性標記。例如可將編碼本發(fā)明氨基酸序列的核酸在框架中與所需的編碼序列融合，然后作為用于純化、篩選或標記目的的標記物起作用。融合區(qū)編碼裂解位點。
根據本發(fā)明，可用表達系統(tǒng)例如體內、體外、無細胞、重組體、細胞融合等生產本發(fā)明的多肽。通過所述系統(tǒng)對所述多肽進行的修飾包括糖基化，氨基酸取代(例如使用不同的密碼子)，多肽加工例如消化，裂解，內肽酶或外肽酶活性，化學組成成分包括脂質或磷酸酯的連接等。例如，某些細胞系可從表達的多肽中除去末端甲硫氨酸。
按照常規(guī)方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，羥磷灰石層析和植物凝血素層析從天然來源、轉化的宿主細胞(培養(yǎng)基或細胞)中回收本發(fā)明的多肽。在純化過程中保持低濃度(約0.1-5mM)鈣離子是有益的(Price，等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)244:917(1969))。根據需要，在完成成熟蛋白質的構型中，可利用蛋白質的再折疊步驟。最后，在最后的純化步驟中使用高效液相層析(HPLC)。
根據本發(fā)明，編碼p115Rho-GEF的核酸可含有例如從圖1所列氨基酸1至氨基酸912的完整編碼序列(SEQ ID NO:1)。本發(fā)明核酸還可含有與上文和下文所述的任何核苷酸序列100％互補的核苷酸序列，例如，反義序列。
本發(fā)明核酸可從各種不同的來源得到。所述核酸可得自DNA或RNA，例如從組織、細胞或全生物體分離的聚腺苷酸化mRNA。所述核酸可直接得自DNA或RNA，或得自cDNA文庫。所述核酸可得自處于特定發(fā)育階段，有所需基因型、表型的細胞(例如癌基因轉化的細胞或癌細胞)等。
含編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的核酸可僅含有p115Rho-GEF的編碼序列；p115Rho-GEF的編碼序列和其他編碼序列(例如前導肽、分泌肽、導向肽、酶、熒光或其他診斷肽的編碼序列)，p115Rho-GEF的編碼序列和非編碼序列，例如在5’或3’末端的非翻譯序列，或分散在編碼序列中的非翻譯序列，例如內含子。含不中斷的編碼p115Rho-GEF多肽的核苷酸序列的核酸指所述核苷酸序列含有p115Rho-GEF多肽的氨基酸編碼序列，而且在編碼序列中沒有非編碼核苷酸，例如沒有內含子。也可以認為所述核苷酸序列是連續(xù)的。
本發(fā)明的核酸還可含有與上述核酸有效相連的表達控制序列?！氨磉_控制序列”一詞指調節(jié)核酸編碼之多肽的表達的核酸序列，該核酸序列與編碼所述多肽的核酸有效相連?？梢栽趍RNA或多肽水平上調節(jié)表達。因此，表達控制序列包括mRNA-相關的元件和蛋白質-相關元件。所述元件包括啟動子，增強子(病毒或細胞的)，核糖體結合序列，轉錄終止子等。當表達控制序列以影響或完成編碼序列表達的方式定位時，表達控制序列與核苷酸編碼序列有效相連。例如當啟動子與編碼序列5’有效相連時，所述編碼序列的表達受該啟動子的控制。表達控制序列可與正?；虍愒椿蚴撬稣；騼仍吹?。
可在核酸雜交的基礎上篩選本發(fā)明核酸。兩個單鏈核酸制品雜交在一起的能力是其核苷酸序列互補性例如核苷酸間的堿基-配對，如A-T,G-C等的測量標準。因此，本發(fā)明還涉及含有與圖1所列核苷酸序列(SEQ ID NO:1)雜交之核酸的核酸。與后一種序列雜交的核苷酸序列應有一互補核酸鏈，或在存在聚合酶(即適宜的核酸合成酶)的條件下，作為一核酸鏈的模板起作用。本發(fā)明包括核酸的兩個鏈，例如有義和反義鏈。
可選擇雜交條件以便篩選與圖1所列核苷酸序列(SEQ ID NO:1)有所需核苷酸互補性的核酸。能夠與所述序列雜交的核酸優(yōu)選在序列之間有50％，最佳為70％的互補性。本發(fā)明具體涉及在嚴緊條件下，與圖1所列核苷酸序列(SEQ ID NO:1)雜交的DNA序列。文中所用的“嚴緊條件”指在核酸間有至少約95％，優(yōu)選97％核苷酸互補性時，可發(fā)生雜交的任何條件。所述條件包括例如Northern雜交在42℃,5XSSPE,10X Denhardts溶液，100μg/ml新鮮的變性和剪切鮭精DNA,50％甲酰胺，2％SDS；用于從cDNA文庫中克隆的雜交在42℃,1X PAM,0.1％SDS,50％甲酰胺。因此，本發(fā)明還涉及在例如心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸和外周血白細胞中表達的約7kb核酸。本發(fā)明還涉及在例如心和骨骼肌中表達，但在上述其他組織中不表達的約7.3kb核酸。
根據本發(fā)明，核酸或多肽可在圖1所列的核苷酸或氨基酸序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)中有一個或多個不同。對所述核苷酸和/或氨基酸序列的改變或修飾可通過任何現有方法完成，包括直接或隨機誘變。
編碼本發(fā)明p115Rho-GEF的核酸可含有在天然p115Rho-GEF基因中出現的核苷酸，例如天然多態(tài)性，正常或突變等位基因(核苷酸或氨基酸)，在哺乳動物例如人、猴、豬、小鼠、大鼠或兔的天然種群中發(fā)現的突變。術語天然指從天然來源，例如動物組織和細胞、體液、組織培養(yǎng)細胞、法醫(yī)樣品得到的核酸。p115Rho-GEF的天然突變可包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基-或羧基-末端)、取代或增加。按照本發(fā)明技術人員已知的核酸雜交方法，可檢測和分離這些基因。應認識到，與其他癌基因類似，p115Rho-GEF的天然變體包括在宿主細胞和生物體中產生疾病的缺失、取代和增加。
編碼本發(fā)明p115Rho-GEF多肽的核苷酸序列可含有在天然基因、轉錄本或cDNA，例如圖1所列的序列(SEQ ID NO:1)中所發(fā)現的密碼子，或者所述核苷酸序列可含有編碼相同氨基酸序列的簡并密碼子。
另外，本發(fā)明的核酸或多肽可得自任何所需的哺乳動物生物體，以及非哺乳動物生物體?？捎酶鞣N方法得到來自哺乳動物和非哺乳動物的同系物。例如按Sambrook等，分子克隆，1989,11章中所述，通過與對p115Rho-GEF有選擇性的寡核苷酸雜交，可篩選所述同系物。
SAS06X SAS13:
GAGTCTCTCTGCACCCTCTG/CACGTCTCCGATCTCCTCGAMH185X SAS11:
GGAACCGGCGGACG/AAGATGTTCTGCAGCTCCTC所述同系物可具有不同量的核苷酸和氨基酸序列同一性和與p115Rho-GEF的相似性。非哺乳動物生物體包括，例如脊椎動物，無脊椎動物，斑馬魚(zebra fish)，雞，果蠅，酵母(如啤酒酵母)，C.elegans，線蟲，原生動物，植物、擬南芥屬，病毒等。
可以在從基因數據庫例如Genbank,EMBL進行同源性檢索的基礎上，產生對p115Rho-GEF序列的修飾例如突變。序列同源性檢索可用各種方法完成，包括在計算機程序的BLAST家族中描述的算法、Smith-Waterman算法等。例如在不同序列，Dbl,lbc,Ost,lsc,CDC24等之間，可鑒定保守氨基酸。參見，例如Touhara等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.),269:10217-10220.1994；Toksoz and Williams，癌基因(Oncogene),9:621-628,1994；Whitehead等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.),271:18643-18650,1996。然后，通過鑒定和排列多肽間的保守氨基酸并修飾在保守或非保守位置的氨基酸，可將突變導入p115Rho-GEF序列中。突變的p115Rho-GEF基因可在例如同源核酸的相應區(qū)域間，特別是Dbl同源(DH)和血小板-白細胞C激酶底物同源區(qū)域等之間含有保守或非保守氨基酸。例如突變序列可含有來自任何數量的上述同源序列和/或從適宜的檢索算法確定的保守或非保守殘基。
可在編碼p115Rho-GEF多肽之核酸的特定區(qū)域，例如在dbl同源區(qū)域，例如氨基酸420-637，或血小板-白細胞C激酶底物同源區(qū)域，例如氨基酸646-762中進行突變，例如取代所述區(qū)域，改變所述區(qū)域內的氨基酸序列等，以便分析所述核酸編碼之多肽的功能(例如癌基因轉化、與G-蛋白的結合、鳥嘌呤核苷酸交換)。例如，缺失從氨基酸646至氨基酸762的血小板-白細胞C激酶底物區(qū)域會導致癌基因轉化活性的喪失。血小板-白細胞C激酶底物區(qū)域還可能與脂質(例如磷酸肌醇)結合，與Rho的結合，鳥嘌呤核苷酸交換活性的激活，所述多肽在細胞中的定位有關。因此可用各種方法誘變該區(qū)域，然后檢測所述功能的喪失或獲得。DH區(qū)域可促進從Rho GTP酶的GDP解離。因此，可制備在該區(qū)域內的取代或缺失，然后用常規(guī)方法檢測功能的喪失或獲得?？稍趐115Rho-GEF的這些或其他區(qū)域中產生突變，所述區(qū)域可影響p115Rho-GEF的磷酸化或蛋白質/脂質相互作用，從而對其生長信號傳遞途徑進行調節(jié)。所述突變基因可用于各種方法在含有所述突變的患者中用于診斷目的，導入作為疾病模型的細胞或動物(轉基因的)中。影響GEF活性和轉化活性的突變與在Hart等(生物化學雜志269:62-65)中所述Dbl癌基因之DH區(qū)域中所產生的突變類似。另外，p115Rho-GEF的其他突變包括LLQSIG: 560-566，保守取代VRDMEDLLRL: 606-615；和CCREILH:594-600，缺失一種失活突變可包括對p115-RhoGEF之第751位殘基的色氨酸的改變。由于在含PH區(qū)域的許多蛋白質中，該殘基是高度保守的，因此，改變該殘基，例如可引起不適當折疊，損害其功能。該突變將抑制p115-RhoGEF的轉化活性，但不會影響p115-RhoGEF的GEF活性。
本發(fā)明的核酸和相應的多肽包括不同于圖1之核苷酸序列(SEQ IDNO:1)的，但卻是表型沉默的序列。這些序列修飾包括，例如不影響氨基酸序列的核苷酸取代(例如用于相同氨基酸的不同密碼子)，用同源或保守氨基酸取代天然氨基酸，所述同源或保守氨基酸例如(以側鏈大小和極化程度為基礎)小的非極性氨基酸半胱氨酸、脯氨酸，丙氨酸，蘇氨酸；小的極性氨基酸絲氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺；大的極性氨基酸谷氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸；中等極性氨基酸酪氨酸，組氨酸，色氨酸；大的非極性氨基酸苯并氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸。所述保守取代也可包括Dayhoff在蛋白質序列和結構圖集(Altas of Protein Sequence andStructure)(1978)中和Argos在EMBO J.,8,799-785(1989)中描述的那些。
核酸含有編碼具有SEQ ID NO:2所列之氨基酸序列多肽的核苷酸序列，但在所述氨基酸序列中，一個或多個位置可以被保守氨基酸取代；或者核酸編碼具有SEQ ID NO:2所列之氨基酸序列的核苷酸序列，但有1,5,10,15或20個取代，例如其中所述取代是保守氨基酸。本發(fā)明還涉及由所述核酸編碼的多肽。另外，為了優(yōu)化序列可改變序列中的密碼子以便在所需的宿主中表達。
本發(fā)明核酸可含有例如DNA、RNA、合成核酸、肽核酸、修飾的核苷酸或混合物。DNA可以是雙鏈或單鏈。經各種已知的鍵，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，根據所需的目的，例如對核酸酶如RNase H的抗性，改善體內穩(wěn)定性等，將含核酸的核苷酸相連。參見，例如美國專利5378825。
對所述核酸可進行各種修飾，例如連接可檢測標記(抗生物素蛋白，生物素，放射性元件)，連接改善雜交、檢測或穩(wěn)定性的組成成分?？蓪⑺龊怂岚凑绽硐氲姆椒ㄅc固相例如硝酸纖維素、尼龍、瓊脂質糖、重氮化纖維素、乳膠固體微球、聚丙烯酰胺等相連。參見美國專利5470967,5476925,5478893。
本發(fā)明的另一方面還涉及寡核苷酸和核酸探針。可用所述寡核苷酸或核酸探針例如檢測、定量分析或分離試驗樣品中的p115Rho-GEF。檢測可適用于各種不同的目的，包括研究、診斷和法醫(yī)用。對于診斷目的，可用所述探針鑒定樣品中是否存在p115Rho-GEF核酸序列或鑒定樣品中p115Rho-GEF核酸的量，其中所述樣品得自組織、細胞、體液等。在優(yōu)選的方法中，本發(fā)明涉及檢測p115Rho-GEF核酸的方法，該方法包括在使靶和寡核苷酸之間進行有效雜交的條件下，將試驗樣品中的靶核酸與寡核苷酸接觸；然后檢測雜交情況。還可將本發(fā)明寡核苷酸用于合成核酸擴增例如PCR，例如Saiki等，1988，科學，241:53；美國專利4683,202。優(yōu)選的寡核苷酸包括SAS06X SAS13:
GAGTCTCTCTGCACCCTCTG/CACGTCTCCGATCTCCTCGAMH185X SAS11:
GGAACCGGCGGACG/AAGATGTTCTGCAGCTCCTC本發(fā)明的另一方面是p115Rho-GEF獨特的核苷酸序列。p115Rho-GEF獨特的序列指p115Rho-GEF中，例如圖1的核苷酸序列(SEQID NO:1)中核苷酸的確定順序，但罕見于其他核酸，特別在動物核酸，優(yōu)選哺乳動物，例如人、大鼠、小鼠等中不存在。有義和反義核苷酸序列均被包括在內?？捎贸Ｒ?guī)方法確定本發(fā)明的獨特核酸?？蓪⒑琾115Rho-GEF獨特序列的核酸用作雜交探針以便例如在Northern印跡上鑒定含有核酸混合物的樣品中是否存在p115Rho-GEF。獨特序列包括例如從約核苷酸2340-3150的p115Rho-GEF的C-末端區(qū)。可在嚴緊條件下完成雜交以便篩選與探針有至少95％同一性(即互補性)的核酸，但也可使用較低的嚴緊條件?？蓪ⅹ毺氐膒115Rho-GEF核苷酸序列在其5’或3’末端與本專利中所提到的各種核苷酸序列在框架中融合，所述各種核苷酸序列包括p115Rho-GEF，酶、GEP等的其他部分的編碼序列，表達控制序列等。
根據所需的選擇性，例如按Sambrook等，分子克隆，1989中所述，可在不同的條件下完成雜交。例如為了特異性檢測p115Rho-GEF，可在其中寡核苷酸僅與p115Rho-GEF雜交的條件下，例如其中所述寡核苷酸與所述靶100％互補的條件下，將寡核苷酸與靶核酸雜交。如果需篩選有低于100％核苷酸互補性，至少約例如99％、97％,95％,90％,70％、67％互補性的靶核酸，可以使用不同的條件。由于p115Rho-GEF基因中的突變可引起疾病，例如癌、良性腫瘤，所以可將本發(fā)明寡核苷酸用于診斷目的。例如，利用本發(fā)明的寡核苷酸，和其他癌基因寡核苷酸等，例如p53,Rb,p21,Dbl,MTS1,Wt1,Bcl-1,Bcl-2,MDM2等聯用，用聚合酶鏈反應，然后進行DNA測序以檢測所述序列是否正常，就可診斷帶有癌癥或與Rho信號傳遞途徑有關的其他疾病(見下文)之癥狀的患者是否患有所述疾病。在優(yōu)選的方法中，本發(fā)明涉及診斷癌癥的方法，該方法包括在使靶核酸與寡核苷酸有效雜交的條件下，將含所述靶的樣品與寡核苷酸接觸；檢測雜交情況，其中所述寡核苷酸含有p115Rho-GEF的序列，優(yōu)選p115Rho-GEF的獨特序列；然后確定與所述寡核苷酸雜交的靶核酸的寡核苷酸序列?？捎酶鞣N方法確定所述序列，所述方法包括分離靶核酸，或其DNA，然后按所需的方法確定其序列。
本發(fā)明的寡核苷酸可以是任何所需大小的，優(yōu)選14-16個寡核苷酸長或更長。所述寡核苷酸可以有非天然核苷酸，例如肌苷。根據本發(fā)明，寡核苷酸可含有一試劑盒，其中所述試劑盒包括所需的緩沖液(例如磷酸鹽，tris等)，檢測組合物等。所述寡核苷酸可以是用本領域已知的放射性或非放射性標記標記過的或未被標記過的。
還可由本發(fā)明核酸制備反義核酸，優(yōu)選編碼圖1之編碼序列(SEQID NO:1)的反義序列。可以各種方式使用反義核酸，例如用于調節(jié)p115Rho-GEF的表達，例如抑制p115Rho-GEF，以檢測其表達或用于原位雜交。為了達到調節(jié)p115Rho-GEF表達的目的，可將反義寡核苷酸與表達控制序列有效相連。
可用任何所需的方法標記本發(fā)明核酸。用放射性示蹤物如32P、35S、125I、3H或14C標記所述核酸，提到的僅僅是常用的示蹤物?？砂凑杖魏畏椒ǎ缬梅派湫詷擞浀墓押塑账?、多核苷酸激酶(用磷酸酶進行過或未進行過去磷酸化)或連接酶(根據待標記的末端)在3’或5’末端進行末端標記，即可完成放射性標記過程。也可使用非放射性標記，將本發(fā)明核酸與具有免疫特性的殘基(抗原、半抗原)，與特定試劑有特異性親和性的殘基(配體)，具有能夠進行待完成的酶反應(酶或輔酶，酶底物或與酶反應有關的其他物質)之特性的殘基，或具有特征性物理特性例如熒光或所需波長光的發(fā)射或吸收等的殘基混合。
通過各種技術，包括Northern印跡，PCR，原位雜交等，可將本發(fā)明核酸包括寡核苷酸，反義核酸等用于檢測全器官、組織、細胞等中p115Rho-GEF的表達。所述核酸可特別用于檢測受到擾亂的p115Rho-GEF表達，例如p115Rho-GEF的細胞-特異性和/或亞細胞改變。可單獨確定p115Rho-GEF的水平或與其他基因(癌基因如p53,Rb,Wt1等)產物、轉錄本等一起確定。根據所需的目的，本發(fā)明核酸可在各種不同的體外和體內系統(tǒng)中表達。例如，可將核酸插入表達載體，隨后導入所需的宿主，然后在有效表達所述核酸所編碼之多肽的條件下培養(yǎng)。有效的條件包括適于由宿主生產所述多肽的任何條件，包括有效溫度、pH，培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基的添加劑(例如擴增或誘導表達的添加劑，例如丁酸鹽，或如果編碼核酸與dhfr基因相連時，是氨甲喋呤)，環(huán)己酰亞胺，細胞密度，培養(yǎng)皿等。通過任何有效的方法包括例如磷酸鈣沉淀、電穿孔、注射、DEAE-Dextran介導的轉染、與脂質質體融合和病毒轉染，可將核酸導入細胞。已導入本發(fā)明核酸的細胞是轉化的宿主細胞。所述核酸可作為宿主細胞的染色體外成分或被整合至宿主細胞的染色體中。所述核酸可以是穩(wěn)定的或暫時的。根據其與宿主細胞的相容性篩選表達載體。宿主細胞包括哺乳動物細胞例如COS-7,CHO,HeLa,LTK,NIH3T3,Rat1成纖維細胞，酵母，昆蟲細胞例如Sf9(S.Frugipeda)和果蠅，細菌例如大腸桿菌，鏈球菌，芽孢桿菌，酵母，真菌細胞，植物、胚胎干細胞(例如哺乳動物，例如小鼠或人)，癌或腫瘤細胞?？砂搭愃艷raziani等，癌基因(Oncogene)7∷229-235,1992的方法完成Sf9表達。同樣根據宿主相容性和所需的目的，例如高拷貝數，大量，誘導，擴增、控制表達等目的來篩選表達控制序列?？墒褂玫钠渌蛄邪ɡ?；來自SV40,CMV的增強子，可誘導啟動子，細胞型特異性元件，或允許進行選擇性或特異性細胞表達的序列。
除了p115Rho-GEF核酸外，也可將另一種所需基因導入相同的宿主中，從而調節(jié)p115Rho-GEF的表達，闡明p115Rho-GEF的功能或所需基因的功能。所需基因包括其它癌基因，涉及細胞周期的基因等。這種基因可以是正常的基因，或變異如突變、嵌合體、多態(tài)性等。
本發(fā)明的核酸或多肽可用作核酸或蛋白質電泳、層析等中的大小標記物。通過在序列中搜索限制性位點，計算大小，并進行相應的限制性消化可測定確定的限制性片段。有用的片段包括Sac1-BamH1核苷酸1454,2332，大小=878個堿基；Sph1-Sph1核苷酸295-1356，大小=1061個堿基；和Sac2-Rsr2核苷酸1696-2462，大小=766個堿基。
p115Rho-GEF多肽也可用作蛋白質凝膠的115kd分子量標記物。
本發(fā)明的另一方面涉及有GTP酶參與的生物途徑的調節(jié)，尤其是病理學狀態(tài)，如細胞增殖(如癌癥)，生長控制，形態(tài)發(fā)生，應力纖維形成，和整聯蛋白-介導的相互作用，如胚胎發(fā)育，腫瘤細胞生長和轉移，編程性細胞死亡，止血，白細胞歸航和激活，骨吸收，血塊凝縮，和細胞對機械應力的反應的調節(jié)。例見Clark和Brugge，科學，268:233-239,1995；Bussey，科學，272:225-226,1996。因此，本發(fā)明涉及調節(jié)Rho多肽活性之方法的所有方面，所述方法包括施用有效量的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段，有效量的能調節(jié)Rho多肽活性的化合物，或有效量的編碼p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段的核酸。被調節(jié)的Rho活性可包括GTP結合，GDP結合，GTP酶活性，整聯蛋白結合，Rho與受體或效應物樣分子(如整聯蛋白，生長因子受體，酪氨酸激酶，PI-3K,PIP-5K等)的偶聯或結合，例見Clark和Brugge，科學，268:233-239,1995。通過Rho的增加，減少，拮抗，促進等可調節(jié)活性。通過常規(guī)檢測GTP的水解，PI(4,5)二磷酸與p115Rho-GEF的結合等可測定Rho的調節(jié)。有效量是施用時可調節(jié)Rho活性的任何量?？稍谠?，體外(試管，固相支持物等)，體內或任何所需的環(huán)境中調節(jié)細胞，組織，整個生物體中的Rho活性。
使用如鳥嘌呤核苷酸交換活性的GEF活性，與GTP酶之鳥嘌呤核苷酸-缺失位點的結合，或癌基因轉化活性，或如GTP水解的GTP酶活性的檢測法可鑒定能調節(jié)GEF，如p115Rho-GEF和GTP酶之間相互作用的化合物。通常，具有這種體外活性的化合物可在體內用于調節(jié)與GTP酶相關的生物途徑，如用于治療與上述生物活性和細胞活性相關的病理學狀態(tài)。為了說明，在上下文中根據Rho和p115Rho-GEF描述了鑒定GEF調節(jié)劑的方法。然而，應理解這種方法一般也可用于其它GEF。
可使用如Hart等，自然，354:311-314,28Nov.1991(尤其是其中的圖2說明)所述的鳥嘌呤核苷酸交換檢測法檢測化合物調節(jié)Rho和p115Rho-GEF之間相互作用的能力。例如，用含氚-GDP標記Rho蛋白(重組蛋白，重組融合蛋白，或從天然來源中分離得到的)，然后在可發(fā)生核苷酸交換的條件下將經含氚-GDP標記的Rho與p115Rho-GEF和GTP一起保溫。通過例如使用BA85濾器將結合的GDP與游離的GDP分離開可測定由Rho保留的含氚-GDP的量。通過在適當時間在保溫物中加入化合物(如加入p115Rho-GEF之前，加入p115Rho-GEF之后)并測定所述化合物對核苷酸交換的作用可測定化合物調節(jié)相互作用的能力。以此方法可鑒定相互作用的多種激動劑和拮抗劑。
可按如Hart等，生物化學雜志，269:62-65,1994所述的多種方法測定與Rho之鳥嘌呤核苷酸-缺失位點的結合。簡單地說，可使用本領域技術人員熟知的多種方法，例如使用Rho抗體、Rho與標記蛋白的融合蛋白如谷胱甘肽蛋白(GST)使Rho蛋白與固相支持物偶聯，所述方法如使用Rho抗體，Rho和如谷胱甘肽蛋白(GST)的標記蛋白的融合蛋白，其中融合蛋白經由標記蛋白(如當使用GST時為谷胱甘肽珠)等與固相支持物偶聯。Rho蛋白被轉變?yōu)轼B嘌呤核苷酸缺失的狀態(tài)(有關有效的條件，例如見Hart等，生物化學雜志，269:62-65,1994)，并與例如GDP,GTPγS和如p115Rho-GEF的GEF一起保溫。然后分離固相支持物，并在凝膠中電泳支持物上的所有蛋白質。可在保溫過程中的任意時間(如上所述)加入化合物以測定其對GEF與Rho結合的作用。
根據多種已知的方法可測定p115Rho-GEF或其衍生物對癌基因轉化活性的調節(jié)作用，所述方法如Eva和Aaronson，自然，316:273-275,1985；Hart等，生物化學雜志，269:62-65,1994。可在方法過程中的任意時間(如細胞的預處理；加入GEF之后等)加入化合物以測定其對p115Rho-GEF的癌基因轉化活性的作用。也可使用多種細胞系。
根據與本領域已知方法類似的方法也可進行針對Rho-介導的信號轉導的其它檢測，所述方法描述于美國專利5,141,851；5,420,334；5,436,128；和5,482,954；WO94/16069；WO93/16179；WO91/15582；WO90/00607。另外，根據EP496 162可鑒定和制備能抑制p115Rho-GEF和G-蛋白之間的相互作用如結合作用的肽，如RhoA。
本發(fā)明也涉及檢測和鑒定能調節(jié)鳥嘌呤核苷酸交換因子或其生物活性片段之鳥嘌呤核苷酸交換活性，或調節(jié)GEF或其生物活性片段和與之結合的GTP酶或其生物活性片段之間的結合的試劑的方法。所述方法包括將GEF和GTP酶與待測試劑接觸，然后檢測GEF和GTP酶之間結合的存在或結合的量，或檢測GEF的活性，如鳥嘌呤核苷酸交換活性。至于調節(jié)，意味著加入影響活性或結合的試劑。可通過多種方式實現結合或活性的調節(jié)，包括抑制，阻斷，制止，增加，增強或促進。無需用特殊的方式得到結合或活性效應，例如經由試劑和GEF或GTP酶之間的交聯，所述結合可以是競爭性的，非競爭性的，別構的，位阻的，妨礙性的等等。試劑可對GEF或GTP酶起作用。試劑可以是激動劑，拮抗劑或部分激動劑或部分拮抗劑?？梢远喾N方法測定結合的存在或其量，所述方法如直接或間接檢測由GEF促進或抑制的活性，如鳥嘌呤核苷酸交換，GTP水解，癌基因轉化等。這種檢測法描述于上下文中，也是本領域中已知的方法。可從包括天然和合成的多種來源得到和/或制備試劑。它包括例如氨基酸、脂質、糖類、有機分子、核酸、無機分子或其混合物，例見Hoeprich，自然生物技術(Nature Biotechnology),14:1311-1312,1996，該文獻描述了自動合成有機分子的例子。試劑可同時或依次被加入。例如，可在GEF中加入試劑，然后將所得混合物與GTP酶進一步混合?？稍谝后w中分離的組分上，基質(如濾紙，硝酸纖維素，瓊脂糖)上，細胞中，組織切片上等進行方法的操作。根據所述方法，GEF可與GTP酶結合，這種結合可調節(jié)一些GTP酶的活性。例如，如上下文中所討論的，p115Rho-GEF與Rho結合，導致鳥嘌呤核苷酸解離。該作用可直接針對GEF和GTP酶之間的結合位點，或者也可以是別構的，或者僅對一個組分(如僅對GEF)起作用?？扇菀椎匦揎楕B嘌呤核苷酸解離的檢測法以鑒定調節(jié)GTP酶活性的試劑。所述方法另外還涉及得到或產生根據上述方法鑒定的試劑。本發(fā)明還涉及根據這種方法鑒定的產物，可利用的多種GEF和GTP酶包括p115Rho-GEF,mSOS,SOS,C3G,lsc,Dbl,Dbl-相關蛋白，含有一個或多個DH域的多肽，CDC24,Tiam,Ost,Lbc,Vav,Ect2,Bcr,Abr,Rho(A,B和C),Rac,Ras,CDC42，其嵌合體，其生物活性片段，其突變蛋白等。
因此，本發(fā)明還涉及治療和預防與Rho-介導的信號轉導相關的疾病和病理學狀態(tài)，如癌癥、與細胞異常增殖相關的疾病。例如，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，所述方法包括給需要治療的受試者施用治療疾病有效量的化合物，其中化合物是p115Rho-GEF基因或多肽表達的調節(jié)劑。治療疾病意味著延遲疾病的發(fā)作，延緩疾病的進程，改善或延緩疾病的臨床和病理學病征。類似地，所述方法也涉及治療與炎癥，和/或嗜中性白細胞的趨化能力相關的疾病。調節(jié)劑化合物或化合物的混合物可以是合成的，天然或它們的聯合。調節(jié)劑化合物可含有氨基酸，核苷酸，碳氫化合物，脂質，多糖等。優(yōu)選調節(jié)劑化合物是p115Rho-GEF的調節(jié)劑，如抑制或增加其mRNA，蛋白質表達，或加工，或其與Rho的相互作用，如鳥嘌呤核苷酸交換。使用不同的試劑可調節(jié)表達，所述試劑如選自氨基酸1-912(SEQID NO:2)的多肽或其衍生物，Dbl同源性區(qū)域的配體，反義核酸，核酶，aptamer，合成的化合物，或天然化合物。另外，可在細胞中補加p115Rho-GEF或其衍生物。為了治療疾病，可將化合物或混合物配制成藥物組合物，所述組合物含有本領域技術人員熟知的可藥用載體和其它賦形劑，例見Remington’s PharmaceuticalScience，第18版，Mack出版公司，1990。這種組合物還可含有有效量的特別用于治療癌癥的其它化合物。
本發(fā)明還涉及特異性地識別p115Rho-GEF多肽的抗體。根據任何適當的方法可制備抗體，如多克隆，單克隆，重組的，嵌合的抗體。例如，為了產生單克隆抗體，可將有效量的，含或不含佐劑的圖1(SEQ ID NO:2)多肽經皮下和/或腹膜內施用于小鼠，山羊或兔以引發(fā)免疫應答?？贵w也可以是單鏈或Fab，抗體可以是IgG，亞型，IgG2a,IgG1等。
特異于p115Rho-GEF的抗體指的是可識別圖1(SEQ ID NO:2)之p115Rho-GEF的氨基酸序列之部分或全部氨基酸的確定序列的抗體，因此，如免疫印跡檢測法所檢測和/或測定的，相對于不同的表位而言，特異的抗體可以較高的親和力與圖1(SEQ ID NO:2)中的氨基酸序列，即表位結合。因此，特異于p115Rho-GEF表位的抗體可用于檢測樣品，如檢測含有p115Rho-GEF基因產物之組織樣品中表位的存在，將之與不含表位的樣品區(qū)分開。如Santa Cruz生物技術公司，研究產品目錄中所述，這種抗體是有用的，因此可被配制成例如100μg/ml。
另外，使用例如合成的肽文庫，或核酸配體(如Pitrung等，美國專利5,143,854；Geysen等，1987，免疫學方法雜志，102:259-274；Scott等，1990，科學，249:386；Blackwell等，1990，科學，250:1104；Tuerk等，1990，科學，249:505)也可制備與本發(fā)明p115Rho-GEF多肽結合的配體或其衍生物。也可制備Dbl同源性區(qū)域(420-637)或血小板-白細胞C激酶底物區(qū)域(646-762)等的核酸配體。
可以多種方式使用與p115Rho-GEF結合的抗體和其它配體，包括作為治療劑，診斷劑和商用研究工具，如定量測定動物，組織，細胞等中的p115Rho-GEF多肽水平，鑒定p115Rho-GEF的細胞定位和/或分布，純化p115Rho-GEF或含有p115Rho-GEF部分的多肽，調節(jié)p115Rho-GEF的功能等。p115Rho-GEF的抗體或其衍生物可用于Western印跡，ELIZA，免疫沉淀，RIA等中。本發(fā)明涉及所述檢測法，用于進行所述檢測的組合物和試劑盒等。
可使用本發(fā)明的抗體檢測多種樣品中的p115Rho-GEF多肽或其片段，所述樣品包括組織，細胞，體液，血液，尿液，腦脊液。本發(fā)明的方法包括在本領域已知的有效條件下接觸與SEQ ID NO:2的肽結合的配體以完成結合，檢測配體和肽之間的特異性結合。至于特異性結合，意味著配體與SEQ ID NO:2氨基酸序列之部分或全部氨基酸的確定序列或其衍生物結合。也可使用抗體或其衍生物抑制p115Rho-GEF或其片段的表達。p115Rho-GEF多肽的水平可單獨被測定，也可與其它基因產物聯合被測定。具體地說，可將p115Rho-GEF多肽的量(如其表達水平)與相同或不同樣品中的其它多肽，如p21,p53,Rb,WT1等的量相比較(如得到比例)。
p115Rho-GEF的配體可與其它抗體，如識別癌癥的腫瘤學標記物(包括Rb,p53,c-erbB-2)，癌基因產物等的抗體聯合使用。一般而言，可根據任何適當的方法，如美國專利5,397,712；5,434,050；5,429,947所述，在診斷和/或法醫(yī)研究中使用特異于p115Rho-GEF的試劑。
本發(fā)明也涉及根據適當方法，如美國專利5,434,050所述方法制備的經標記的p115Rho-GEF多肽。經標記的多肽可用于例如結合檢測法中以鑒定與p115Rho-GEF結合或附著的物質，示蹤p115Rho-GEF在細胞，體外，體內，原位系統(tǒng)等中的移動。
可分離本發(fā)明的核酸，多肽，抗體，p115Rho-GEF配體等。術語“分離的”指的是在其原始環(huán)境中不存在的物質形式，如更濃縮的，更純化的，與其它組分分開的等。分離的核酸包括例如具有從活動物染色體DNA中分離的p115Rho-GEF序列的核酸。此核酸可以是載體的一部分或被插入染色體中(通過特定基因-尋靶或通過在非其正常位置的位置處隨機整合)，并仍可以以在其天然環(huán)境中不存在的物質形式被分離。本發(fā)明的核酸或多肽也可基本上被純化。至于基本上純化，意味著核酸或多肽被分離，且實質上與其它核酸或多肽脫離，即核酸或多肽是主要的和活性組分。
本發(fā)明也涉及含有p115Rho-GEF核酸的轉基因動物，如非人動物，如小鼠。根據已知方法可制備轉基因動物，所述方法包括例如將重組基因前核注射進1-細胞胚胎的前核中，將人工酵母染色體摻入胚胎干細胞，基因尋靶方法，胚胎干細胞方法學。例如見美國專利4,736,866；4,873,191；4,873,316；5,082,779；5,304,489；5,174,986；5,175,384；5,175,385；5,221,778；Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci.,77:7380-7384(1980)；Palmiter等，細胞，41:343-345(1985)；Palmiter等，Ann.Rev.Genet.,20:465-499(1986)；Askew等，分子細胞生物學，13:4115-4124,1993；Games等，自然，373:523-527,1995；Valancius和Smithies，分子細胞生物學，11:1402-1408,1991；Stacey等，分子細胞生物學，14:1009-1016,1994；Hasty等，自然，350:243-246,1995；Rubinstein等，核酸研究，21:2613-2617,1993。本發(fā)明的核酸可被導入任何非人哺乳動物，包括小鼠(Hogan等，1986，小鼠胚胎操作實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)，豬(Hammer等，自然，315:343-345,1985)，綿羊(Hammer等，自然，315:343-345,1985)，牛，大鼠或靈長類動物。例如見Church,1987,Trends inBiotech,5:13-19；Clark等，1987,Trends in Biotech,5:20-24；和DePamphilis等，1988，生物技術(Biotechniques),6:662-680。另外，常規(guī)轉基因大鼠和小鼠產品可以商購，這些轉基因動物可用作癌癥模型，例如用于檢測藥物或作為蛇的食物。
通常，可按美國專利5,501,969；5,506,133；5,441,870；WO90/00607；WO91/15582所述制備和使用本發(fā)明的核酸，多肽，抗體等。
至于核酸，多肽，抗體等的其它方面，可參考分子生物學，蛋白質科學和免疫學的教科書。例見Davis等(1986)，分子生物學基本方法，Elsevir科學出版公司，紐約；Hames等(1985)，核酸雜交，IL出版社，分子克隆，Sambrook等，分子生物學最新方法，F.M.Ausubel等編，John Wiley & Sons公司；人類遺傳學最新方法，Nicholas C.Dracopoli等編，John Wiley & Sons公司；蛋白質科學最新方法；John E.Coligan等編，John Wiley & Sons公司；免疫學最新方法；John E.Coligan等編，John Wiley & Sons公司。實施例Rho-相關蛋白的鑒定和純化為了鑒定Rho相關蛋白，用100μCi/ml35S-甲硫氨酸將6個10cm平皿中的生長至70％匯合的經src-轉化的NIH3T3細胞標記過夜。用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將每個平皿洗滌1次，并用1ml20mMTris,pH7.5,100mM NaCl,2.5mM MgCl2,1mM二硫蘇糖醇，30μg/ml亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽，1mM pefabloc和0.6％Triton X-100(v/v)裂解其中的細胞。當裂解緩沖液中含有磷酸酶抑制劑時，加入NaF和NaVO4，使它們的終濃度分別為20mM和1mM。用GSH瓊脂糖預清除之后，將上清液與GSH瓊脂糖一起保溫，所述瓊脂糖偶聯了10μg在核苷酸缺失的，GDP或GTPγS狀態(tài)下制備的由大腸桿菌表達的GST-RhoA(18)。對于核苷酸缺失的條件而言，在裂解液中加入EDTA至終濃度為10mM。4℃下保溫2小時之后，用含有0.1％Triton X-100和10mM EDTA(對于核苷酸缺失的條件而言)或5mMMgCl2(對于GDP/GTPγS條件而言)的磷酸鹽緩沖鹽水將珠洗滌3次，并用SDS樣品緩沖液洗脫珠。通過放射自顯影在8％-聚丙烯酰胺SDS凝膠上分析洗脫液。為了純化，由10個15cm的COS細胞平皿制備10ml胞質溶膠，制法是在低滲裂解緩沖液(20mM Tris,pH7.5,10mMNaCl,2.5mM MgCl2,1mM二硫蘇糖醇，30μg/ml亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽，和1mM pefabloc)中勻漿細胞。離心后，加入Triton X-100至終濃度為0.2％，然后將裂解液分成兩等份，用GSH瓊脂糖預清除，并與120μg偶聯在GSH瓊脂糖上的核苷酸缺失的-或GDP-GST-RhoA一起保溫，然后按上述進行處理。為了得到p115的肽序列，將200μg偶聯在GSH瓊脂糖上的核苷酸缺失的GST-RhoA與由25個15cm的COS細胞平皿制備得到的胞質溶膠一起保溫。對從珠上洗脫下來的蛋白質進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，從凝膠上切下對應于p115的染色帶，并用蛋白酶endolys-C處理(23)。p115的克隆測定全部6個肽的序列，使用其中的1個肽RQEVISELLVTEAAHV以得到p115的cDNA。應用設計最佳猜測寡核苷酸的規(guī)則，產生了下列探針CGGCAGGAGGTGATCTCTGAGCTGCTGGTGACAGAGGCTGCCCATGT，用多核苷酸激酶末端標記所述探針，使用該探針從Stratagene胎兒腦cDNA文庫中篩選到2×106個噬斑(24)。通過此次篩選，分離到3.0kb的cDNA，并發(fā)現它編碼的蛋白質含有6個分離的肽中的3個。在體外TNT小麥胚凝集素裂解液系統(tǒng)(Promega)中表達被稱為EN-p115的此克隆，并發(fā)現此克隆編碼85kDa的蛋白質。為了發(fā)現p115的其余5’編碼序列，使用針對EN-p115的5’末端產生的探針篩選DR2和GT11胎兒腦cDNA文庫(Clontech)。這些篩選的結果是分離出重疊的0.7,0.8,0.9和3.0kb的cDNA。通過用TAQ聚合酶循環(huán)測序從兩個方向上對cDNA測序，并在ABI373A DNA測序儀上進行分析。為了制備全長的p115構建體，用EcoRⅠ和Sfi消化0.7和3.0kb的cDNA，并亞克隆至pGEM11Zf(Promega)的EcoRⅠ位點。此構建體被用于在小麥胚凝集素裂解物中體外轉錄和翻譯。cDNA構建體為了在桿狀病毒/SF9系統(tǒng)中表達，將原始cDNA EN-p115作為EcoRⅤ/XbaⅠ片段亞克隆至含有5’glu-glu標記物的pAcO載體的Stu-XbaⅠ位點。按前述進行經glu-glu標記的蛋白質的表達和純化(24)。為了進行病灶形成試驗，將多種p115cDNA,lbc和dbl cDNA亞克隆至EXV myc標記物載體。被稱為EN-p115的cDNA編碼氨基酸249至912，將它作為EcoRV-XbaⅠ片段亞克隆至EXV-myc載體的互補位點，然后使用此構建體制備EN-p115EDH,其中通過用Sac1和Sac2消化缺失編碼DH區(qū)域之氨基酸466至547的DNA，然后用T4DNA聚合酶使經切割質粒的末端鈍化，將載體重新連接。通過用RsrⅠ和XbaⅠ消化除去編碼氨基酸803至912的DNA來制備EN-p115EC。通過用BalⅠ和XbaⅠ消化除去編碼氨基酸719至912的序列來制備PH區(qū)域被截短的構建體(EN-p115EPH)。用于制備EXV-mycdbl的方法在別處有述(5)。
使用針對lbc癌基因之公開序列(22)產生的引物，從Stratagene心臟cDNA文庫中擴增500個堿基對的片段。然后將此片段用作模板以通過聚合酶鏈反應產生經放射性標記的探針。通過篩選Stratagene心臟cDNA文庫得到1.8kb的cDNA。1.8kb的cDNA含有l(wèi)bc癌基因的序列以及未公開的序列，可能代表原-lbc序列。使用特異性引物，經聚合酶鏈反應擴增編碼氨基酸1至417的DNA序列。設計的引物摻入經擴增DNA的5’和3’末端的EcoRⅤ和XbaⅠ位點，然后被亞克隆至EXV-myc載體。免疫化學檢測在兔中產生針對純化的重組p115片段的特異于p115的抗體。EN-p115(氨基酸249-912)在桿狀病毒昆蟲細胞系統(tǒng)中被表達成經glu-glu表位標記的蛋白質，通過在抗glu-glu Sepharose上進行親和層析(24)來純化EN-p115。然后將7微克經glu-glu標記的EN-p115與被CNBr-激活的Sepharose偶聯，并與注射了EN-p115的兔的10ml血清一起保溫，然后用0.2M甘氨酸，pH2.5洗脫抗體并用1M K2HPO4中和。為了進行免疫印跡，使用的是經親和純化的終濃度為1μg/ml的EN-p115抗體。將印跡保溫過夜，用25mM Tris,pH8.0,150mM NaCl,0.05％吐溫-20洗滌3次，然后用與HRP綴合的山羊抗兔IgG顯色，接著進行ECL檢測。所使用的針對磷酸酪氨酸p190-RhoGAP和rasGAP(Transduction Labs,Inc.)的單克隆抗體的終濃度為1μg/ml。用與HRP綴合的山羊抗小鼠IgG檢測免疫印跡上的交叉反應性。p115刺激的與RhoA的解離比較p115刺激的GDP和GTPγS與RhoA的解離。將數量不斷增加的經glu-glu標記的EN-p115(0,0.002,0.075,0.02,0.4,1.0μM)與0.3μM結合有[3H]-GDP或GTP[35S]的RhoA一起保溫10分鐘，按Hart等人所述(39)測定與RhoA保持結合狀態(tài)的核苷酸的量。EN-p115刺激的GDP解離的特異性。將數量不斷增加的EN-p115(0,0.25,0.5,1.0,2.0μM)與2.0μM與[3H]-GDP預結合的GST-RhoA,GST-Rac1,GST-Cdc42Hs或EE-K-Ras一起保溫5分鐘，并按A中所述進行分析。復合物形成的Western分析。按Hart等人所述(18)將1μg經glu-glu標記的EN-p115與4μg經桿狀病毒表達，與GSH瓊脂糖偶聯的核苷酸缺失的或GDP狀態(tài)的GST-Rho,GST-Rac或GST-Cdc42Hs一起保溫。通過SDS-PAGE和免疫印跡分析經洗滌的GSH珠上回收的蛋白質。用經親和純化的抗glu-glu單克隆抗體探測印跡，將100ng經glu-glu標記的EN-p115用作陽性對照。經p115催化的GEF對RhoA活性的動力學分析。室溫下，在100μM GTP,0.2μM[32P]GTP和5mM MgCl2存在下將數量不斷增加的與GDP結合的GST-RhoA和50nM p115一起保溫5分鐘，將GTP摻入Rho的水平/min/pmol EN-p115測定為與硝酸纖維素濾紙結合的GST-RhoA[32P]GTP。p115-RhoGEF的鑒定和克隆為了鑒定能與Rho相互作用的蛋白質，將GST-Rho與GSH瓊脂糖偶聯，制備成以核苷酸缺失的，GDP和GTPγS狀態(tài)存在的形式，并與經35S-甲硫氨酸代謝標記的被src轉化的NIH-3T3細胞的裂解物一起保溫，用SDS從瓊脂糖珠上洗脫相關的蛋白質，在丙烯酰胺凝膠上電泳并通過放射自顯影進行分析。通過使用此方法，鑒定出4個與Rho相互作用的蛋白質p190,p120,p130和p115，其中的2個蛋白質p190和p120僅與GDP和GTPγS狀態(tài)相互作用。僅當在磷酸酶抑制劑存在下進行純化時才能觀察到這2個蛋白質?？沽姿崂野彼醀estern分析表明p190和p120都是酪氨酸磷酸化的。接著用特異性的單克隆抗體進行分析，結果表明p190是p190-RhoGAP，而p120是RasGAP。在磷酸酶抑制劑的存在下，p190-RhoGAP對Rho-GDP/GTPγS的親合力顯著增強。還發(fā)現RasGAP也與GDP/GTPγS狀態(tài)相關聯，假定是通過它與p190-RhoGAP的相互作用來實現這一目的(25)。另外2個蛋白質p130和p115也與Rho結合，但它們僅與核苷酸缺失(ND)的狀態(tài)相互作用，僅當裂解緩沖液中含有磷酸酶抑制劑時才能檢測到與p130的相互作用，而p115與Rho的相互作用不依賴于磷酸酶抑制劑。借助于p130和p115與Rho之核苷酸缺失之狀態(tài)結合的能力，這2個蛋白質可以是Rho GTP酶的GEF。
使用這種親和方法，從GST-Rho(ND)柱上的COS細胞的胞質溶膠中純化p115。凝膠純化的數量足夠進行p115的氨基酸微量測序，對p115進行蛋白酶裂解消化。分離出6個肽并進行測序。使用基于1個肽之序列的核苷酸探針，從胎兒腦cDNA文庫中分離出3.0kbcDNA，隨后進行的篩選鑒定出3個重疊的0.7,0.8,0.9和3.0kbcDNA。對這些序列進行排列，結果表明連續(xù)的3.2kb cDNA含有編碼推定的104kDa蛋白質的開放閱讀框架。對p115表達的Northern分析鑒定出2個占優(yōu)勢的轉錄物，其大小分別為7.0和3.4kb。p115似乎在人組織中遍在表達，但在外周血白細胞，胸腺和脾臟中表達量最高。當p115 3.2kb的cDNA在體外被表達時，蛋白質產物以115kDa的分子量遷移。針對p115氨基酸249-912產生的經親和純化的多克隆抗體可識別COS和豬動脈內皮細胞(PAE)細胞中相同分子量的蛋白質。在很多人腫瘤細胞系中也檢測到p115，所述細胞系如DLD-1,HCT116,HTB177,SW480,SW620,MIA,Panc-1,HT1080,C33A,H522,A549和BXPC3。
蛋白質同源性檢索表明p115含有Dbl同源性(DH)區(qū)域，接著是血小板-白細胞C激酶底物同源性(PH)區(qū)域。p115的DH區(qū)域與Lfc,Lbc和Dbl癌基因中的類似區(qū)域分別為33.5％,32.3％和22.9％相同。p115的PH區(qū)域與Lfc和Lbc中的PH區(qū)域最類似(29.5％和26.6％相同)，僅與Dbl的PH區(qū)域有9％相同。N-末端氨基酸序列與含有卷曲螺旋的蛋白質，如膠原蛋白是同源的。生化鑒定由于p115含有與Dbl和Lbc交換因子同源的區(qū)域，下一步進行的實驗旨在鑒定p115的潛在GEF活性。將Rho預先與3H-GDP或GTp35S結合，并與p115缺乏氨基末端序列的純化重組形式(EN-p115)一起保溫。EN-p115能促進GDP和GTPγS與RhoA的解離，但對前者更加有效，EN-p115不能促進GDP與Cdc42Hs,Rac1或K-Ras的解離。在適當條件下，1μM EN-p115將GDP與RhoA的內源性解離刺激了10倍。GEF活性的特異性與EN-p115同核苷酸缺失狀態(tài)的GST-Rho物理結合的能力相關。EN-p115不與GST-Cdc42,GST-Rac或K-Ras相互作用。經p115-催化的對Rho的GEF活性的動力學分析表明Rho的KM為1.35μM,Vmax為每分鐘每pmol EN-p115摻入0.031pmol GTP。轉化潛力由于大量能激活Rho的Dbl類蛋白質(Dbl,Lbc,Ost)(18,26,27)已顯示出可以轉化，我們檢測了多種經myc標記的p115構建體，lbc和dbl的轉化潛力(表1)。根據用抗-myc標記物單克隆抗體進行Western分析測定的蛋白質表達水平，使NIH-3T3細胞中病灶形成試驗所用的DNA量正常化。幾乎全長形式的p115(氨基酸83-912)不能轉化，然而，當進一步地截短N-末端時，EN-p115能在NIH-3T3細胞中誘導病灶形成。如果此p115構建體被進一步截短至PH區(qū)域的C-末端，EN-p115EC變得更加易轉化。當DH區(qū)域內部有缺失(EN-p115EDH)或如果PH區(qū)域部分被截短(EN-p115EPH)時，EN-p115不再轉化(表1)。這些數據與以前的觀察結果，即Dbl-類蛋白質需要完整的DH和PH區(qū)域以維持其轉化活性(18,26,28)是一致的。同時還檢測了經myc-標記的lbc和經myc-標記的dbl的轉化潛力，這些實驗的結果表明dbl比p115和lbc更加易轉化。
rho,rho V14的激活形式也誘導NIH3T3細胞中的病灶形成，這些病灶的形態(tài)學與ras-誘導的病灶有所不同(29,30)。這種差別可能源于Ras轉化途徑下游的分叉(31)。與此解釋相一致的是，經由rho V14激活途徑的一個分支與使用raf,raf-CAAX的激活形式激活第二個分支有協同作用(30)。由EN-p115誘導的病灶的表型類似于經rho V14和lbc誘導的病灶表型。這些病灶含有圓形，緊密堆積的細胞。ras或raf-CAAX誘導的病灶的形態(tài)學為旋渦模式，含有紡錘形細胞(30)。當rhoV14或EN-p115被raf-CAAX共同轉染時，這些病灶中的大多數所具有的形態(tài)學介于對rhoV14或EN-p115表達和raf-CAAX表達所觀察的結果之間。由rhoV14/rafCAAX和p115/rafCAAX共轉染形成的病灶在中間密集，外周為紡錘形。與rhoV14類似，在病灶形成試驗中EN-p115可與結構上具有活性的raf-CAAX協同作用。這些結果與p115在體內作為Rho的GEF起作用是一致的。結果討論Rho GTP酶調節(jié)肌動蛋白細胞骨架結構的形成和其它對調節(jié)細胞生長至關重要的事件。Rho已顯示出可誘導應力纖維的形成，并參與介導LPA和生長因子促進應力纖維形成和病灶粘附形成的能力(6)。Rho似乎也能控制整聯蛋白粘附復合物的裝配，所述復合物參與B-淋巴細胞之細胞-細胞聚集作用(32)和化學引誘劑-激活的白細胞粘附作用(33)。另外，Rho作為LPA和AlF4激活之轉錄的介導物起作用(3)，并可通過細胞周期G1相加快進程以調節(jié)細胞生長(7)。Rho誘導細胞內變化的方式目前仍是未知的，然而，最近鑒定的Rho潛在的效應物(ROK,PKN,Rhophilin和磷脂酶-D(15,16,34,35))可介導Rho對細胞形態(tài)學和轉錄激活的所觀察到的作用。
使用親和方法，我們也能檢測到4個蛋白質與特異性核苷酸狀態(tài)的Rho的結合。當在缺乏磷酸酶抑制劑的情況下制備裂解物時，p190-RhoGAP能與GTPγS狀態(tài)的Rho相互作用，然而，如果裂解緩沖液中含有磷酸酶抑制劑，與GTPγS以及GDP狀態(tài)的Rho結合的p190的量顯著增加。在這些條件下，也發(fā)現可能與p190復合的RasGAP可與GTPγS以及GDP狀態(tài)的Rho結合。p190對Rho親和力顯著增加的機制仍是未知的。也許是RasGAP與p190的結合增加了其對Rho的親和力。McGlade等人進行的實驗(36)可提供支持此想法的體內證據。RasGAP N-末端(GAP-N，含有SH3和2個SH2區(qū)域)的表達導致與p190形成穩(wěn)定的復合物。表達GAP-N的細胞呈遞被打亂的應力纖維，與纖連蛋白微弱結合，對病灶的粘附能力降低。在這些細胞中，GAP-N與p190穩(wěn)定的相互作用可促進其RhoGAP活性，導致由Rho激活作用正常誘導的細胞骨架結構消失。最近，Chang等人(37)闡明用EGF治療過量表達c-Src的細胞，可誘導肌動蛋白應力纖維的快速分解和p190及RasGAP在核周圍的arc-樣結構中出現。這表明身為c-Src優(yōu)選底物的p190(38)負責EGF誘導的應力纖維的減少。這些結果與酪氨酸磷酸化和RasGAP結合可激活p190的RhoGAP活性的模式是一致的。
與GST-Rho親和柱結合的其它2個蛋白質是p115和p130，這2個蛋白質僅與核苷酸缺失狀態(tài)的Rho相互作用。由克隆自胎兒腦cDNA文庫的COS細胞裂解物純化p115，發(fā)現它編碼含有Dbl同源性區(qū)域之蛋白質的生長家族新成員。因此，p115之N-末端截短的形式(EN-p115)刺激GDP與Rho解離，而不與Cdc42,Rac或K-Ras解離。當在磷酸酶抑制劑存在下制備裂解物時，還鑒定出第2個蛋白質p130。p130可能代表另一種Rho-GEF，它僅當磷酸化時才行使其功能?；蛘?，p130也可通過以依賴于磷酸化的方式與p115偶聯而間接地與Rho相互作用，p130不是p115的超磷酸化形式，因為抗p115產生的抗體不與p130交叉反應。
由于最初發(fā)現Dbl致癌-蛋白質作為Cdc42Hs的GEF起作用(39)，大量蛋白質和癌基因已顯示出含有Dbl同源性(DH)區(qū)域。含有DH的所有蛋白質的共同特征是血小板-白細胞C激酶底物區(qū)域緊接DH區(qū)域的C-末端。血小板-白細胞C激酶底物家族的成員與異源三聚體G-蛋白的β亞單位(40)或酸性磷脂(41,42)相互作用。IRS-1PTB區(qū)域在結構上與PH區(qū)域相似，它可與酪氨酸磷酸化的肽相互作用(43)。因此，PH區(qū)域可能具有很多種細胞配體，所述配體可提供將Dbl-類蛋白質定位于膜的機制。Lbc和Lfc PH區(qū)域之間高度的同源性表明它們可能擁有共同的配體，而p115PH區(qū)域與這些序列有很大程度的不同，這表明它可能與不同于上述配體的其它配體結合。對于DH區(qū)域也有類似的結論。相對于p115的DH區(qū)域而言，貫穿此區(qū)域，Lbc和Lfc互相之間享有更高的序列同源性。因此，將Lbc/Lfc和p115作為Rho-特異性GEF的兩個不同亞類來考慮較為恰當。由本文進行的轉化試驗可以明顯看出相對于p115而言，dbl更易轉化。這可以反映出PH區(qū)域配體的差異，GEF效力的差異，或或許是對Rho家族成員特異性的差異。
在此研究中，檢測了多種p115構建體的轉化潛力，幾乎全長形式的p115(氨基酸83-912)不能轉化，然而，在NIH-3T3細胞中，N-末端進一步被截短之形式(EN-p115)的表達能促進病灶形成，所述病灶的表型類似于由rhoV14誘導的病灶表型，EN-p115也與rhoV14類似，在病灶形成試驗中可與raf-CAAX協同作用。當EN-p115在C-末端被截短(EN-p115EC)時，p115的轉化潛力進一步增加，這表明在細胞中，N-和C-末端可負調節(jié)p115的功能。檢測EN-p115和EN-p115EC的GEF活性，發(fā)現它們具有相同水平的內在的GEF活性，因此，C-末端的截短可通過更徹底地暴露其PH區(qū)域，使PH區(qū)域與特異性配體更有效地相互作用來增加p115的轉化潛力。由于未檢測全長p115的GEF活性，因此不可能討論是否其不能轉化細胞的原因為缺乏GEF活性或未暴露的，位阻的PH區(qū)域。然而，其轉化潛力的缺乏表明p115可能需要重要的調節(jié)信號以在細胞中成為具有完整功能性的Rho-特異性GEF。
含有多個結構基元之Dbl-類蛋白質數目的不斷增加表明可能存在選擇性調節(jié)GEF的特殊機制。很多這些基元參與蛋白質-蛋白質的相互作用(44)。例如，原-Vav含有SH2和SH3區(qū)域(45)；涉及Aarskog-Scott綜合征的FGD1(46)具有2個潛在的SH3結合位點，克隆自人不成熟的骨髓細胞系(KG1)cDNA文庫(17)的ORFP(登記號為#D25304)具有SH3區(qū)域。通過與其它蛋白質偶聯，這些基元可提供集中Rho-類GTP酶以在特殊的細胞環(huán)境中行使功能的機制。Rho已顯示出可參與受體酪氨酸激酶途徑以及激活異源三聚體G-蛋白的途徑，如LPA和fMLP。由于p115可在很多培養(yǎng)的細胞系中被表達，p115代表開始致力于研究調節(jié)Rho-型GEF之機制的理想候選對象?？紤]到Lbc的組織分布相當有限(22)，有趣的是可推測p115在很多細胞類型中能介導Rho-依賴型作用。將來的研究會致力于測定p115參與的信號傳遞途徑，p115如何被調節(jié)？p115可結合的蛋白質或脂質。
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無需進一步詳述，可以相信本領域技術人員可使用上文的描述，最大程度地利用本發(fā)明。因此，前文優(yōu)選的具體實施方案只是闡明本發(fā)明，而不會在任何程度上以任何方式限制公開內容的其余部分。
上文和圖中提及的所有專利和出版物的全部公開內容通過參考文獻列入本文。
由上文的描述，本領域技術人員易于確定本發(fā)明的必要技術特征，且在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明作出多種改變和修飾以使之適應多種應用和條件。
表1．p115構建體，lbc和dbl促進NIH3T3細胞中病灶形成之能力的比較構建體×每個10cm平皿上病灶的平均數目××1．p115(83-912)02．ΔN-p115 9±13．ΔN-p115ΔC 106±54．ΔN-p115ΔPH 1±15．ΔN-p115ΔDH06．lbc 123±47．dbl 318±8×使用了下列量的質粒DNA:1)p115(83-912),5μg2)EN-p115,0.2μg3)EN-p115EC,0.2μg4)EN-p115EPH,0.5μg5)EN-p115EDH,2μg6)lbc,0.2μg7)dbl,0.1μg。
××顯示的病灶數目表示3個獨立實驗的平均值，每個實驗進行雙份。按Qiu等人所述(31)進行病灶形成試驗。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Hart,Matthew J.
(ⅱ)發(fā)明題目涉及RHP GTP酶鳥嘌呤交換因子的新核酸和多肽(ⅲ)序列數2(ⅳ)通訊地址(A)收件人ONYX Pharmaceuticals,Inc.
(B)街道3031Research Drive(C)城市Richmond(D)州CA(E)國家USA(F)郵政編碼94806(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)目前的申請資料(A)申請?zhí)朥S未知(B)申請日05-NOV-1996(C)分類號單一性(ⅷ)代理人/代理資料(A)姓名Giotta,Gregory(B)登記號32,028(C)資料/文檔號ONYX1023GG
(ⅸ)通訊資料(A)電話(510)262-8710(B)傳真(510)222-9758(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度3150個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設無(ⅳ)反義無(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置55..2790(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GGGCGCCCCG CCGGTCACTT CCGCGCGGAC ACCAGCCTTG CAGAGCCCAG GGAG ATG57Met1GAA GAC TTC GCC CGA GGG GCG GCC TCC CCA GGC CCC TCC CGG CCT GGC 105Glu Asp Phe Ala Arg Gly Ala Ala Ser Pro Gly Pro Ser Arg Pro Gly5 10 15CTG GTT CCC GTC AGC ATC ATC GGG GCT GAG GAT GAG GAT TTT GAG AAC 153Leu Val Pro Val Ser Ile Ile Gly Ala Glu Asp Glu Asp Phe Glu Asn20 25 30GAG CTG GAG ACA AAC TCA GAA GAG CAA AAC AGC CAG TTC CAG AGC CTG 201Glu Leu Glu Thr Asn Ser Glu Glu Gln Asn Ser Gln Phe Gln Ser Leu35 40 45GAG CAG GTG AAG CGG CGC CCA GCC CAC CTC ATG GCC CTC CTG CAG CAC 249Glu Gln Val Lys Arg Arg Pro Ala His Leu Met Ala Leu Leu Gln His50 55 60 65GTG GCC CTG CAG TTT GAG CCA GGA CCC CTG CTT TGC TGT CTG CAT GCC 297Val Ala Leu Gln Phe Glu Pro Gly Pro Leu Leu Cys Cys Leu His Ala70 75 80GAC ATG CTG GGC TCA CTG GGC CCC AAG GAG GCC AAG AAG GCC TTC CTG 345Asp Met Leu Gly Ser Leu Gly Pro Lys Glu Ala Lys Lys Ala Phe Leu85 90 95GAC TTC TAC CAC AGC TTC CTG GAG AAG ACA GCG GTT CTC CGG GTG CCG 393Asp Phe Tyr His Ser Phe Leu Glu Lys Thr Ala Val Leu Arg Val Pro100 105 110GTC CCT CCC AAC GTC GCC TTT GAA CTT GAC CGC ACT AGG GCT GAC CTC 441Val Pro Pro Asn Val Ala Phe Glu Leu Asp Arg Thr Arg Ala Asp Leu115 120 125ATC TCC GAG GAT GTC CAG CGG CGG TTC GTG CAG GAG GTG GTG CAA AGC 489Ile Ser Glu Asp Val Gln Arg Arg Phe Val Gln Glu Val Val Gln Ser130 135 140 145CAG CAG GTA GCC GTG GGC CGG CAG CTG GAG GAC TTC CGT TCC AAG CGG 537Gln Gln Val Ala Val Gly Arg Gln Leu Glu Asp Phe Arg Ser Lys Arg150 155 160CTC ATG GGC ATG ACG CCC TGG GAG CAG GAG CTG GCC CAG CTG GAG GCT 585Leu Met Gly Met Thr Pro Trp Glu Gln Glu Leu Ala Gln Leu Glu Ala165 170 175TGG GTT GGG CGG GAC CGA GCC AGC TAC GAG GCC CGG GAG CGG CAC GTG 633Trp Val Gly Arg Asp Arg Ala Ser Tyr Glu Ala Arg Glu Arg His Val180 185 190GCG GAG CGG CTG CTC ATG CAC CTG GAG GAG ATG CAA CAT ACC ATC TCT 681Ala Glu Arg Leu Leu Met His Leu Glu Glu Met Gln His Thr Ile Ser195 200 205ACC GAC GAA GAA AAG AGT GCT GCC GTG GTC AAC GCC ATT GGG CTG TAC 729Thr Asp Glu Glu Lys Ser Ala Ala Val Val Asn Ala Ile Gly Leu Tyr210 215 220 225ATG CGC CAC CTT GGG GTG CGG ACC AAG AGT GGA GAC AAG AAG TCG GGG 777Met Arg His Leu Gly Val Arg Thr Lys Ser Gly Asp Lys Lys Ser Gly230 235 240AGG AAC TTC TTC CGG AAA AAG GTG ATG GGG AAC CGG CGG TCG GAC GAC 825Arg Asn Phe Phe Arg Lys Lys Val Met Gly Asn Arg Arg Ser Asp Asp245 250 255CCT CCC AAG ACC AAG AAG GGG CTG AGC AGC ATC CTG GAT GCC GCC CGC 873Pro Pro Lys Thr Lys Lys Gly Leu Ser Ser Ile Leu Asp Ala Ala Arg260 265 270TGG AAC CGG GGA GAG CCC CAG GTT CCA GAT TTT CGA CAC CTC AAA GCA 921Trp Asn Arg Gly Glu Pro Gln Val Pro Asp Phe Arg His Leu Lys Ala275 280 285GAG GTT GAT GCC GAG AAG CCA GGT GCT ACA GAC CGG AAG GGA GGC GTG 969Glu Val Asp Ala Glu Lys Pro Gly Ala Thr Asp Arg Lys Gly Gly Val290 295 300 305GGG ATG CCC TCT CGG GAC CGG AAT ATC GGG GCT CCT GGG CAG GAC ACC 1017Gly Met Pro Ser Arg Asp Arg Asn Ile Gly Ala Pro Gly Gln Asp Thr310 315 320CCT GGA GTC TCT CTG CAC CCT CTG TCC CTG GAC AGC CCA GAC CGG GAA 1065Pro Gly Val Ser Leu His Pro Leu Ser Leu Asp Ser Pro Asp Arg Glu325 330 335CCA GGT GCT GAC GCC CCC CTG GAG CTG GGG GAC TCA TCC CCG CAG GGC 1113Pro Gly Ala Asp Ala Pro Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ser Pro Gln Gly340 345 350CCA ATG AGC CTG GAG TCC TTG GCG CCC CCA GAG AGT ACC GAC GAG GGG 1161Pro Met Ser Leu Glu Ser Leu Ala Pro Pro Glu Ser Thr Asp Glu Gly355 360 365GCC GAA ACC GAG AGC CCC GAG CCT GGA GAT GAG GGG GAG CCG GGG CGG 1209Ala Glu Thr Glu Ser Pro Glu Pro Gly Asp Glu Gly Glu Pro Gly Arg370 375 380 385TCG GGA CTG GAG CTT GAA CCA GAA GAG CCT CCC GGC TGG CGG GAA CTC 1257Ser Gly Leu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Gly Trp Arg Glu Leu390 395 400GTC CCC CCA GAC ACC CTG CAC AGC CTG CCC AAG AGC CAG GTG AAG CGG 1305Val Pro Pro Asp Thr Leu His Ser Leu Pro Lys Ser Gln Val Lys Arg405 410 415CAG GAG GTC ATC AGC GAG CTG CTG GTG ACA GAG GCG GCC CAC GTG CGC 1353Gln Glu Val Ile Ser Glu Leu Leu Val Thr Glu Ala Ala His Val Arg420 425 430CTG TTC TTC CCC TTG GAG GAG CTG CAG AAC ATC TTC CCC AGC CTG GAC 1449Leu Phe Phe Pro Leu Glu Glu Leu Gln Asn Ile Phe Pro Ser Leu Asp450 455 460 465GAG CTC ATC GAG GTG CAT TCC CTG TTC CTC GAT CGC CTG ATG AAG CGG 1497Glu Leu Ile Glu Val His Ser Leu Phe Leu Asp Arg Leu Met Lys Arg470 475 480AGG CAG GAG AGT GGC TAC CTC ATC GAG GAG ATC GGA GAC GTG CTG CTG 1545Arg Gln Glu Ser Gly Tyr Leu Ile Glu Glu Ile Gly Asp Val Leu Leu485 490 495GCC CGG TTT GAT GGT GCT GAG GGC TCC TGG TTC CAG AAA ATC TCC TCC 1593Ala Arg Phe Asp Gly Ala Glu Gly Ser Trp Phe Gln Lys Ile Ser Ser500 505 510CGC TTC TGC AGC CGC CAG TCA TTT GCC TTA GAG CAG CTC AAA GCC AAG 1641Arg Phe Cys Ser Arg Gln Ser Phe Ala Leu Glu Gln Leu Lys Ala Lys515 520 525CAA CGC AAG GAC CCT CGG TTC TGT GCC TTC GTG CAG GAA GCT GAG AGC 1689Gln Arg Lys Asp Pro Arg Phe Cys Ala Phe Val Gln Glu Ala Glu Ser530 535 540 545CGC CCG CGG TGC CGC CGC CTG CAG CTG AAG GAC ATG ATC CCC ACG GAG 1737Arg Pro Arg Cys Arg Arg Leu Gln Leu Lys Asp Met Ile Pro Thr Glu550 555 560ATG CAG CGG CTG ACC AAG TAC CCC CTG CTC CTG CAG AGC ATC GGG CAG 1785Met Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Pro Leu Leu Leu Gln Ser Ile Gly Gln565 570 575AAC ACA GAA GAG CCC ACA GAA CGG GAG AAA GTG GAG CTG GCA GCC GAG 1833Asn Thr Glu Glu Pro Thr Glu Arg Glu Lys Val Glu Leu Ala Ala Glu580 585 590TGC TGC CGG GAA ATT CTA CAC CAC GTC AAC CAA GCC GTG CGT GAC ATG 1881Cys Cys Arg Glu Ile Leu His His Val Asn Gln Ala Val Arg Asp Met595 600 605GAG GAC CTG CTG AGG CTC AAG GAC TAT CAG CGG CGC CTG GAC TTG TCC 1929Glu Asp Leu Leu Arg Leu Lys Asp Tyr Gln Arg Arg Leu Asp Leu Ser610 615 620 625CAC CTT CGG CAG AGC AGC GAC CCT ATG CTG AGC GAG TTC AAG AAC CTG 1977His Leu Arg Gln Ser Ser Asp Pro Met Leu Ser Glu Phe Lys Asn Leu630 635 640GAC ATC ACC AAG AAG AAA TTG GTC CAC GAG GGC CCA CTG ACG TGG CGG 2025Asp Ile Thr Lys Lys Lys Leu Val His Glu Gly Pro Leu Thr Trp Arg645 650 655GTG ACT AAG GAC AAG GCA GTG GAG GTG CAT GTG CTG CTG CTG GAC GAC 2073Val Thr Lys Asp Lys Ala Val Glu Val His Val Leu Leu Leu Asp Asp660 665 670CTG CTG CTG CTG CTC CAG CGC CAG GAC GAG CGG CTG CTG CTC AAG TCC 2121Leu Leu Leu Leu Leu Gln Arg Gln Asp Glu Arg Leu Leu Leu Lys Ser675 680 685CAT AGC CGG ACA CTG ACG CCC ACG CCC GAT GGC AAG ACC ATG CTG CGG 2169His Ser Arg Thr Leu Thr Pro Thr Pro Asp Gly Lys Thr Met Leu Arg690 695 700 705CCC GTG CTG CGG CTC ACC TCC GCC ATG ACC CGC GAG GTG GCC ACC GAT 2217Pro Val Leu Arg Leu Thr Ser Ala Met Thr Arg Glu Val Ala Thr Asp710 715 720CAC AAA GCC TTC TAC GTC CTT TTT ACC TGG GAC CAG GAG GCC CAG ATA 2265His Lys Ala Phe Tyr Val Leu Phe Thr Trp Asp Gln Glu Ala Gln Ile725 730 735TAC GAG CTG GTG GCA CAG ACT GTG TCG GAG CGG AAA AAC TGG TGT GCT 2313Tyr Glu Leu Val Ala Gln Thr Val Ser Glu Arg Lys Asn Trp Cys Ala740 745 750CTC ATC ACT GAG ACT GCC GGA TCC CTG AAA GTC CCT GCC CCT GCC TCT 2361Leu Ile Thr Glu Thr Ala Gly Ser Leu Lys Val Pro Ala Pro Ala Ser755 760 765CGC CCT AAG CCC CGG CCC AGG CCG AGC AGC ACC CGA GAA CCC CTC CTC 2409Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro Ser Ser Thr Arg Glu Pro Leu Leu770 775 780 785AGC AGC TCT GAG AAC GGG AAT GGT GGC CGA GAG ACG TCT CCA GCT GAT 2457Ser Ser Ser Glu Asn Gly Asn Gly Gly Arg Glu Thr Ser Pro Ala Asp790 795 800GCC CGG ACC GAG AGA ATC CTC AGT GAC CTC CTG CCC TTC TGC AGA CCA 2505Ala Arg Thr Glu Arg Ile Leu Ser Asp Leu Leu Pro Phe Cys Arg Pro805 810 815GGC CCC GAG GGC CAG CTC GCT GCC ACG GCC CTT CGG AAA GTG CTG TCC 2553Gly Pro Glu Gly Gln Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg Lys Val Leu Ser820 825 830CTG AAG CAG CTT CTG TTT CCG GCG GAG GAA GAC AAT GGG GCG GGG CCT 2601Leu Lys Gln Leu Leu Phe Pro Ala Glu Glu Asp Asn Gly Ala Gly Pro835 840 845CCT CGA GAT GGG GAT GGG GTC CCA GGG GGC GGG CCC CTG AGC CCA GCA 2649Pro Arg Asp Gly Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Pro Ala850 855 860 865CGG ACC CAG GAA ATC CAG GAG AAC CTG CTC AGC TTG GAG GAG ACC ATG 2697Arg Thr Gln Glu Ile Gln Glu Asn Leu Leu Ser Leu Glu Glu Thr Met870 875 880AAG CAG CTG GAG GAG TTG GAG GAG GAA TTT TGC CGC CTG AGA CCC CTC 2745Lys Gln Leu Glu Glu Leu Glu Glu Glu Phe Cys Arg Leu Arg Pro Leu885 890 895CTG TCT CAG CTT GGG GGG AAC TCT GTC CCC CAG CCT GGC TGC ACT 2790Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asn Ser Val Pro Gln Pro Gly Cys Thr900 905 910TGAGGTTCCC GCCCAGGAAG GCCTTTTGCA AGAAGGAGAG GAATGGGGGA GAGGACGTGA 2850GGGACCACCC CCACCCACAC AGCTGCCGCA GCATCTCACA CCCCGAGGGC CTGAGGAGAG 2910GGAGCTGTGG GCCACGCCTG GGAGGGGCCC AGCTGGGGTT ACTGCCCCCG CATGAGCCTC 2970GGCCATCTCT CCCTCCTGCC CTCTGCTTGG GGGACTCAGG GCTCCATTCT GGAGGGCACC 3030ACGGTGACCC GGGCCATCTC AGTATTGCCT GTGGGGGCCA CCCCTCCACC CCCACCCCCA 3090AGTGCCTTCG CTCTGTTTTT ATACCCTGAA TTGGAGGGTT TATTTTTTAA TATATATTAT 3150(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度912個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Glu Asp Phe Ala Arg Gly Ala Ala Ser Pro Gly Pro Ser Arg Pro1 5 10 15Gly Leu Val Pro Val Ser Ile Ile Gly Ala Glu Asp Glu Asp Phe Glu20 25 30Asn Glu Leu Glu Thr Asn Ser Glu Glu Gln Asn Ser Gln Phe Gln Ser35 40 45Leu Glu Gln Val Lys Arg Arg Pro Ala His Leu Met Ala Leu Leu Gln50 55 60His Val Ala Leu Gln Phe Glu Pro Gly Pro Leu Leu Cys Cys Leu His65 70 75 80Ala Asp Met Leu Gly Ser Leu Gly Pro Lys Glu Ala Lys Lys Ala Phe85 90 95Leu Asp Phe Tyr His Ser Phe Leu Glu Lys Thr Ala Val Leu Arg Val100 105 110Pro Val Pro Pro Asn Val Ala Phe Glu Leu Asp Arg Thr Arg Ala Asp115 120 125Leu Ile Ser Glu Asp Val Gln Arg Arg Phe Val Gln Glu Val Val Gln130 135 140Ser Gln Gln Val Ala Val Gly Arg Gln Leu Glu Asp Phe Arg Ser Lys145 150 155 160Arg Leu Met Gly Met Thr Pro Trp Glu Gln Glu Leu Ala Gln Leu Glu165 170 175Ala Trp Val Gly Arg Asp Arg Ala Ser Tyr Glu Ala Arg Glu Arg His180 185 190Val Ala Glu Arg Leu Leu Met His Leu Glu Glu Met Gln His Thr Ile195 200 205Ser Thr Asp Glu Glu Lys Ser Ala Ala Val Val Asn Ala Ile Gly Leu210 215 220Tyr Met Arg His Leu Gly Val Arg Thr Lys Ser Gly Asp Lys Lys Ser225 230 235 240Gly Arg Asn Phe Phe Arg Lys Lys Val Met Gly Asn Arg Arg Ser Asp245 250 255Asp Pro Pro Lys Thr Lys Lys Gly Leu Ser Ser Ile Leu Asp Ala Ala260 265 270Arg Trp Asn Arg Gly Glu Pro Gln Val Pro Asp Phe Arg His Leu Lys275 280 285Ala Glu Val Asp Ala Glu Lys Pro Gly Ala Thr Asp Arg Lys Gly Gly290 295 300Val Gly Met Pro Ser Arg Asp Arg Asn Ile Gly Ala Pro Gly Gln Asp305 310 315 320Thr Pro Gly Val Ser Leu His Pro Leu Ser Leu Asp Ser Pro Asp Arg325 330 335Glu Pro Gly Ala Asp Ala Pro Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ser Pro Gln340 345 350Gly Pro Met Ser Leu Glu Ser Leu Ala Pro Pro Glu Ser Thr Asp Glu355 360 365Gly Ala Glu Thr Glu Ser Pro Glu Pro Gly Asp Glu Gly Glu Pro Gly370 375 380Arg Ser Gly Leu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Gly Trp Arg Glu385 390 395 400Leu Val Pro Pro Asp Thr Leu His Ser Leu Pro Lys Ser Gln Val Lys405 410 415Arg Gln Glu Val Ile Ser Glu Leu Leu Val Thr Glu Ala Ala His Val420 425 430Arg Met Leu Arg Val Leu His Asp Leu Phe Phe Gln Pro Met Ala Glu435 440 445Cys Leu Phe Phe Pro Leu Glu Glu Leu Gln Asn Ile Phe Pro Ser Leu450 455 460Asp Glu Leu Ile Glu Val His Ser Leu Phe Leu Asp Arg Leu Met Lys465 470 475 480Arg Arg Gln Glu Ser Gly Tyr Leu Ile Glu Glu Ile Gly Asp Val Leu485 490 495Leu Ala Arg Phe Asp Gly Ala Glu Gly Ser Trp Phe Gln Lys Ile Ser500 505 510Ser Arg Phe Cys Ser Arg Gln Ser Phe Ala Leu Glu Gln Leu Lys Ala515 520 525Lys Gln Arg Lys Asp Pro Arg Phe Cys Ala Phe Val Gln Glu Ala Glu530 535 540Ser Arg Pro Arg Cys Arg Arg Leu Gln Leu Lys Asp Met Ile Pro Thr545 550 555 560Glu Met Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Pro Leu Leu Leu Gln Ser Ile Gly565 570 575Gln Asn Thr Glu Glu Pro Thr Glu Arg Glu Lys Val Glu Leu Ala Ala580 585 590Glu Cys Cys Arg Glu Ile Leu His His Val Asn Gln Ala Val Arg Asp595 600 605Met Glu Asp Leu Leu Arg Leu Lys Asp Tyr Gln Arg Arg Leu Asp Leu610 615 620Ser His Leu Arg Gln Ser Ser Asp Pro Met Leu Ser Glu Phe Lys Asn625 630 635 640Leu Asp Ile Thr Lys Lys Lys Leu Val His Glu Gly Pro Leu Thr Trp645 650 655Arg Val Thr Lys Asp Lys Ala Val Glu Val His Val Leu Leu Leu Asp660 665 670Asp Leu Leu Leu Leu Leu Gln Arg Gln Asp Glu Arg Leu Leu Leu Lys675 680 685Ser His Ser Arg Thr Leu Thr Pro Thr Pro Asp Gly Lys Thr Met Leu690 695 700Arg Pro Val Leu Arg Leu Thr Ser Ala Met Thr Arg Glu Val Ala Thr705 710 715 720Asp His Lys Ala Phe Tyr Val Leu Phe Thr Trp Asp Gln Glu Ala Gln725 730 735Ile Tyr Glu Leu Val Ala Gln Thr Val Ser Glu Arg Lys Asn Trp Cys740 745 750Ala Leu Ile Thr Glu Thr Ala Gly Ser Leu Lys Val Pro Ala Pro Ala755 760 765Ser Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro Ser Ser Thr Arg Glu Pro Leu770 775 780Leu Ser Ser Ser Glu Asn Gly Asn Gly Gly Arg Glu Thr Ser Pro Ala785 790 795 800Asp Ala Arg Thr Glu Arg Ile Leu Ser Asp Leu Leu Pro Phe Cys Arg805 810 815Pro Gly Pro Glu Gly Gln Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg Lys Val Leu820 825 830Ser Leu Lys Gln Leu Leu Phe Pro Ala Glu Glu Asp Asn Gly Ala Gly835 840 845Pro Pro Arg Asp Gly Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Pro850 855 860Ala Arg Thr Gln Glu Ile Gln Glu Asn Leu Leu Ser Leu Glu Glu Thr865 870 875 880Met Lys Gln Leu Glu Glu Leu Glu Glu Glu Phe Cys Arg Leu Arg Pro885 890 895Leu Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asn Ser Val Pro Gln Pro Gly Cys Thr900 905 910
權利要求
1．分離的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段。
2．權利要求1的分離的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段，其中所述多肽具有鳥嘌呤核苷酸交換活性，對鳥嘌呤核苷酸缺失的Rho具有特殊的結合親和力，或具有細胞癌基因轉化活性。
3．權利要求1的分離的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段來源于人。
4．權利要求1的分離的p115Rho-GEF含有圖1所示的氨基酸1至氨基酸912。
5．權利要求1的p115Rho-GEF的分離的生物活性片段，所述片段含有圖1的氨基酸序列。
6．權利要求1的分離的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段是基本上純化的。
7．含有編碼p115Rho-GEF多肽之核苷酸序列的分離的核酸。
8．權利要求7的分離的核酸，其中所述編碼的多肽具有鳥嘌呤核苷酸交換活性，對鳥嘌呤核苷酸缺失的Rho具有特殊的結合親和力，或具有細胞癌基因轉化活性。
9．權利要求7的分離的核酸來源于人。
10．權利要求7的分離的核酸，其中核酸序列編碼圖1所示的氨基酸1至氨基酸912。
11．權利要求7的分離的核酸，其中核苷酸序列與表達控制序列有效相連。
12．權利要求7的分離的核酸，其中核酸含有天然核苷酸序列。
13．權利要求7的分離的核酸，其中核酸不間斷地編碼所述多肽。
14．權利要求7的分離的核酸，其中核酸是DNA或RNA。
15．權利要求7的分離的核酸，其中核酸進一步含有可測的標記物。
16．權利要求7的分離的核酸，除了一個或多個氨基酸位置被取代或缺失，或既取代又缺失外，由核酸編碼的多肽是有生物活性的。
17．權利要求16的分離的核酸，其中生物活性是鳥嘌呤核苷酸交換活性，對鳥嘌呤核苷酸缺失的Rho的特殊結合親和力，或細胞癌基因轉化活性。
18．權利要求16的分離的核酸，其中一個或多個被取代的氨基酸位置被保守的氨基酸取代。
19．權利要求16的分離的核酸，其中一個或多個被取代的氨基酸位置位于Dbl同源性區(qū)域或血小板-白細胞C激酶底物同源性區(qū)域。
20．分離的核酸，所述核酸含有在嚴緊條件下其或其核酸互補物能與圖1所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
21．權利要求20的分離的核酸，所述核酸含有與圖1所示核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。
22．權利要求20的分離的核酸，其中所述核酸編碼的多肽具有鳥嘌呤核苷酸交換活性，對鳥嘌呤核苷酸缺失的Rho的特殊結合親和力，或細胞癌基因轉化活性。
23．分離的核酸，所述核酸含有p115Rho-GEF獨特的核苷酸序列。
24．分離的核酸，所述核酸含有在嚴緊條件下其或其核酸互補物能與權利要求23獨特的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
25．權利要求24的分離的核酸，其編碼的多肽具有鳥嘌呤核苷酸交換活性，對鳥嘌呤核苷酸缺失的Rho的特殊結合親和力，或細胞癌基因轉化活性。
26．在被轉化的宿主細胞中表達由核酸編碼的p115Rho-GEF多肽的方法，所述方法包括在能有效表達多肽的條件下培養(yǎng)含有權利要求7之核酸的經轉化的宿主細胞。
27．在被轉化的宿主細胞中表達由核酸編碼的多肽的方法，所述方法包括在能有效表達多肽的條件下培養(yǎng)含有權利要求20之核酸的經轉化的宿主細胞。
28．權利要求26的方法，另外包括分離多肽。
29．權利要求26的方法，另外包括調節(jié)多肽的表達。
30．由權利要求26的方法產生的分離的多肽。
31．由權利要求27的方法產生的分離的多肽。
32．含有權利要求7的核酸的經轉化的宿主細胞。
33．含有權利要求20的核酸的經轉化的宿主細胞。
34．含有權利要求7的核酸的載體。
35．含有權利要求20的核酸的載體。
36．調節(jié)Rho多肽活性的方法，所述方法包括施用有效量的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段，或有效量的能調節(jié)p115Rho-GEF活性的化合物。
37．權利要求36的方法，其中p115Rho-GEF或其生物活性片段含有對鳥嘌呤核苷酸缺失狀態(tài)的所述Rho具有特殊結合活性的氨基酸序列。
38．調節(jié)Rho多肽活性的方法，所述方法包括在所述核酸能在所述細胞中以有效量被表達以調節(jié)Rho的所述活性的條件下，將權利要求21的核酸導入所述細胞。
39．權利要求38的方法，其中所述核酸致癌轉化所述細胞。
40．分離與鳥嘌呤核苷酸缺失狀態(tài)的Rho多肽結合的分子的方法，所述方法包括在所述分子能與所述Rho多肽有效結合的條件下，將Rho多肽與含有所述分子的介質接觸；和從所述介質中分離結合有所述分子的所述Rho多肽。
41．權利要求40的方法，其中所述分子是p115Rho-GEF。
42．權利要求40的方法，其中所述分子的分子量約為130kDa。
43．權利要求40的方法，另外包括將所述分子與所述Rho多肽分開。
44．調節(jié)GTP酶活性的方法，所述方法包括施用有效量的鳥嘌呤核苷酸交換因子或其生物活性片段，或有效量的能調節(jié)鳥嘌呤核苷酸交換因子活性的化合物。
45．權利要求44的方法，其中鳥嘌呤核苷酸交換因子或其生物活性片段含有對鳥嘌呤核苷酸缺失狀態(tài)的所述GTP酶具有特殊結合活性的氨基酸序列。
46．檢測調節(jié)鳥嘌呤核苷酸交換因子之鳥嘌呤核苷酸交換活性之試劑的方法，所述方法包括將(a)含有鳥嘌呤核苷酸交換因子的多肽或其生物活性片段，和(b)可與交換因子結合的，含有GTP酶的多肽或其生物活性片段的混合物與試劑接觸；和檢測鳥嘌呤核苷酸交換活性的存在或數量。
47．權利要求46的方法，其中GTP酶是RhoA。
48．權利要求46的方法，其中鳥嘌呤核苷酸交換因子是p115-RhoGEF。
49．權利要求46的分離的產物。
50．檢測調節(jié)鳥嘌呤核苷酸交換因子和GTP酶之間的結合的試劑的方法，所述方法包括將(a)含有鳥嘌呤核苷酸交換因子的多肽或其生物活性片段，和(b)可與交換因子結合的，含有GTP酶的多肽或其生物活性片段的混合物與試劑接觸；和檢測鳥嘌呤核苷酸交換因子多肽或其生物活性片段和GTP酶之間的結合的存在或數量。
51．權利要求50的方法，其中GTP酶是RhoA。
52．權利要求50的方法，其中鳥嘌呤核苷酸交換因子是p115-RhoGEF。
53．權利要求50的分離的產物。
54．特異于p115-RhoGEF的分離的抗體。
55．權利要求54的分離的抗體，所述抗體與圖1所示氨基酸1至氨基酸912的氨基酸序列結合。
全文摘要
本發(fā)明涉及鳥嘌吟交換因子(GEF),例如Rho－GEF,如p115Rho－GEF的所有方面。GEF通過調節(jié)GTP酶活性而體外或體內的調節(jié)細胞信號傳遞途徑。為了說明,描述了p115Rho－GEF,它調節(jié)RhoGTP酶活性。但是,本發(fā)明還涉及其他GEF,特別是其他Rho－GEF。本發(fā)明具體涉及分離的P115Rho－GEF多肽或其片段,編碼p115Rho－GEF的核酸或其片段。所述多肽和核酸的衍生物。本發(fā)明還涉及在治療、診斷中利用所述多肽、核酸、或其衍生物的方法,并作為研究工具。本發(fā)明另一方面涉及識別p115Rho－GEF的抗體和其他配體,p115Rho－GEF活性的調節(jié)劑,治療Rho GTP酶相關疾病的方法。
文檔編號A61K48/00GK1232498SQ97198441
公開日1999年10月20日 申請日期1997年10月7日 優(yōu)先權日1996年11月6日
發(fā)明者M·J·哈特 申請人:昂尼克斯藥物公司