專利名稱:利用編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)序列對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行檢測、鑒定及計(jì)數(shù)的方法
發(fā)明詳述發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及利用基因鑒定、檢驗(yàn)微生物和病原微生物的領(lǐng)域；特別地，涉及檢驗(yàn)副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種快速鑒定并檢驗(yàn)在夏季導(dǎo)致食物中毒的副溶血弧菌的方法，因此本發(fā)明的領(lǐng)域包括食品加工、公共衛(wèi)生和臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。
背景技術(shù)：
目前在食品衛(wèi)生管理場所根據(jù)生化表型對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行檢驗(yàn)。依據(jù)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南，將受試樣品置于TCBS瓊脂基質(zhì)上孵育及培養(yǎng)，獲得形成不能降解蔗糖的略呈綠色的藍(lán)色假定陽性菌落，在此略呈綠色的藍(lán)色菌落上進(jìn)行各種試驗(yàn)來鑒定其生物化學(xué)性質(zhì)，對(duì)其加以驗(yàn)證。然而，在食品生產(chǎn)管理場所進(jìn)行這些鑒定生物化學(xué)性質(zhì)的試驗(yàn)存在許多問題，這是因?yàn)檫@些試驗(yàn)需要熟練的技術(shù)，且耗時(shí)耗力。為了彌補(bǔ)這些鑒定生物化學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)的不足，我們努力研發(fā)出一種利用基因準(zhǔn)確、快速、簡單地檢測并鑒定副溶血弧菌的檢驗(yàn)方法。
發(fā)明內(nèi)容
到目前為止，已有下述的利用基因檢驗(yàn)副溶血弧菌的檢驗(yàn)方法，但是它們存在各種各樣的問題。
例如，有人設(shè)計(jì)PCR引物，通過鑒定編碼DNA促旋酶β亞基[日本專利公開號(hào)(Kokai)NO.09-252783，Applied and Environmentalmicrobiology，Vol.64，No.2，P.681-687]的靶g(shù)yrB基因來檢測副溶血弧菌。然而，其引物的制備基于這樣的假設(shè)對(duì)各菌株gyrB基因的序列分析結(jié)果顯示，副溶血弧菌株ATCC 17802和溶藻弧菌株ATCC17749間不同的序列中有部分序列是特異的。換句話說，并不是根據(jù)對(duì)以gyrB基因序列為基礎(chǔ)的弧菌屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的認(rèn)識(shí)來制備引物，因而其特異性的范圍不明確。利用靶toxR基因進(jìn)行PCR的檢測方法也見有報(bào)道，該基因是控制霍亂弧菌毒素基因的基因，它也存在于副溶血弧菌(Journal of Clinical Microbiology.1999 Vol.37 NO.4，p1173-1177)中。然而，與上述利用gyrB基因的檢測引物類似，通過將該門(phyla)內(nèi)相距較遠(yuǎn)的各株副溶血弧菌和各株霍亂弧菌株的基因序列加以比較，然后假設(shè)兩株間有差異的核苷酸序列中的部分序列為副溶血弧菌特異性序列，制備這種PCR引物。因此，這些引物也不是根據(jù)對(duì)以toxR基因?yàn)榛A(chǔ)的弧菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的認(rèn)識(shí)來制備，其特異性的范圍仍不明確。另一方面，也有檢測方法注意到了副溶血弧菌毒素基因[日本專利申請(qǐng)公開號(hào)(Kokai)No.4-293486]。人們很久這前就認(rèn)識(shí)到副溶血弧菌分為兩類一類含有在紅細(xì)胞膜上鉆孔導(dǎo)致出血(稱為神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon))的毒素(耐熱的直接溶血素TDH)，另一類不含有這種毒素。除了TDH，最近還發(fā)現(xiàn)了一種稱為TRH(TDH相關(guān)溶血素TRH)的毒素，它與TDH非常相似，不導(dǎo)致神奈川現(xiàn)象但會(huì)導(dǎo)致腹瀉(1988Infect Immun.Vol.56，961-965)。已經(jīng)研制了PCR引物，對(duì)編碼導(dǎo)致副溶血弧菌病原性的各毒素的tdh和trh基因進(jìn)行特異性檢測(日本專利申請(qǐng)公開號(hào)(Kokai)No.4-293486)。然而，并非所有的副溶血弧菌組分都含有這樣的毒素基因。實(shí)際上環(huán)境中的大部分副溶血弧菌都沒有這樣的毒素基因。既然包括這些不含毒素基因的菌株在內(nèi)的所有副溶血弧菌細(xì)胞計(jì)數(shù)在食品衛(wèi)生控制時(shí)是重要的，食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南要求檢驗(yàn)所有的副溶血弧菌，不論毒素存在與否。相應(yīng)地，僅注意毒素產(chǎn)生能力的毒素基因檢測方法不符合基于生化試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，因而這樣的檢測方法不宜用作食品衛(wèi)生管理中的檢測和鑒定方法。綜上所述，現(xiàn)有用于檢測和鑒定副溶血弧菌的引物不夠?qū)嵱谩?br> 除這些檢測方法外，也有報(bào)道用其它方法檢測特異性存在于副溶血弧菌中的未知功能的0.76Kb DNA片段(Appl.Environ.Microbiol.61(4)1311-1317)或溶血因子，如tlh(熱不穩(wěn)定的溶血素Lett ApplMicrobiol 1999.Vol.28，66-70)和σ-VPH(FEMS Microbiol Lett 1990；55(3)339-45)。然而，這些方法中沒有一種方法被證實(shí)能可靠的檢測副溶血弧菌，沒有一種方法能夠在評(píng)價(jià)場所得以準(zhǔn)確的應(yīng)用。
如上所述，沒有一種遺傳檢測方法考慮到細(xì)菌“物種(species)”是一個(gè)包含遺傳多樣性的總體，并將假定為特定細(xì)菌群體成員的菌株的核苷酸序列用作共同序列或代表性序列來設(shè)計(jì)PCR引物。但是，考慮到分子進(jìn)化中快速積累的基因突變，尤其是中性突變，最初檢測到的菌株并不總是能檢測到。這是因?yàn)橐飬^(qū)的輕微突變會(huì)降低引物的適用性，從而使擴(kuò)增受到抑制。而且，還得擔(dān)心可能發(fā)生錯(cuò)誤鑒定。這是因?yàn)閷?duì)密切相關(guān)物種間通過種系分析得到差別缺乏考慮，使引物設(shè)計(jì)缺少足夠的擴(kuò)增特異性，以至于檢測到原本不是靶菌株的密切相關(guān)菌株。
因此，需要制備具有明確的特異性背景、低錯(cuò)誤鑒定率和足夠?qū)嶋H擴(kuò)增效率和特異性的高性能、特異性基因擴(kuò)增引物，對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行檢測、鑒定并定量。
為了建立特異性檢測細(xì)菌特定種系的基因的方法，需要收集待檢測生物群體及與之種系發(fā)育密切關(guān)聯(lián)的生物群體中盡可能多的核苷酸序列，并加以比較。另外，用于特異性檢測的靶基因需具有足夠多的差異核苷酸序列，使之可以與最鄰近的親緣種屬區(qū)別開。因此，靶基因必須具有足夠快的進(jìn)化速度。
另外，不能使用在水平方向上高頻率伸延、與種系發(fā)育相獨(dú)立的基因，如副溶血弧菌的毒素基因。本發(fā)明中用作靶分子的σ70因子為rpoD基因所編碼，是一種控制對(duì)數(shù)期細(xì)菌基因表達(dá)的因子，是細(xì)菌生存所必需的蛋白質(zhì)。因此該因子用于種系分析是適當(dāng)?shù)?，因?yàn)樗鼛缀醪谎厮椒较蛏煅?spread horizontally)，同時(shí)具有適當(dāng)?shù)倪M(jìn)化速率(Int.J.Syst.Bacteriol.1998；48，813-819，Int.J.Syst.Bacteriol.1999；49，87-95)。
附圖簡述
圖1.基于rpoD基因序列的弧菌屬系統(tǒng)樹。
圖2.基于rpoD基因的來源于食物的副溶血弧菌樣菌落種系分析。
對(duì)通過直接測序方法得到的rpoD基因中約800bp的部分序列進(jìn)行分析后，用鄰位相連法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹。根據(jù)生物化學(xué)性質(zhì)分析(依據(jù)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)鑒定試驗(yàn))定為副溶血弧菌的菌株描述為V.parahaemolyticus。如圖所示，副溶血弧菌所屬的種系群(phyletic group)表示為V.p，弧菌屬的其它種系群分成C1至C5。此處大腸桿菌株K12和霍亂弧菌的rpoD基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)為AE000388和AE004138。
圖3.弧菌屬rpoD基因的核苷酸序列在該門中的特異性信息。
本圖顯示了對(duì)V.p門和C1至C3(見圖1)的共有序列進(jìn)行測定，并進(jìn)行同源性分析后的結(jié)果。上方為V.p(副溶血弧菌所屬的門)，下方為C1到3門的共有序列。連續(xù)小*號(hào)指示的部分為與上方序列相同的序列。連續(xù)大·號(hào)指示的部分為副溶血弧菌特有的核苷酸。指示符號(hào)D＝A或G或T；H＝A或C或T；V＝A或C或G；R＝A或G；Y＝C或T，K＝G或T，M＝A或C，S＝G或C，W＝A或T，及N＝A或G或T或C。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式我們已研制出一種通過PCR直接測序法來測定編碼RNA聚合酶σ70因子的rpoD基因核苷酸序列的簡單方法[日本專利申請(qǐng)公開號(hào)(Kokai)NO.8-256798](表1)。
因此，利用該方法，我們測定了上述表1中所示弧菌屬[購自Institute for Fermentation，Osaka(IFO)]各標(biāo)準(zhǔn)株和副溶血弧菌原種菌株(含有及不合毒素基因的菌株)的rpoD基因核苷酸序列，從而闡明了其種系關(guān)系。特別地說，表1中所示的受試菌株在補(bǔ)充有2％NaCl的腦/心融合基質(zhì)(NISSUI PHARMACEUTICAL Co.，Ltd)上于35℃培養(yǎng)生長過夜。用PUREGENE DNA分離試劑(Gentra SYSTEMS)從1ml培養(yǎng)溶液中提取染色體DNA。以提取出來的DNA為模板，用rpoD擴(kuò)增通用引物[如日本專利申請(qǐng)公開號(hào)(Kokai)NO.8-256798所述的s70SACgACTgACCCggTACgCATgTAYATgMgNgARATgggNACNgT和s70RATAgAAATAACCAgACgTAAgTTNgCYTCNACCATYTCYTTYTT]，通過PCR方法擴(kuò)增得到長約800bp的rpoD基因片段(位于大腸桿菌株K12的rpoD基因序列上334-1125處，對(duì)應(yīng)于氨基酸序列的112-376處的區(qū)域)。擴(kuò)增反應(yīng)用耐熱DNA聚合酶(AmpliTap GoldApplied Biosystems)和GENE MATE熱循環(huán)儀(ISC BioExpress)進(jìn)行。制備50μl含1μg DNA、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、0.01％明膠、0.2mM各種dNTP，2.5U AmpliTaq和1μM各種引物的反應(yīng)溶液。反應(yīng)條件為AmpliTap Gold活化(95℃10分鐘)，反應(yīng)循環(huán)40次(94℃1分鐘，56℃1分鐘及72℃1分鐘)，然后進(jìn)行延伸反應(yīng)(72℃10分鐘)。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠(Sea Plaque GTG瓊脂糖BioWhittaker Molecular Applications)電泳(0.5×TAE，100V 30分鐘)，然后溴化乙錠染色10分鐘。在紫外線照射下確認(rèn)產(chǎn)物的存在，把它從膠上切下來，用Wizard PCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)純化，從而制備測序反應(yīng)的模板。用預(yù)先加入上述作為通用rpoD基因引物的引物的測序序列[如日本專利申請(qǐng)公開號(hào)(Kokai)NO.8-256798所述的s70SACgACTgACCCggTACgCATgTA和s70RATAgAAATAACCAgACgTAAgTT]、ABI PRISM BigDye末端循環(huán)測序即用型反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems)和Gene MATE熱循環(huán)儀(ISC BioExpress)進(jìn)行測序反應(yīng)。制備含20ng DNA和3.2pmol引物及8μl BigDye末端循環(huán)測序即用型反應(yīng)混合物的反應(yīng)溶液，使其終體積為20μl。循環(huán)測序反應(yīng)包括92℃加熱10分鐘，然后96℃10秒鐘、58℃或46℃(分別對(duì)應(yīng)于s70SACgACTgACCCggTACgCATgTA和s70RATAgAAATAACCAgACgTAAgTT)5秒鐘、60℃4分鐘，共25個(gè)循環(huán)。使用ABIPRISM 310基因分析儀(Applied Biosystems)進(jìn)行核苷酸序列分析。利用ClustalW計(jì)算機(jī)程序?qū)λ@得的核苷酸序列進(jìn)行多重對(duì)比分析，然后以PHYLIP計(jì)算機(jī)程序包和Kimura’s 2-參數(shù)模型[J.Mol.Evol，(1980)Vol.16，No.2，p.111-20]計(jì)算的遺傳距離為基礎(chǔ)，通過鄰位相連法(Mol.Biol.Evol.Vol.4，No.4，406-425)構(gòu)建系統(tǒng)樹。
結(jié)果，在弧菌屬的各菌株中，測定為含毒素基因(tdh或trh)的副溶血弧菌的所有菌株和一株標(biāo)準(zhǔn)株(IFO 12711T)共同組成弧菌屬菌株中一個(gè)獨(dú)立的單種系群(見圖1)。因此，結(jié)果表明屬于該門的細(xì)菌應(yīng)該確定為副溶血弧菌。接下來，對(duì)于從食物樣品中分離出來、在TCBS瓊脂基質(zhì)(NISSUI PHARMACEUTICAL Co.，Ltd)形成副溶血弧菌樣略呈綠色的藍(lán)色菌落的64株菌株，利用與標(biāo)準(zhǔn)株相似的步驟測定rpoD基因的核苷酸序列，然后進(jìn)行種系分析。圖2列出了分析結(jié)果。所分析的64株中有11株與上述測定為副溶血弧菌的菌株同屬一門。為了核實(shí)基因分析的結(jié)果，依據(jù)食品檢驗(yàn)指南所述一級(jí)及二級(jí)鑒定試驗(yàn)來進(jìn)行試驗(yàn)，以鑒定其生物化學(xué)性質(zhì)。特別地說，一級(jí)反應(yīng)包括氧化酶各參數(shù)、TSI基質(zhì)中的乳糖/蔗糖降解能力、葡萄糖降解時(shí)氣體產(chǎn)生能力、硫化氫產(chǎn)生能力、運(yùn)動(dòng)能力測定、SIM基質(zhì)上的吲哚產(chǎn)生能力、吲哚丙酮酸產(chǎn)生能力、運(yùn)動(dòng)性確認(rèn)、賴氨酸脫羧酶活性、伏-波試驗(yàn)及鹽耐受試驗(yàn)(0，3，7和10％的NaCl)；二級(jí)反應(yīng)包括ONPG各參數(shù)、鳥氨酸脫羧酶活性、精氨酸脫水酶活性及各種糖(阿拉伯糖、麥芽糖、纖維糖、木糖、水楊苷、甘露醇、甘露糖、乳糖和蔗糖)的發(fā)酵能力。在一級(jí)鑒定試驗(yàn)中，副溶血弧菌具有下列性質(zhì)氧化酶，陽性；TSI基質(zhì)中的乳糖/蔗糖降解能力，無降解；硫化氫，不產(chǎn)生；葡萄糖降解時(shí)氣體產(chǎn)生能力，無氣體產(chǎn)生；SIM基質(zhì)上的吲哚產(chǎn)生能力，陽性；吲哚丙酮酸產(chǎn)生能力，陰性；運(yùn)動(dòng)性，陽性；賴氨酸脫羧酶活性，陽性；伏-波試驗(yàn)，陰性；鹽耐受試驗(yàn)(0，3，7和10％的NaCl)-，+，+和-。在二級(jí)鑒定試驗(yàn)中，副溶血弧菌具有下列性質(zhì)ONPG，陰性；鳥氨酸脫羧酶活性，陽性；精氨酸脫水酶活性，陰性；糖發(fā)酵能力(阿拉伯糖，陽性；麥芽糖，陽性；纖維糖，陰性；木糖，陰性；水楊苷，陰性；甘露醇，陽性；甘露糖，陽性；乳糖，陰性；蔗糖，陰性)。上述生物化學(xué)試驗(yàn)顯示，對(duì)于來源于食物的、屬于副溶血弧菌門的、依據(jù)前面的rpoD基因分析而測定為副溶血弧菌的菌株來說，只有11株測定為副溶血弧菌。因此，可通過rpoD基因分析精確地區(qū)別和鑒定副溶血弧菌種群。
為了建立能夠只檢測副溶血弧菌組分的遺傳篩選方法，進(jìn)行下列操作。首先，為了闡明密切相關(guān)物種間核苷酸序列的區(qū)別，將副溶血弧菌所屬門和其鄰近門的rpoD基因核苷酸序列加以比較，然后鑒定副溶血弧菌中保守但與其他屬于亞弧屬的細(xì)菌不同的核苷酸位置。特別地說，測定副溶血弧菌所屬種系群的共有序列，并與C-1至C-3的共有序列相比，其中C-1至C-3是如圖2所示亞弧菌屬的其他細(xì)菌種系群，在系統(tǒng)樹中與副溶血弧菌所屬門緊鄰。由此構(gòu)建種系特異性信息(圖3)。圖中顯示，序列表中SEQ ID1的序列在33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735或798位的核苷酸在副溶血弧菌所屬門中是特征性的。利用該門中包含這些特征性核苷酸的特異性序列，可以設(shè)計(jì)具高特異性的探針及具有高度特異性和極好擴(kuò)增效率的基因擴(kuò)增引物。
例如，利用包含15個(gè)或更多連續(xù)核苷酸、含有與密切相關(guān)物種不同的核苷酸的rpoD基因核苷酸序列，引物可以設(shè)計(jì)成總是包含與密切相關(guān)物種不同的核苷酸位置，優(yōu)選20或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選不少于20并且不超過40個(gè)核苷酸。類似的，利用包含15個(gè)或更多連續(xù)核苷酸、含有與密切相關(guān)物種不同的核苷酸的rpoD基因核苷酸序列，探針可以設(shè)計(jì)成總是包含與密切相關(guān)物種不同的核苷酸位置，優(yōu)選20或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選不少于20并且不超過100個(gè)核苷酸。
另外，可優(yōu)選高頻率包含上述與密切相關(guān)物種不同的核苷酸的區(qū)域來制備引物和探針，如包含259、261、264、267和270為核苷酸的區(qū)域，包含141、147和148位核苷酸的區(qū)域，包含192、198和204位核苷酸的區(qū)域，包含223、229和234位核苷酸的區(qū)域及包含594和597位核苷酸的區(qū)域。對(duì)于引物來說，3’端優(yōu)選副溶血弧菌特異性的核苷酸。
本發(fā)明的基因擴(kuò)增引物可用于檢測、定量測定或鑒定副溶血弧菌。本發(fā)明包括檢測、定量性測定或鑒定副溶血弧菌的試劑盒，該試劑盒包括這些引物和探針及其他試劑的組合。
表1、所用的菌株列表副溶血弧菌 IFO 12711 T溶藻弧菌 IFO 15630 T溶蛋白弧菌 IFO 13287 T海蛹弧菌 IFO 15637 T弧菌屬標(biāo)準(zhǔn)株 8株坎氏弧菌 IFO 15631 T哈氏弧菌 IFO 15634 T鯊魚弧菌 IFO 15632 T塔氏弧菌 IFO 15644 TV89-655 O3K6 TRH+V89-056 O4K8 TDH+V99-157 O1K56 TDH+副溶血弧菌原種株 來源于人的13株 V99-161 O4K11 TDH+V99-177 O4K8 TDH+V99-215 O3K6 TDH+V99-223 O4K9 TDH+來源于食物 不產(chǎn)生毒素的菌株6株從TCBS基質(zhì)分離的菌株 64株 來源于食物總計(jì) 85株實(shí)施例現(xiàn)以實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明。但是，實(shí)施例代表本發(fā)明的實(shí)施方案，而不對(duì)本發(fā)明作任何限制。
利用表2所示檢測和鑒定副溶血弧菌的引物，通過PCR方法嘗試對(duì)副溶血弧菌的特異性檢測。另外，權(quán)利要求
10-15所述引物分別為F1、F2、F5、F6、R1和R2。以如表1所示受試菌株中提取出來的染色體DNA作為模板。表2顯示了所用引物的相關(guān)細(xì)節(jié)。利用ABIPRISM BigDye末端循環(huán)測序即用型反應(yīng)試劑盒(AppliedBiosystems)和Gene MATE熱循環(huán)儀(ISC BioExpress)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。制備含0.1μg DNA、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mMMgCl2、0.01％明膠、dNTP(各0.2mM)，2.5U AmpliTaq及引物的反應(yīng)溶液，使其終體積為20μl。反應(yīng)條件為用AmpliTap Gold活化(95℃ 10分鐘)、94℃ 1分鐘35～40個(gè)循環(huán)、退火1分鐘(溫度見表3)、72℃ 1分鐘，然后72℃延伸反應(yīng)10分鐘。表3列出了引物組合及擴(kuò)增反應(yīng)條件。擴(kuò)增后取5μl反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠(瓊脂糖SNIPPON GENE CO.，LTD)電泳(0.5×TAE，100V 30分鐘)，溴化乙錠染色10分鐘，在紫外線照射下確認(rèn)所擴(kuò)增的rpoD基因產(chǎn)物的存在與否。
利用4種正義引物和2種反義引物的共8種引物組合，篩選受試菌株。這樣，只有屬于確定為副溶血弧菌門的DNA顯示陽性結(jié)果(表4)。
表2用于特異性檢測副溶血弧菌的引物引物 序列 長度 位置a方向F1 agarcttcgtctgactgatt 20 129-148 正義F2 aagaagacctagaagatgat 20 251-270 正義F5 cagcwgcgccaaccgcgact 20 185-204 正義F6 ctgarctgtctgaarctcaa 20 215-234 正義R1 gttaccagtgaatagggca 19 609-591 反義R2 attcgttaccagtgaatagg 20 613-594 反義a.指SEQ所代表之核苷酸序列中從5’端起始的位置。
表3用于特異性檢測副溶血弧菌之引物的PCR條件PCR條件正義引物 反義引物 擴(kuò)增產(chǎn)物(bp)退火溫度(℃) 循環(huán)數(shù) 引物濃度(mM)F1 R1 483 58 35 0.1F2 R1 361 56 40 0.1F5 R1 427 64 40 0.1F6 R1 397 60 35 0.1F1 R2 485 58 40 0.1F2 R2 365 60 40 0.5F5 R2 431 60 40 0.1F6 R2 401 56 40 0.1
表4利用特異性檢測副溶血弧菌的引物的PCR結(jié)果
表4利用特異性檢測副溶血弧菌之引物的PCR結(jié)果
表4利用特異性檢測副溶血弧菌之引物的PCR結(jié)果
工業(yè)適用性就檢測的準(zhǔn)確性來說，本發(fā)明的rpoD基因引物和探針是優(yōu)秀的。這是因?yàn)樗鼈兊脑O(shè)計(jì)基于對(duì)副溶血弧菌種系關(guān)系的徹底認(rèn)識(shí)，通過這種認(rèn)識(shí)對(duì)如何提高特異性進(jìn)行了研究。因此，在細(xì)菌不從食物中分離及同屬細(xì)菌物種共存的條件下，rpoD基因引物和探針用于直接檢測有著巨大優(yōu)勢。
序列表說明SEQ ID No.s 9～12為引物。
于2001年8月3在日本專利局提交、要求享有優(yōu)先權(quán)、專利申請(qǐng)?zhí)枮?001-235806的說明書內(nèi)容，包括權(quán)利要求
書和附圖，在該說明書中引入作為參考。
序 列 表<110>Nichirei Corporation<120>副溶血弧菌的鑒定<130>PH-1546-PCT<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>807<212>DNA<213>副溶血弧菌<400>1actcgcraag gcgaaatcga catcgcaaaa cgcattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60tcgtctgttg ctgaataccc tggcactatt ccttacatcc tagagcaatt tgataargtt 120caggcagaag arcttcgtct gactgattta atctctggct ttgtagatcc tgacgctgac 180gatacagcwg cgccaaccgc gactcacatc ggttctgarc tgtctgaarc tcaattagaa 240gaggaagacg aagaagacct agaagatgat gaagaragcg atgacgattc agatgaytcr 300gaagaagatg taggtattga yccagagctr gcgcttgaga aattcaacca gctacgcagc 360acataccaaa atcttcagct agcgatcaat gagtacggct acgacagccc gaaagcaacc 420gttgctaacg aaatgatgct rgacgtattc aaagaattcc gtctaacacc aaaacagttc 480gaccacctag tgaacgaact tcgyacwgca atggatcgcg ttcgtactca agaacgtttg 540atcatgaagt ctgtggttga atacggcaaa atgccgaaga aatcgttyat tgccctattc 600actggtaacg aatcaagtga tgcatggcta gacgagatcc tmgcatctga caagccatac 660gctgagaaaa tcaaacgtaa cgaagaagag atccgtcgtt caatckckaa gttaaaaatg 720attgaagaag agacatmtct aaacgtacar aacattaaag acatcagccg tcgcatgtct 780atcggtgaag cgaaagcacg ccgtgcg 807<210>2<211>807<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述除溶血弧菌外的水生弧菌的共有序列
<400>2actcgcgaag gcgaaatcga catcgcaaaa cgtattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60tcgtctgttg ctgaataccc wggyacdaty ccrtacatyc ttgagcartt tgayaargtw 120caagcwgaag aaytdcgtct wacwgacctw atytcwgght ttgthgaycc wgaygchgay 180gayacvrcwg chccracrgc racrcacaty ggttctgarc tractgaatc tcagytagaa 240gawgaagayg awgaagacgt tgatgamgac gaagawrgyg aygayrrykm wgatgahdcw 300gargaagatg twggtatyga yccwgarytd gcgctwgaga aattcaacca rctacgcagy 360acvtaycaaa aycttcaryt wgcaatcaac garyacggyt ayravagycc kaaagcracm 420gtwgcwaayg arwtgatgct agacgtatty mrmgarttyc gtctracrcc waaacagtty 480gaycacytag traaygaayt rcgyacnkcd atggatcgyg ttcgtacwca agarcgyytg 540atcatgaark cwryngttga atacggcaaa atgccgaaga aatcrttyat ygcrctgtty 600acwggyaayg aatcwashga wgcwtggytr gatgarrtyy twkcwtcwga yaagccatac 660gctgaraara tyaaacgtar cgaagaagar atycgycgyt caatcrctaa rctaaaratg 720attgarrahg aracytmtct rammgtwcar aacatyaaag acatcagccg tcgyatgtmt 780atcggtgaag craaagmkcg ycgtgck 807<210>3<211>20<212>DNA<213>副溶血弧菌<400>3agarcttcgt ctgactgatt 20<210>4<211>20<212>DNA<213>副溶血弧菌<400>4aagaagacct agaagatgat 20<210>5<211>20<212>DNA<213>副溶血弧菌<400>5cagcwgcgcc aaccgcgact 20<210>6<211>20<212>DNA
<213>副溶血弧菌<400>6ctgarctgtc tgaarctcaa 20<210>7<211>19<212>DNA<213>副溶血弧菌<400>7gttaccagtg aatagggca 19<210>8<211>20<212>DNA<213>副溶血弧菌<400>8attcgttacc agtgaatagg 20<210>9<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>9acgactgacc cggtacgcat gtayatgmgn garatgggna cngt 44<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>10acgactgacc cggtacgcat gta 23<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>11atagaaataa ccagacgtaa gttngcytcn accatytcyt tytt 44
<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>12a tagaaa taa ccagacgtaa gtt 2345/5
權(quán)利要求
1.SEQ ID NO1所表示的基因片段，該片段可用于設(shè)計(jì)特異性基因擴(kuò)增引物或探針，包括序列表中SEQ ID NO1的編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)中的，為副溶血弧菌組群所特有的，第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
2.一種基因擴(kuò)增引物，它包含由15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸組成的鏈，或其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，所述核苷酸包括序列表中SEQ ID NO1的編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)中的，為副溶血弧菌組群所特有的，第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
3.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，它使用高頻率地包含權(quán)利要求
2中列舉的副溶血弧菌所特有的位置的區(qū)域。
4.權(quán)利要求
3的基因擴(kuò)增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第259、261、264、267和270位核苷酸的鏈，或其互補(bǔ)鏈。
5.權(quán)利要求
3的基因擴(kuò)增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第141、147和148位核苷酸的鏈，或其互補(bǔ)鏈
6.權(quán)利要求
3的基因擴(kuò)增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第192、198和204位核苷酸的鏈，或其互補(bǔ)鏈。
7.權(quán)利要求
3的基因擴(kuò)增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第223、229和234位核苷酸的鏈，或其互補(bǔ)鏈。
8.權(quán)利要求
3的基因擴(kuò)增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第594和597位核苷酸的鏈，或其互補(bǔ)鏈。
9.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，其中3’端的核苷酸為副溶血弧菌特有的核苷酸，其位置是權(quán)利要求
2中列舉的位置。
10.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，其包括5’-agarcttcgtctgactgatt-3’，或其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
11.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，其包括5’-aagaagacctagaagatgat-3’，或其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
12.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，其包括5’-cagcwgcgccaaccgcgact-3’，或其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
13.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，其包括5’-ctgarctgtctgaarctcaa-3’，或其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
14.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，其包括5’-gttaccagtgaatagggca-3’，或其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
15.權(quán)利要求
2的基因擴(kuò)增引物，其包括5’-attcgttaccagtgaatagg-3’，或其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
16.一種檢測、定量測定或鑒定副溶血弧菌的方法，該方法利用了權(quán)利要求
2-15中任一項(xiàng)的引物。
17.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求
2-15中任一項(xiàng)的引物。
18.一種檢測、定量測定或鑒定副溶血弧菌的探針，它包含15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸，這些核苷酸包括序列表中SEQ ID NO1的編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)中的，為副溶血弧菌組群所特有的，第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
專利摘要
制備用于檢測、定量測定或鑒定副溶血弧菌的高性能、特異性基因擴(kuò)增引物，該引物錯(cuò)誤鑒定率低，在實(shí)際應(yīng)用中具有足夠高的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性。發(fā)明人測定了弧菌屬各標(biāo)準(zhǔn)株和副溶血弧菌原種菌株(含有及不含毒素基因的菌株)的rpoD基因核苷酸序列；闡明了其種系關(guān)系，并鑒定了其中的特征性核苷酸，因而能夠設(shè)計(jì)包含它們且具有高度特異性的探針，及具有高度特異性和良好擴(kuò)增效率的基因擴(kuò)增引物。
文檔編號(hào)C12N9/12GKCN1564872SQ02819672
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2002年8月1日
發(fā)明者小泉雄史, 山本敏, 伊藤武, 中川弘 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日冷導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan