專利名稱：含透明質(zhì)酸締合物的新組合物及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸與周期表第四周期的3d金屬離子的新締合物(配合物)以及含這些締合物(配合物)作為活性成分的組合物。
本發(fā)明還涉及這些新締合物(配合物)和含這些締合物(配合物)作為活性成分的組合物的制備方法。
按照本發(fā)明方法的一種具體優(yōu)選的實(shí)施方案，含有去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸與周期表第四周期3d金屬離子的新締合物的水溶液，直接由透明質(zhì)酸鈉水溶液制備。
本發(fā)明的新締合物主要包括透明質(zhì)酸鋅和鈷。含有透明質(zhì)酸鋅和鈷的組合物可以是藥物(醫(yī)療)組合物、美容組合物和任意的其它組合物。含有本發(fā)明新締合物的組合物適于，例如加速上皮缺損體表面的上皮形成、治療腳潰瘍和褥瘡(床潰瘍)以及治療基本上不愈合的傷口、燒傷、輻射創(chuàng)傷或熱致創(chuàng)傷和治療尋常座瘡及聚會(huì)性痤瘡，此外還可以由于其它領(lǐng)域之中。
透明質(zhì)酸是五十多年前已為人們所知的一種大分子物質(zhì)，最初由Meyer等人報(bào)導(dǎo)在<J.Biol.Chem.>，107，629(1954)和<J.Biol.Chem.>，114，689(1936)上。結(jié)構(gòu)測(cè)定是由Weissman等人完成的[J.Am.Chem.Soc.76，1753(1954)]。透明質(zhì)酸是高粘度的天然葡糖胺聚糖(glucosaminoglycan)，其中含有交替存在的β1-3葡糖酸和β1-4葡糖胺部分，其分子量介于50000和幾(8-13)百萬(wàn)之間?；厥胀该髻|(zhì)酸是一項(xiàng)年代久遠(yuǎn)的工作，超純透明質(zhì)酸的分離和應(yīng)用載于例如4，141，973和4，303，676號(hào)美國(guó)專利說(shuō)明書中和0，144，019號(hào)歐洲專利說(shuō)明書中。直到近年，透明質(zhì)酸以鈉鹽形式用于醫(yī)療之中，主要用于眼科、外科和美容之中。透明質(zhì)酸與堿金屬、堿土金屬、鎂、鋁、銨或取代的銨離子形成的鹽，可以用作促進(jìn)藥物吸收用的載體(見904，547號(hào)比利時(shí)專利)。透明質(zhì)酸的重金屬(其中重金屬是指周期表第5、6和7周期的元素以及鑭系和錒系元素)鹽和其中的銀鹽被用作殺真菌劑，而金鹽用來(lái)治療關(guān)節(jié)炎(見WO87/05517)。
經(jīng)各種結(jié)構(gòu)分析法證實(shí)，鍵合金屬離子改變二級(jí)結(jié)構(gòu)(即透明質(zhì)酸的構(gòu)象)[W.T.Winter和A.SrutherJ.Mol.Biol.517，761(1977);J.K.Sheehan和E.D.T.AtkinsInt.J.Biol.Macromol.5，215(1983);以及N.Figueroa和B.ChakrabartiBiopolymers17，2415(1978)]。正如透明質(zhì)酸的鉀鹽和鈉鹽的X射線對(duì)比研究所表明的那樣，甚至于某些類似性質(zhì)的金屬離子都能對(duì)分子結(jié)構(gòu)的變化施加顯著影響[A.K.Mitra等J.Macromol.，Sci.Phys，824，1和21(1985)]。對(duì)于透明質(zhì)酸與帶各種電荷的各類金屬離子形成的化合物來(lái)說(shuō)，這種影響更顯著。
在文獻(xiàn)中未能找到與由透明質(zhì)酸和周期表第四周期的3d金屬離子所形成的締合物(配合物)有關(guān)的文章;實(shí)際上按照對(duì)透明質(zhì)酸的硅膠柱色譜研究表明，與肝素相反，透明質(zhì)酸結(jié)合鋅離子不穩(wěn)定[R.F.Parish和W.R.FairBiochem.J.193，407-410(1981)]。
盡管根據(jù)文獻(xiàn)記載知透明質(zhì)酸(或其鈉鹽)結(jié)合鋅離子不穩(wěn)定，但是本發(fā)明人等卻著手研究了透明質(zhì)酸與周期表第四周期的3d金屬離子(其中，主要是鋅和鈷離子)之間反應(yīng)的配位化學(xué)。既然透明質(zhì)酸幾乎均以鈉鹽形式出售，因此透明質(zhì)酸鈉是所有含透明質(zhì)酸鹽體系的基礎(chǔ)物質(zhì)，所以我們從鈉離子與透明質(zhì)酸鹽之間的反應(yīng)開始研究。為此，用鈉選擇性玻璃電極測(cè)量透明質(zhì)酸鈉水溶液的游離鈉離子活性。這些測(cè)量結(jié)果清楚地表明，與透明質(zhì)酸鹽的羧酸鹽基團(tuán)一起等當(dāng)量引入的60%以下的鈉離子以游離離子形式存在于水溶液中，而其余40%的鈉離子與所說(shuō)的透明質(zhì)酸鹽鍵合。
根據(jù)我們的測(cè)量結(jié)果，被鍵合的鈉離子量隨鈉離子濃度的增加而提高，可以達(dá)到各種可得羧酸鹽基計(jì)算值的50-55%。由此證實(shí)，透明質(zhì)酸鈉與鹽的一般性質(zhì)不同，在水溶液中它不完全解離。
在我們的第二步研究之中，使用氯化鋅溶液和上面提到的鈉離子選擇電極滴定透明質(zhì)酸鈉水溶液，以便查明該體系中游離鈉離子的活度變化。反映此過(guò)程的特性曲線示于

圖1。從中可以看出，在鋅離子作用下原來(lái)與透明質(zhì)酸鹽鍵合的鈉離子釋出。根據(jù)這些測(cè)量結(jié)果，即，全部鈉離子被等當(dāng)量鋅所釋放，此事實(shí)明確證明與鈉離子相比，鋅離子與透明質(zhì)酸鹽的結(jié)合能力更強(qiáng)。因此，關(guān)于透明質(zhì)酸與鋅離子不能結(jié)合的這種在先看法[R.F.Parrish和W.R.FairBiochem.J.193，407(1981)]，被實(shí)驗(yàn)所駁倒。
因而，本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員迄今所持的看法，證明是不正確的。
由我們研究的上述討論說(shuō)明，通過(guò)等當(dāng)量透明質(zhì)酸鈉和鋅離子(氯化鋅)在水溶液中相互反應(yīng)，形成具有化學(xué)計(jì)算組成的透明質(zhì)酸鋅締合物。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)葷B作用之后，得到的溶液可以直接用于治療目的，而且所說(shuō)的鋅化合物不一定在單獨(dú)工序中制成固態(tài)。利用鈷離子和其它3d金屬離子所進(jìn)行的初步試驗(yàn)，得到的結(jié)果類似。
然而，為了作特性鑒定制備了固態(tài)下的所說(shuō)配合物，并且利用“擴(kuò)展X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)”(EXAFS)法測(cè)定了鋅離子的正向環(huán)境。據(jù)認(rèn)為在一級(jí)配位球中鋅被四個(gè)氧原子包圍。Zn-O鍵長(zhǎng)為199微微米(pm)，而距鋅原子較長(zhǎng)距離(241pm)內(nèi)存在兩個(gè)碳原子。
根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)，透明質(zhì)酸鋅顯著不同于類似的銅配合物，后者包含四個(gè)平伏的Cu-O鍵和2個(gè)直立的Cu-O鍵，鍵長(zhǎng)分別為194和234pm。銅原子和靠近的兩個(gè)碳原子之間的距離為258pm。所說(shuō)的鈷配合物的結(jié)構(gòu)與所說(shuō)的鋅配合物的相似，但與銅配合物不同。
因此，本發(fā)明涉及去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸與周期表第四周期3d金屬離子形成的締合物(配合物)。
本發(fā)明還涉及含有透明質(zhì)酸與周期表第四周期3d金屬離子形成的締合物(配合物)作為活性成分或載體的組合物，其中還選擇性含有其它活性成分和/或添加劑。
另一方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明新締合物(配合物)的方法，其中包括a)向透明質(zhì)酸鈉或其它透明質(zhì)酸鹽(堿金屬鹽、堿土金屬鹽或任選的銀鹽)水溶液中，加入含有等當(dāng)量鹽(優(yōu)選周期表第四周期3d金屬離子之一的氯化物)的水溶液;或者b)將透明質(zhì)酸與季銨鹽形成的締合物水懸浮液溶解在一種復(fù)合溶劑中，所說(shuō)復(fù)合溶劑含有周期表第四周期3d金屬離子的水溶液和與水部分混溶的溶劑(優(yōu)選正丙醇);然后-按已知方法，用鏈烷醇或鏈烷酮沉淀由透明質(zhì)酸和周期表第四周期3d金屬離子形成的所說(shuō)締合物(配合物)，或者-從所說(shuō)的溶液中分離所說(shuō)的沉淀物，然后在必要時(shí)，-在溫和條件下干燥該沉淀物。
基于上述內(nèi)容，提出了一種制備分別含有透明質(zhì)酸鋅締合物(配合物)或者周期表第四周期3d金屬離子的類似締合物作為活性成分之水溶液的方法。這些溶液都是由所說(shuō)金屬離子和所說(shuō)透明質(zhì)酸鹽成分直接反應(yīng)制備的。這種制備方法不必事先將上面提到的活性成分以固態(tài)形式分離出來(lái)。在用本發(fā)明方法制成的溶液中，甚至于在等當(dāng)量鋅存在下，游離的(未鍵合的)透明質(zhì)酸鹽量都可忽略不計(jì)。在過(guò)量鋅離子作用下，按化學(xué)計(jì)算量形成透明質(zhì)酸鋅締合物(配合物)。
按上述方式制備所說(shuō)金屬締合物期間，PH依然保持在5左右。當(dāng)透明質(zhì)酸鹽溶液濃度為0.2(Wt./Vol.)%時(shí)，PH為5.4;而當(dāng)濃度為0.5(Wt/Vol.)%時(shí)，PH為5。必要時(shí)，可以加入幾滴乙酸鈉等滲溶液來(lái)將后一體系的PH調(diào)節(jié)為5.5-5.6。
采用上面討論的方法制備了含有透明質(zhì)酸鋅作為活性成分的兩種溶液。
1.用過(guò)量氯化鋅制成等滲的透明質(zhì)酸鋅溶液。
鑒于游離的氯化鋅也可以單獨(dú)用于皮膚病學(xué)之中，因而利用過(guò)量的氯化鋅將透明質(zhì)酸鋅溶液的滲透壓調(diào)節(jié)到等滲值。這樣得到的溶液根本不含游離的(鋅未鍵合的)透明質(zhì)酸鹽，但是此體系中過(guò)量的氯化鋅與透明質(zhì)酸鋅一起存在。
2.用單糖或糖醇制成等滲的透明質(zhì)酸鋅溶液。
對(duì)于其中未指出透明質(zhì)酸鹽未鍵合的鋅離子存在的醫(yī)療用途來(lái)說(shuō)，用多元醇(糖醇，優(yōu)選山梨糖醇)或者單糖或雙糖(優(yōu)選葡萄糖)將含有當(dāng)量數(shù)與所說(shuō)透明質(zhì)酸鹽相等的鋅離子的溶液制成等滲的。后面的這些體系中游離鋅離子和游離透明質(zhì)酸鹽含量，分別未達(dá)到總鋅量和總透明質(zhì)酸鹽含量的5%。
使用本發(fā)明的締合物時(shí)，甚至可能需要無(wú)離子的混合物。也就是說(shuō)，按照本發(fā)明上述方法制備的締合物，通常含有氯化鈉或者由原始的透明質(zhì)酸鹽陽(yáng)離子和3d金屬鹽陰離子形成的其它鹽。
可以使用兩種不同的具體方法制備由3d金屬離子形成的無(wú)鹽透明質(zhì)酸締合物，這兩種具體方法如下。
a)將季銨鹽溶液分批加入已知透明質(zhì)酸鹽(優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉)溶液中。經(jīng)過(guò)充分純化后，將沉淀的透明質(zhì)酸季銨新締合物在快速攪拌下溶解在復(fù)合溶劑中，所說(shuō)的復(fù)合溶劑由周期表第四周期3d金屬離子的水溶液和與水部分混溶的溶劑(優(yōu)選正丁醇)組成。待兩相分離后，用向水相中加入鏈烷醇或鏈烷酮的方法沉淀所說(shuō)的透明質(zhì)酸鹽締合物，分出沉淀并且洗滌;或者b)攪拌下，將2-3體積的C1-3鏈烷醇或C1-4鏈烷酮加到透明質(zhì)酸鋅溶液中，最好加到含有當(dāng)量數(shù)與所說(shuō)透明質(zhì)酸鹽相等的含氯化鋅的未等滲化溶液中，然后將沉淀的透明質(zhì)酸鋅過(guò)濾和分別用沉淀用的鏈烷醇或鏈烷酮洗滌。必要時(shí)將透明質(zhì)酸鋅溶解在無(wú)離子水中并重復(fù)沉淀。
需要固態(tài)無(wú)離子透明質(zhì)酸鋅時(shí)，于溫和條件下減壓干燥所說(shuō)沉淀。如果需要無(wú)離子的透明質(zhì)酸鋅溶液，最好將制備的無(wú)溶劑透明質(zhì)酸鋅溶解。使用這兩種具體方法中任何一種方法，均得到無(wú)離子的固態(tài)或溶解產(chǎn)物，其純度取決于原料透明質(zhì)酸鋅質(zhì)量。
根據(jù)用于加速上皮缺損表面上皮形成的腳潰瘍治療情況示出了含有本發(fā)明透明質(zhì)酸鋅作為活性成分的組合物(實(shí)施例13)的臨床藥理研究結(jié)果。用含有透明質(zhì)酸鈉的組合物作對(duì)照。
對(duì)患有腳潰瘍的8或12名病人的12或14個(gè)潰瘍分別進(jìn)行了此試驗(yàn)。既按性別、年齡又按病情對(duì)此試驗(yàn)患者進(jìn)行分組的，其分布如下。
所說(shuō)治療是以這樣方式完成的，即在治療開始前，按潰瘍的實(shí)際臨床狀態(tài)進(jìn)行凈化治療。對(duì)幾乎凈化的或者觀察到吸收顯著減少的潰瘍分別用透明質(zhì)酸的鋅鹽或鈉鹽治療。所說(shuō)的治療按下述方式每天進(jìn)行一次將組合物滴在已凈化的潰瘍表面上，滴藥量應(yīng)保證有一薄層藥液濕潤(rùn)傷口表面。
組合物使用四周。將開始治療日期和其后每周一次治療的日期記入日期表中，并且拍下當(dāng)日病人潰瘍照片作證明資料。取滲液樣品作細(xì)菌檢查。
上皮缺損的情況和程度用下列符號(hào)和評(píng)分標(biāo)記。
情況程度面積(a)00小于10cm2110cm2～25cm22大于25cm23感染(b)臨床凈化0感染50%1感染100%2
壞死(c)(僅在動(dòng)脈潰瘍病例中)陰性0小于10%110%～15%2100%3無(wú)壞死4評(píng)定為了進(jìn)行評(píng)定，測(cè)定了每種情況的數(shù)值，并且用下式算出一般嚴(yán)重程度評(píng)分值S=a×b×c]]>在圖2中給出了所說(shuō)的臨床藥理試驗(yàn)結(jié)果。用透明質(zhì)酸鋅治療的結(jié)果由用“×”標(biāo)記的曲線說(shuō)明，而用透明質(zhì)酸鈉治療的結(jié)果由用“口”標(biāo)記的曲線說(shuō)明，這些曲線表示治療效果與治療周數(shù)的關(guān)系?？v坐標(biāo)上的評(píng)分值，表示用上式算出的一般嚴(yán)重程度的分?jǐn)?shù)(Index)。
圖3說(shuō)明以初始評(píng)分值為100%的相對(duì)評(píng)分值，以對(duì)透明質(zhì)酸鋅和用作對(duì)照的透明質(zhì)酸鈉作更準(zhǔn)確的對(duì)比。
用統(tǒng)計(jì)方法評(píng)價(jià)了相對(duì)評(píng)分值隨周數(shù)(1-4)的變化。對(duì)于用鋅和鈉的透明質(zhì)酸鹽治療經(jīng)過(guò)1、2、3和4周后，發(fā)現(xiàn)潰瘍減小的數(shù)目按相對(duì)評(píng)分值計(jì)分別小于90、80、70和60%。試驗(yàn)結(jié)果匯于表1之中。
由表1的結(jié)果可以說(shuō)明，與用透明質(zhì)酸鈉(作為對(duì)照)得到的結(jié)果相比，透明質(zhì)酸鋅每周治療都較好。
對(duì)在所說(shuō)前提下得到的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析證明，與透明質(zhì)酸鈉相比，透明質(zhì)酸鋅組合物的優(yōu)點(diǎn)是十分顯著的(P99%)。
在進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)處理時(shí)，研究了相對(duì)評(píng)分值與治療時(shí)間之間的進(jìn)一步關(guān)系。得到的結(jié)果列于表2之中。
表2的數(shù)據(jù)同樣證明了透明質(zhì)酸鋅的優(yōu)點(diǎn)。更詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)分析說(shuō)明，顯著性隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)而減小。
總之，基于臨床藥理試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)定可以證明，即使在小數(shù)目潰瘍的試驗(yàn)下均證明透明質(zhì)酸鋅的使用效果較好。這種優(yōu)點(diǎn)特別在治療初期得到證實(shí)。
本發(fā)明將由下列非限制性實(shí)施例得到更詳細(xì)說(shuō)明。
透明質(zhì)酸(HA)中蛋白質(zhì)含量用O.H.Lowry法[J.Biol.Chem.193，(1951)]測(cè)定，透明質(zhì)酸鹽粘度用Ostwald粘度計(jì)在生理鹽溶液中于25℃下測(cè)定。外推至“O”濃度下的特性粘度值([η]C→0%25℃)將在下面給出。用Bitter法[Anal.Biochem.4，330(1962)]測(cè)定HA含量。
實(shí)施例1透明質(zhì)酸鋅溶液的制備將40.18mg透明質(zhì)酸鈉溶解在20.0ml二次蒸餾水中。因此透明質(zhì)酸的初始濃度為2.009mg/ml，此溶液的摩爾濃度為4.24×10-3mol/升(Na或透明質(zhì)酸二聚物單元)。測(cè)量期間，將濃度為0.05154mol/升的氯化鋅溶液用微量滴定管加到反應(yīng)混合物中。先分?jǐn)?shù)次每次加入少量(0.05ml)所說(shuō)溶液，然后分?jǐn)?shù)次每次加入較多量(0.1-0.2ml)溶液。用帶數(shù)字顯示的精密電位計(jì)以及鈉離子選擇電極和Ag-AgCl電極測(cè)量所說(shuō)溶液的電位變化。滴定持續(xù)到再加入滴定溶液后測(cè)出的電位值不變?yōu)橹?滴定溶液是在與實(shí)際測(cè)量類似的條件下標(biāo)定的)。
鈉離子選擇電極的選擇性在Zn+離子存在下也被觀察到，存在Zn+是為了控制實(shí)際測(cè)量時(shí)由于向溶液中釋出Na+離子和不引入Zn+引起的電位變化。在與上述條件相似的諸條件下，用氯化鋅滴定溶液滴定2.00×10-3M氯化鈉溶液。當(dāng)Zn濃度從0增加到4×10-3mol/升時(shí)，觀察到電位大約增加2mV，而實(shí)際測(cè)量證明在類似條件下變化約20mV。因此評(píng)價(jià)未遇到干擾。測(cè)量期間，由測(cè)量數(shù)據(jù)算出鈉離子活度的增加，證實(shí)所說(shuō)的鋅締合物定量形成。
氯化鋅溶液的制備由于含有準(zhǔn)確濃度氯化鋅的溶液不能用稱量法直接制備，所以首先制備接近所需濃度的溶液。制備此溶液時(shí)，不應(yīng)當(dāng)用酸，這樣可能出現(xiàn)稱量的氯化鋅溶解不完全的現(xiàn)象。不溶殘?jiān)两岛?大約30分鐘)，將容量瓶充滿至刻度，用濾紙過(guò)濾。
用緩沖溶液10和埃鉻黑T作指示劑，鉻合滴定濾液確定準(zhǔn)確濃度。準(zhǔn)確稀釋此溶液，以制備準(zhǔn)確濃度為0.100mol/升的氯化鋅溶液。
制備溶液用的透明酸鈉的特性如下分子量185000道爾頓蛋白質(zhì)含量0.07wt%紫外吸收A1%2510.133A1%2800.075粘度[η]C-025℃13.7dl/gHA＊含量98.12wt%＊HA＝透明質(zhì)酸(本文中用縮寫詞)實(shí)施例2治療皮膚病用和美容用溶液的制備將用無(wú)離子水制備的濃度為0.100mol/升的12.5ml氯化鋅溶液，加在100ml容量瓶中稱好的0.50克透明質(zhì)酸鈉中(也可以使用其它濃度的氯化鋅溶液，但是氯化鋅量應(yīng)當(dāng)相同)。讓透明質(zhì)酸鋅溶脹12小時(shí)，用無(wú)離子水稀釋此溶液至刻度，得到濃度為0.5(wt/vol)%的透明質(zhì)酸鋅溶液。
用于制備上述溶液的透明質(zhì)酸鈉的特性如下粘度[η]C→0%25℃16.5分升/克，蛋白質(zhì)含量0.8wt%。
實(shí)施例3注射液用透明質(zhì)酸鋅溶液的制備在無(wú)菌條件下進(jìn)行本實(shí)施例所述的各操作。
將用二次蒸餾水(注射用水，無(wú)熱原，無(wú)菌)制備的濃度為0.100mol/升的5.0ml氯化鋅溶液加入稱在100ml容量瓶?jī)?nèi)的0.20克透明質(zhì)酸鈉(粉末狀純品)中，然后用二次蒸餾水將容積充滿到50ml。使透明質(zhì)酸鈉溶脹過(guò)夜，然后振蕩溶解，并用二次蒸餾水將溶液稀釋到刻度。用膜濾器(0.45μ孔徑)過(guò)濾得到的溶液，制得濃度為0.2(wt/vol)%的透明質(zhì)酸鋅溶液。
用于制備上述溶液的透明質(zhì)酸鈉的特性如下質(zhì)量無(wú)熱原的滅菌粉末狀純品，分子量1850000，蛋白質(zhì)含量0.07wt%，紫外吸收A10%251＝0.133，A10%280＝0.075，HA含量98.12wt%，粘度[η]C→0%25℃＝13.7分升/克實(shí)施例4無(wú)離子透明質(zhì)酸鋅溶液的制備攪拌下將600ml分析純乙醇加到按實(shí)施例2制得的200ml透明質(zhì)酸鋅(濃度為0.5wt/vol%)溶液中，沉淀的透明質(zhì)酸鋅用玻璃過(guò)濾器過(guò)濾后，用相同純度的乙醇洗滌兩次，每次用50ml乙醇，然后減壓干燥。這樣制出0.88克透明質(zhì)酸鋅，以它為原料按實(shí)施例2所述方式制備0.50(wt/vol)%的透明質(zhì)酸鋅溶液，制得的這種透明質(zhì)酸鋅溶液不含因透明質(zhì)酸鈉和氯化鋅反應(yīng)生成的氯化鈉，因此它實(shí)際上是無(wú)離子的。
實(shí)施例5無(wú)離子透明質(zhì)酸鋅或其醫(yī)療用溶液的制備在無(wú)菌條件下進(jìn)行本實(shí)施例所述的操作。
攪拌下，向按實(shí)施例3制備的500ml透明質(zhì)酸鋅溶液中，分批加入1500ml最純的乙醇。加畢，攪拌此體系30分鐘，透明質(zhì)酸鋅沉淀用玻璃過(guò)濾器過(guò)濾后，用最純的乙醇洗滌三次，每次用100ml乙醇，在溫和及無(wú)菌條件下減壓干燥。
實(shí)施例6無(wú)離子的透明質(zhì)酸鋅的制備攪拌下，向400ml二次蒸餾水中含1克透明質(zhì)酸鈉的溶液內(nèi)加入200ml 10wt%的HyamineR1622(Puriss)[芐基二甲基/-2-/2-對(duì)(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基/乙氧基/乙基/氯化銨]。離心分離形成的沉淀(即透明質(zhì)酸季銨締合物)，用二次蒸餾水洗滌兩次，每次用100ml水，然后再次離心分離。將洗過(guò)的沉淀溶解在由400ml 2wt/vol%氯化鋅水溶液(PH5.0-5.4)和400ml正丁醇組成的復(fù)合溶劑中。待兩相分離后，用膜濾器(孔徑0.45μ)過(guò)濾含溶解的透明質(zhì)酸鋅的水層，然后加入3體積乙醇沉淀透明質(zhì)酸鋅，用玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，乙醇洗滌，于溫和條件下在氮?dú)夥罩懈稍铮玫?.82克透明質(zhì)酸鋅。
必要時(shí)，用制得的透明質(zhì)酸鋅作原料，按實(shí)施例4所述方法進(jìn)一步提純后制成0.50(wt/vol)%的溶液。作原料用的透明質(zhì)酸鈉的特性如下粘度[η]C→0%25℃16.5分升/克蛋白質(zhì)含量0.18(wt/vol)%也可以用由其它季銨鹽生成的締合物按上述方式制備透明質(zhì)酸鋅?？梢杂糜诖四康牡募句@鹽有例如a)碳化四癸氧甲基-三甲基銨氯化物(carbotetradecyloxy-methyl-trimethylammonium)(參見匈牙利專利說(shuō)明書No.188，537)，b)N-十六碳烷基吡啶氯鹽(hexadecylpyridiniumchloride)，c)N-十六碳烷基吡啶氯鹽(cetylpyridiniumchloride)，d)三甲基銨氯化物等等。
實(shí)施例7透明質(zhì)酸鈷的制備除了將透明質(zhì)酸的季銨締合物溶解在由2wt/vol%CoCl2·6H2O水溶液和正丁醇組成的復(fù)合溶劑中之外，按實(shí)施例6所述的方法操作。
實(shí)施例8制備含有0.50(wt./vol.)%透明質(zhì)酸鋅的水溶液并用氯化鋅使其具有等滲性將大約50ml濃度為0.110mol/升氯化鋅溶液加在100ml容量瓶中的0.50克透明質(zhì)酸鈉中，然后使之溶脹過(guò)夜。振蕩溶解透明質(zhì)酸鈉，容量瓶用濃度為0.110mol/升的氯化鋅溶液充滿至刻度。
所得溶液的滲透壓，用相當(dāng)?shù)穆然c濃度表示為0.1491mol/升，PH值為5.0。必要時(shí)，加入濃度為0.150mol/升的乙酸鈉溶液2.00ml將PH值調(diào)到5.5-5.6。調(diào)節(jié)PH后，溶液的滲透壓用相當(dāng)?shù)穆然c濃度表示為0.1489。
以實(shí)施例3所述的特純透明質(zhì)酸鈉作原料，用二次蒸餾水在無(wú)菌條件下制備透明質(zhì)酸鋅溶液，然后用膜濾器(孔徑0.45μ)過(guò)濾此溶液。
所得到的溶液也可以用在注射組合物中。
實(shí)施例9制備含有0.2wt/vol%透明質(zhì)酸鋅的水溶液并用氯化鋅使其具有等滲性對(duì)于最終容積為100ml來(lái)說(shuō)，稱量0.20克透明質(zhì)酸鈉，并將其溶解在濃度為0.120mol/升的氯化鋅溶液中。
按照實(shí)施例1溶解和制備準(zhǔn)確濃度為0.120mol/升的氯化鋅溶液(根據(jù)估計(jì)改變氯化鋅用量)。
此溶液的滲透壓，用相當(dāng)?shù)穆然c濃度表示為0.154mol/升，PH值為5.3-5.4。
HA含量1.96mg/ml粘度15.9分升/克蛋白質(zhì)含量0.015mg/ml溶液的純度＊A1cm660＝0.015＊根據(jù)用1cm液槽在660nm下測(cè)得的吸收。
采用實(shí)施例2所述特性的透明質(zhì)酸鈉制備此溶液，并且首先用此溶液制備治療皮膚病用的美容用組合物。
實(shí)施例10制備含有0.50wt/vol%透明質(zhì)酸鋅的水溶液并用葡萄糖使其具有等滲性本實(shí)施例的溶液含有透明質(zhì)酸鈉和計(jì)算等當(dāng)量的氯化鋅。
將濃度為0.100mol/升的12.50ml氯化鋅溶液加入稱有0.50克透明質(zhì)酸鈉的100ml容量瓶中。(也可以用其它濃度的氯化鋅，但是氯化鋅量應(yīng)相同)。使透明質(zhì)酸鈉在用無(wú)離子水稀釋至50ml的氯化鋅溶液中溶脹12小時(shí)，然后振蕩溶解。接著加入24.50ml1.00mol/升的葡萄糖溶液，并用無(wú)離子水稀釋到刻度。
此溶液的滲透壓，用相當(dāng)?shù)穆然c濃度表示為0.1495mol/升，PH值為5.4，總鋅濃度為1.25×10-2mol/升。
此溶液用實(shí)施例2所述特性的透明質(zhì)酸鈉制備，并且首先用于制備治療皮膚病組合物和美容組合物。
實(shí)施例11制備含有0.2wt/vol%透明質(zhì)酸鋅的水溶液并用葡萄糖使其具有等滲性本實(shí)施例的溶液含有透明質(zhì)酸鈉和計(jì)算等當(dāng)量的氯化鋅。
將5.0ml濃度為0.100mol/升的氯化鋅溶液加入稱有0.20克透明質(zhì)酸鈉的100ml容量瓶中，然后用去離子水稀釋到50ml。溶脹過(guò)夜后，振蕩溶解透明質(zhì)酸鈉，加入27.0ml1.00mol/升濃度的葡萄糖溶液，用無(wú)離子水充滿容量瓶至刻度。
此溶液的滲透壓用相當(dāng)?shù)穆然c濃度表示為0.151mol/升，PH值為5.6-5.7，總鋅濃度為5×10-3mol/升。
實(shí)施例12制備含有0.5wt/vol%透明質(zhì)酸鋅的水溶液并用山梨糖醇使其具有等滲性以下所述的透明質(zhì)酸鋅溶液，在無(wú)菌條件下用蒸餾水和實(shí)施例3所述的特純透明質(zhì)酸鈉制備。此溶液含有與透明質(zhì)酸鈉計(jì)算等當(dāng)量的氯化鋅。
除了用23.50ml1.00mol/升濃度的山梨糖醇溶液(1升中含182.19克右旋山梨糖醇)代替葡萄糖溶液加到透明質(zhì)酸鋅溶液中之外，按實(shí)施例10所述的方法操作。
用膜濾器(孔徑0.45μ)過(guò)濾這樣制備的溶液，此溶液可以用于包括注射組合物在內(nèi)的各種場(chǎng)合。
此溶液的滲透壓按相當(dāng)?shù)穆然c濃度表示為0.1520mol/升，PH值為5.5，總鋅濃度為1.25×10-2mol/升。
實(shí)施例13制備含有0.2wt/vol%透明質(zhì)酸鋅的水溶液并用山梨糖醇使其具有等滲性本實(shí)施例所述的溶液含有與透明質(zhì)酸鈉計(jì)算等當(dāng)量的氯化鋅。
以下所述的透明質(zhì)酸鋅溶液，在無(wú)菌條件下用二次蒸餾水和實(shí)施例3所述的特純透明質(zhì)酸鈉制備。
按實(shí)施例12的方法操作，但是溶解0.2克透明質(zhì)酸鈉，然后順序加入5ml0.100mol/升濃度的氯化鋅溶液和26.50ml1mol/升濃度的山梨糖醇溶液，最后將此溶液充滿到100ml。用膜濾器(孔徑0.45μ)過(guò)濾如此制備的溶液。此溶液可以用于包括注射組合物在內(nèi)的任何用途。
此溶液的滲透壓按相當(dāng)?shù)穆然c濃度表示為0.1501mol/升，PH值為5.6，總鋅濃度為5×10-3mol/升。
透明質(zhì)酸鹽含量2.03mg/ml，粘度16.1分升/克，蛋白質(zhì)含量0.016mg/ml，溶液純度＊A1cm660＝0.010＊根據(jù)用1cm液槽在660nm下測(cè)得的吸收。
實(shí)施例14-26在下列實(shí)施例中，按照我們選擇的制劑類型給出各種組合物(藥物組合物和美容組合物)的諸成分。具有等滲性透明質(zhì)酸鋅溶液的制備載于前面的實(shí)施例之中。這里所述的“注射用蒸餾水”是指在無(wú)菌條件下制備的二次蒸餾水。
Ⅰ.注射溶液實(shí)施例14-17的組合物用于經(jīng)皮給藥，而實(shí)施例18的組合物用于經(jīng)眼給藥。在這些實(shí)施例中使用實(shí)施例3所述的活性成分。
實(shí)施例14透明質(zhì)酸鋅活性成分2.0mg山梨糖醇48.3mg用注射用蒸餾水制備的水溶液最終容積1.0ml實(shí)施例15透明質(zhì)酸鋅活性成分5.0mg山梨糖醇42.8mg用注射用蒸餾水制備的水溶液最終容積1.0ml實(shí)施例16透明質(zhì)酸鋅活性成分2.0mg對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.05mg對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.5mg葡萄糖48.6mg用注射用蒸餾水制備的水溶液最終容積1.0ml
實(shí)施例17透明質(zhì)酸鋅活性成分5.0mg對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.05mg對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.5mg葡萄糖44.1mg用注射用蒸餾水制備的水溶液最終容積1.8ml實(shí)施例18透明質(zhì)酸鋅活性成分10.0mg山梨酸鉀1.0mg山梨糖醇41.0mg葡萄糖用注射用蒸餾水制備的水溶液最終容積1.0ml實(shí)施例20-28中所述的組合物主要用于治療皮膚病用和美容用。在這些實(shí)施例中采用實(shí)施例2所述的活性成分。
Ⅱ.局部用溶液實(shí)施例19透明質(zhì)酸鋅活性成分5.0mg山梨酸鉀1.0mg乙酸鈉24.6mg用蒸餾水制備的水溶液最終體積1.0ml實(shí)施例20透明質(zhì)酸鋅活性成分2.0mg山梨酸鉀1.0mg山梨糖醇48.3mg用蒸餾水制備的水溶液最終體積1.0ml
Ⅲ.局部用凝膠體實(shí)施例21透明質(zhì)酸鋅活性成分20.0mg丙烯酸聚合物200mg30%的氫氧化鈉50mg山梨酸鉀10mg蒸餾水至10.0ml實(shí)施例22透明質(zhì)酸鋅活性成分20.0mg丙烯酸聚合物50mg30%的氫氧化鈉40mg丙二醇1500mg山梨酸鉀10mg蒸餾水至10.0ml
Ⅳ.局部用霜?jiǎng)┖蛙浉鄬?shí)施例23透明質(zhì)酸鋅活性成分50mg山梨酸鉀10mg軟白蜂蠟125mg脫水山梨醇油酸酯150mg十六烷基十八烷醇840mg甘油單硬脂酸酯1100mg丙二醇4750mg蒸餾水至10克實(shí)施例24透明質(zhì)酸鈷活性成分50mg山梨酸鉀10mg軟白蜂蠟125mg脫水山梨醇油酸酯150mg十六烷基十八烷醇840mg
甘油單硬脂酸酯1100mg丙二醇4750mg蒸餾水至10克實(shí)施例25透明質(zhì)酸鋅活性成分50mg2-苯氧基乙醇100mg月桂基磺酸鈉100mg十六烷基十六烷酸酯400mg硬脂精400mg十八烷醇450mg十六烷醇450mg白凡士林500mg丙二醇550mg甘油600mg蒸餾水至10.0克實(shí)施例26透明質(zhì)酸鈷活性成分50mg2-苯氧基乙醇100mg月桂基磺酸鈉100mg
十六烷基十六烷酸酯400mg硬脂精400mg十八烷醇450mg十六烷醇450mg白凡士林500mg丙二醇550mg甘油600mg蒸餾水至10克實(shí)施例27透明質(zhì)酸鋅活性成分50mg微晶石蠟250mg丙二醇500mg山梨糖醇400mg羊毛蠟(乙?；?500mg白凡士林至10克
Ⅴ.治療膿性傷口和灼傷凈化和結(jié)瘢用組合物實(shí)施例28透明質(zhì)酸鋅活性成分10mg山梨酸鉀1.0mg親水膠體二氧化硅50mg山梨糖醇至1克
權(quán)利要求
1.去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸與周期表第四周期3d金屬離子的締合物(配合物)。
2.權(quán)利要求1所述的締合物，其中包括鋅離子作為3d金屬離子。
3.權(quán)利要求1所述的締合物，其中包括鈷離子作為3d金屬離子。
4.一種藥物組合物，其中包括有效量的由去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸和周期表第四周期3d金屬離子組成的締合物(配合物)作為有效成分，而且還混合有藥物工業(yè)通常采用的載體和/或添加劑，此外還選擇性含有一種或多種其它醫(yī)療活性成分。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中包括去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸和鋅離子的締合物作為活性成分。
6.一種美容組合物(有治療作用)，其中包含有效量的由去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸和周期表第四周期3d金屬離子組成的締合物(配合物)作為活性成分，以及其它選擇性添加劑。
7.一種美容組合物，其中包含去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸和鋅離子的締合物作為活性成分或載體。
8.一種制備去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸和周期表第四周期3d金屬離子的新穎締合物(配合物)的方法，其中包括a)向透明質(zhì)酸鈉水溶液或透明質(zhì)酸鹽的其它鹽(堿金屬鹽或堿土金屬鹽，任選銀鹽)中，加入含有等當(dāng)量鹽(優(yōu)選周期表第四周期3d金屬離子中一種金屬的氯化物)水溶液，或者b)將由透明質(zhì)酸和季銨鹽形成的處于水懸浮液中的締合物，溶解在一種復(fù)合溶劑中，所說(shuō)復(fù)合溶劑含有周期表第四周期3d金屬離子的水溶液和與水部分混溶的溶劑(優(yōu)選正丁醇)，然后-按已知方式用鏈烷醇或鏈烷酮沉淀由去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸與周期表第四周期3d金屬離子形成的締合物(配合物)，或者-從所說(shuō)溶液中分離所說(shuō)沉淀物，然后必要時(shí)-在溫和條件下干燥所說(shuō)沉淀物。
9.權(quán)利要求8所說(shuō)的方法，其中包括使用鋅離子作為3d金屬離子。
10.權(quán)利要求8所述的方法，其中包括使用鈷離子作為3d金屬離子。
11.一種直接制備含透明質(zhì)酸鋅的水組合物的方法，其中包括加入含有為達(dá)到等滲狀態(tài)所需當(dāng)量數(shù)或過(guò)量氯化鋅的水溶液。
12.一種制備藥物組合物的方法，其中包括將按實(shí)施例8所述的方法制備的、由去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸和周期表第四周期3d金屬離子組成的締合物作為活性成分，與一般使用的載體、稀釋劑和選擇性成分等滲化劑或其它添加劑加以混合或溶解，并且將其制成藥物組合物。
13.一種制備美容組合物(具有治療作用)的方法，其中包括將按權(quán)利要求8的方法制備的、由去質(zhì)子化的透明質(zhì)酸和周期表中3d金屬離子形成的締合物作為活性成分，與一般使用的載體和稀釋劑加以混合，并且將其與等滲化劑和/或其它添加劑任意混合或溶解，把它們轉(zhuǎn)變成美容組合物。
14.權(quán)利要求12或13所述的方法，其中包括使用鋅的締合物作為由周期表第四周期3d金屬離子形成的締合物。
15.權(quán)利要求12或13所述的方法，其中包括使用鈷的締合物作為由周期表第四周期3d金屬離子形成的締合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及去質(zhì)子化透明質(zhì)酸和周期表第四周期3d金屬離子的一些新穎的締合物(配合物)以及包含這些締合物(配合物)作為活性成分或載體的組合物；還涉及上述新穎的締合物(配合物)、包含這些締合物(配合物)作為活性成分的組合物(藥物組合物和美容組合物)的制備方法。在這些組合物中，最好使用透明質(zhì)酸鋅作為活性成分。
文檔編號(hào)A61K8/20GK1045394SQ9010090
公開日1990年9月19日 申請(qǐng)日期1990年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月24日
發(fā)明者科姆·博塔, 格澤·苔卡斯·納吉, 艾溫·瑞斯, 加諾斯·艾麗斯, 戴拉·斯特夫格, 艾瑟伯特·夸斯米利亞, 艾斯萬(wàn)·哥伯哈諾特, 艾斯萬(wàn)·瑞卡茨, 勇屋爾·科若里, 威科托拉·娃科吊尼 申請(qǐng)人:格德昂·理查德化學(xué)工廠股份公司