本發(fā)明屬于醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，主要用于引導(dǎo)組織再生，防止組織粘連。是一種醫(yī)用膜材料，可用于口腔科或神經(jīng)外科等醫(yī)學(xué)科室。

背景技術(shù)：

20世紀(jì)80年代興起的引導(dǎo)組織再生技術(shù)(guidedtissueregeneration，gtr)是指：用外科手術(shù)的方法在創(chuàng)傷區(qū)放置生物膜，隔離周圍的軟組織向骨面生長(zhǎng)，并形成一定空間誘導(dǎo)膜細(xì)胞冠向移動(dòng)并生長(zhǎng)分化，實(shí)現(xiàn)再生。

在成骨過(guò)程中具有成骨潛能的細(xì)胞會(huì)向缺損區(qū)生長(zhǎng)、移行的速度慢于周圍的結(jié)締組織，導(dǎo)致傷口無(wú)法愈合。gbr(guidedboneregeneration)引導(dǎo)骨再生技術(shù)，采用生物膜阻擋周圍軟組織的成纖維細(xì)胞進(jìn)入骨缺損區(qū)，保護(hù)缺損區(qū)具有成骨能力的血凝塊的穩(wěn)定，維護(hù)血塊充填的間隙，最終實(shí)現(xiàn)缺損區(qū)的骨修復(fù)再生。這項(xiàng)技術(shù)所需的膜要求既能夠生物降解可吸收，又能夠抵抗酶降解作用，在體內(nèi)維持6個(gè)月以上的隔離功能。

隔離膜材料是實(shí)現(xiàn)gtr或gbr技術(shù)的關(guān)鍵所在。由于同種異體組織這類材料來(lái)源有限，受到倫理道德的限制，且具有潛在感染病毒性疾病的可能，現(xiàn)已禁用。也有研究用生物材料制成人體腦膜的替代物人工硬腦膜(artificialduramater)。

成功的gtr/gbr技術(shù)有兩個(gè)臨床要點(diǎn)：①要保留獨(dú)立的組織再生空間。②要保證充足的時(shí)間。這兩個(gè)要點(diǎn)的實(shí)現(xiàn)都離不開可吸收生物修復(fù)膜。由此可見可吸收生物修復(fù)膜是gtr/gbr技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵部分。應(yīng)用于gtr/gbr的可吸收生物修復(fù)膜是一類具有選擇性阻擋軟組織進(jìn)入骨缺損空間，同時(shí)又不妨礙創(chuàng)口自然愈合的具有生物相容性的膜材料。

隔離膜材料大致分為不能吸收與能吸收兩類。

不能吸收的膜有金屬或高分子化合物，如金箔、銀箔、不銹鋼片、橡皮膜(最早被應(yīng)用)、塞路璐膜、尼龍、維尼龍、特氟龍(聚四氟乙烯)、滌綸硅橡膠膜。其缺點(diǎn)是不能被吸收，永久存在于體內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生不同程度的結(jié)締組織增生包裹。

能吸收的隔離膜，包括自體移植物和異體移植物，如顳肌筋膜、顱骨骨膜、纖維蛋白膜、尿囊膜、羊腸膜、死人的硬腦膜、牛肌腱的炮制膜，牛心包膜及胎膜。其缺點(diǎn)是會(huì)引起不同程度的炎性反應(yīng)和排斥反應(yīng)，造成纖維性變和與腦粘連。且牛心包、豬腹膜在去除異種蛋白抗原性時(shí)運(yùn)用的戊二醛會(huì)在材料中殘留部分醛基，不易徹底清除，從而阻礙細(xì)胞侵入植入組織，具有一定毒性，存在異物反應(yīng)可能。

中國(guó)專利cn201410671874公開了一種可吸收抗菌類骨結(jié)構(gòu)的引導(dǎo)組織再生膜的制作方法，它是由從牛身上獲取的新鮮牛心包膜與四肢管狀骨處理得到單層膜，再由兩種膜復(fù)合而來(lái)。反復(fù)凍融與表面活性處理獲得的脫細(xì)胞牛心包膠原纖維膜以及edta脫鈣與表面活性處理獲得脫礦脫細(xì)胞牛層狀骨膠原纖維膜，需完整保留兩種膜的結(jié)構(gòu)，兩種膜經(jīng)過(guò)電泳礦化獲得具有一定的硬度的類骨結(jié)構(gòu)礦化膠原纖維膜。浸入米諾環(huán)素溶液獲得抗菌類骨結(jié)構(gòu)的礦化膠原纖維膜。具有承載藥物與隔離的功能。這類膜的強(qiáng)度很好，但抗免疫性能差。

cn104857561a公開了一種高強(qiáng)度仿生膠原膜，通過(guò)梯度透析方法似的膠原蛋白分子重新便成為有序排列結(jié)構(gòu)，形成更一致、更廣泛的膠原纖維取向，從而提高材料的力學(xué)性能。

去端肽膠原蛋白可吸收引導(dǎo)組織再生膜，從分子層面上去除免疫排斥的緣由。只要去除端肽就認(rèn)為是去除了其免疫原性，被認(rèn)為是安全的。采用酶切技術(shù)，可吸收生物修復(fù)膜在生產(chǎn)過(guò)程中，去除了c、n兩端具有免疫原性的端肽，同時(shí)保留膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，獲得具有高度重復(fù)結(jié)構(gòu)的無(wú)免疫原性膠原蛋白單體。中國(guó)專利申請(qǐng)cn200410101597.5公開了利用膠原蛋白的這一特性制備的膜，特別柔軟，具有很好的貼服性，沒(méi)有免疫性，可作為可吸收的醫(yī)用隔離膜材料。使用牛肌腱組織為原料，經(jīng)過(guò)酶處理以及化學(xué)交聯(lián)，冷凍干燥得到一種具有孔隙、海綿狀醫(yī)用膠原蛋白材料，具有一定的強(qiáng)度，可以用作肌腱或是韌帶縫合手術(shù)后防止肌腱與韌帶粘結(jié)的可降解隔離膜。但是，這種材料的強(qiáng)度達(dá)不到支撐軟組織并創(chuàng)建骨組織生長(zhǎng)空間的程度，會(huì)塌陷。

中國(guó)專利申請(qǐng)cn201510725936.5公開了一種促進(jìn)p15植骨材料成骨可吸收的引導(dǎo)組織再生膜，由高分子膜材料與所承載的藥物組成。該膜的高分子膜材料是由制備的i型膠原蛋白乙酸溶液與硫酸軟骨素以及藥物按照一定的比例組成，并通過(guò)壓片制成膜，兩層薄膜中間噴涂膠原蛋白乙酸溶液與硫酸軟骨素的混合溶液，干燥，交聯(lián)經(jīng)過(guò)化學(xué)滅菌得到產(chǎn)品。具有屏障與承載藥物的功能。但是它的力學(xué)性能差，降解時(shí)間過(guò)短，吸水后的形變大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種組織再生膜，同時(shí)具備優(yōu)良的抗排斥免疫性能和優(yōu)良的力學(xué)性能，吸水后膨脹很小，避免引起組織腫脹，且能夠負(fù)載藥物，降解速度與組織生長(zhǎng)的速度匹配。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種高強(qiáng)度的組織再生膜的制備方法，該方法簡(jiǎn)單、環(huán)保，適合工業(yè)生產(chǎn)。

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明采取了如下解決方案：

一種復(fù)合的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白或膠原蛋白復(fù)合材料作為基體，其特征在于，增強(qiáng)體為交聯(lián)的膠原蛋白海綿或交聯(lián)的膠原蛋白復(fù)合海綿。

一種雙重交聯(lián)膠原蛋白組織再生膜，是在上述的基體和增強(qiáng)體復(fù)合完成后，再經(jīng)過(guò)一次物理或化學(xué)交聯(lián)處理，所得的產(chǎn)品即為雙重交聯(lián)膠原蛋白組織再生膜。

本發(fā)明的膜的一個(gè)表面是光滑面，另一個(gè)表面為粗糙面，所述的粗糙面來(lái)自于交聯(lián)的膠原蛋白海綿或交聯(lián)的膠原蛋白復(fù)合海綿的多孔結(jié)構(gòu)。

所述的復(fù)合的膠原蛋白組織再生膜，吸水后具有高的濕態(tài)抗張強(qiáng)度，能滿足醫(yī)用縫合的要求，濕態(tài)抗張強(qiáng)度為10mpa以上，進(jìn)一步的可以達(dá)到30mpa以上，更優(yōu)選40mpa以上。能滿足神經(jīng)外科腦部手術(shù)時(shí)的縫合要求，在膜被組織吸收之前不會(huì)破裂。

所述的膠原蛋白復(fù)合材料為膠原蛋白與殼聚糖、透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素中的一種或多種復(fù)合后的材料。

本發(fā)明還提供了復(fù)合的膠原蛋白組織再生膜的制備方法，包括如下步驟：

步驟s1：膠原蛋白凝膠的制備，哺乳動(dòng)物的皮毛或是肌腱脫脂，酶解，離心，鹽析、透析得到膠原蛋白凝膠；

步驟s1-1：取牛、馬、豬、羊、魚等哺乳動(dòng)物皮的皮膚或是肌腱，去除毛發(fā)、筋膜，切片，加入脫脂酶或有機(jī)溶劑，然后在純化水中漂洗1～24h，脫去油脂，滅活；所述的有機(jī)溶劑為甲氯、丙酮、乙醇、正丁醇中的一種，其中的甲氯為甲醇和氯仿按照體積比為1：3配制的溶劑。

步驟s1-2：將步驟s1-1所得脫脂溶液加入到ph值為1～5的酸溶液中，加入蛋白酶在0～25℃溫度下酶解1～96h，去除膠原蛋白的免疫性；

所述的酸溶液為：鹽酸、醋酸、檸檬酸、硫酸、磷酸中的一種或是多種制成的溶液。所述的蛋白酶為胃蛋白酶胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶等的一種或是多種。

步驟s1-3：將步驟s1-2所得的酶解溶液使用離心機(jī)離心，取上清液，使用堿溶液調(diào)節(jié)ph值為5～8，使用鹽溶液鹽析出可溶性去端肽膠原蛋白；所述的鹽溶液為以下鹽的溶液：硫酸鉀、氯化鉀、硝酸鉀、硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉的一種或多種；所述的堿溶液中的堿為naoh、koh中的一種或多種。

步驟s1-4：選擇透析袋，將步驟s1-3所得去端肽膠原蛋白溶液裝入透析袋中，將其密封進(jìn)行三層梯度透析，透析時(shí)間都為2-7天，溫度都為0～25℃，每天更換交換透析液的次數(shù)在1～10次，通過(guò)透析過(guò)程，分子重新變成有序排列的結(jié)構(gòu)，具有更一致、更廣泛的膠原纖維取向，透析得到去端肽膠原蛋白凝膠；所述的三層梯度透析的ph依次為ph1～4、ph4～6、中性溶液。

步驟s2：膠原蛋白海綿的制備，使用步驟s1-4所得去端肽膠原蛋白凝膠用酸溶液配制，平鋪在模具中，冷凍干燥成海綿，物理或是化學(xué)交聯(lián)成一重的海綿；

步驟s2-1：配液，使用鹽酸或是稀鹽酸為溶劑，配制膠原蛋白溶液，或是膠原蛋白與生物高分子復(fù)合溶液；其中的生物高分子可以是殼聚糖、透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素中的一種或是多種。

步驟s2-2：灌裝，并冷凍干燥。將步驟s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展開鋪平，然后冷凍干燥成膠原蛋白海綿或是復(fù)合膠原蛋白海綿；

上述步驟中的冷凍條件為：冷凍溫度為-80℃～-20℃，凍干時(shí)間為15～36h，模具底部可以帶有一定的紋路。

步驟s2-3：交聯(lián)，采用物理或是化學(xué)的方法對(duì)步驟s2-2所得的海綿進(jìn)行交聯(lián)，得到一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿；

上述步驟中的物理交聯(lián)方法為：紫外輻射、熱脫氫法、輻照滅菌等，化學(xué)交聯(lián)方法為：采用碳化二亞胺、二胺、環(huán)氧化合物、羥基琥珀酰亞胺、二苯基磷酸鹽(dppa)、戊二醛、甲醛、乙醛酸、京尼平進(jìn)行交聯(lián)。

步驟s3：雙重交聯(lián)膠原蛋白骨組織再生膜的制備，海綿浸入膠原蛋白凝膠，干燥，物理或是化學(xué)交聯(lián)，得到雙重交聯(lián)膠原蛋白骨組織再生膜；

步驟s3-1：灌模，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿浸入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，干燥成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿；

上述步驟中的干燥條件為：溫度為0～70℃，時(shí)間為8～96h。

步驟s3-2：交聯(lián)，采用物理或是化學(xué)的方法進(jìn)行交聯(lián)，得到雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜。

如果步驟s2-3與步驟s3-2中的任何一步使用了化學(xué)交聯(lián)，那么還有步驟s3-3，使用溶液脫洗程序去除交聯(lián)劑的殘留，脫洗程序中使用脫洗液為純化水、生理鹽水、ph為中性的磷酸鹽緩沖液、乙醇中的一種。

本發(fā)明的復(fù)合膠原蛋白組織再生膜具有粗糙面與光滑面，其中的粗糙面，用于誘導(dǎo)骨再生，是成骨細(xì)胞的粘附和骨的沉積附著的載體，使具有骨生成能力的細(xì)胞先長(zhǎng)入缺損區(qū)，進(jìn)而增值分化成骨細(xì)胞。光滑面用于阻隔結(jié)締組織細(xì)胞遷移，阻止結(jié)締組織進(jìn)入骨缺損區(qū)，起到隔離作用。

復(fù)合膠原蛋白組織再生膜的機(jī)械強(qiáng)度佳，濕態(tài)抗張強(qiáng)度可達(dá)40mpa，可以對(duì)抗來(lái)自軟組織的壓力，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞阻擋于缺損外，使病損區(qū)與周圍組織隔離使膜下血凝塊內(nèi)的血小板及纖維蛋白得到保護(hù)，為生長(zhǎng)因子釋放、聚集與分布提供有力的環(huán)境，保證了骨組織的再生。

復(fù)合膠原蛋白組織再生膜的主要成分為ⅰ型膠原蛋白具有特殊的緊密三股螺旋結(jié)構(gòu)，不能被一般蛋白酶水解，只有膠原蛋白酶作用于膠原蛋白分子的一定位點(diǎn)，才能使其斷裂變性，膠原肽鏈的斷裂，造成其螺旋結(jié)構(gòu)的破壞。這樣膠原就可以被蛋白酶徹底水解。膠原蛋白酶成為體內(nèi)膠原降解的關(guān)鍵所在。脊椎動(dòng)物體內(nèi)的許多上皮組織如皮膚傷口、牙齲、角膜、以及中耳炎引起的膽脂瘤中都含有膠原酶，骨和子宮中也存在膠原酶。許多間充質(zhì)細(xì)胞衍生的組織，如關(guān)節(jié)滑膜、粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也都能產(chǎn)生膠原酶，當(dāng)傷口愈合時(shí)，再生表皮組織及間充質(zhì)組織都具有較強(qiáng)的膠原分解能力，為上皮再生創(chuàng)造了條件。

本發(fā)明的組織再生膜的吸收降解時(shí)間為四個(gè)月左右，與人體骨組織復(fù)建的時(shí)間基本一致，在骨組織生長(zhǎng)完成前，能起到隔離軟組織與骨組織的作用，等到骨組織生長(zhǎng)完成后，組織再生膜被吸收完畢，隔離作用消失，骨組織和其周圍組織的關(guān)系恢復(fù)到患病前的健康狀態(tài)。

本發(fā)明的組織再生膜可以靈活使用其來(lái)承載藥物，方便實(shí)惠。

本發(fā)明的組織再生膜具有不超過(guò)200％的膨脹率，用于人體后，可以有效避免組織腫脹，減少異物感，降低感染發(fā)生的幾率。

本發(fā)明的組織再生膜通過(guò)高分子纖維與膠原蛋白進(jìn)一步復(fù)合，可進(jìn)一步提高強(qiáng)度。

纖維網(wǎng)復(fù)合組織再生膜，可以用作生物疝補(bǔ)片，修補(bǔ)腹腔溝疝，實(shí)現(xiàn)疝補(bǔ)片與人體組織的無(wú)縫結(jié)合，有效的減輕免疫作用。

纖維網(wǎng)復(fù)合組織再生膜，可以用作傷口敷料，引導(dǎo)組織愈合，吸取組織殘液，保護(hù)傷口。纖維網(wǎng)復(fù)合組織再生膜，纖維網(wǎng)可以選擇與膠原蛋白海綿的粗糙面復(fù)合，保留光滑面。反之選擇與膠原蛋白海綿的光滑面復(fù)合，保留粗糙面。二者的功效是有區(qū)別的，保留的光滑面具有提供肌肉組織平滑運(yùn)動(dòng)時(shí)不會(huì)受阻，為肌肉組織細(xì)胞生長(zhǎng)附著提供平臺(tái)。粗糙面為骨細(xì)胞的生長(zhǎng)提供生長(zhǎng)的平臺(tái)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例5所得的雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜的光滑面。

圖2為實(shí)施例5所得的雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜的粗糙面。

圖3為實(shí)施例5所得的雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜的斷面sem圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

一種雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，交聯(lián)的膠原蛋白海綿為增強(qiáng)體。二者復(fù)合后，再進(jìn)行一次交聯(lián)。其制備方法為：

步驟s1：膠原蛋白凝膠的制備：

步驟s1-1：取豬皮，去除毛和筋膜，切片，加入脫脂酶，然后在純化水中漂洗1h，脫去油脂，滅活；

步驟s1-2：將步驟s1-1所得脫脂溶液加入到ph值為4的檸檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃溫度下酶解20h；

步驟s1-3：將步驟s1-2所得的酶解溶液使用離心機(jī)離心，取上清液，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為6，使用硫酸鉀溶液鹽析出可溶性去端肽膠原蛋白；

步驟s1-4：將步驟s1-3所得去端肽膠原蛋白溶液裝入透析袋中，將其密封進(jìn)行三層梯度透析，透析時(shí)間為2天，溫度都為25℃，每天更換交換透析液的次數(shù)在3次，得到去端肽膠原蛋白凝膠；所述的三層梯度透析的ph依次為ph2、ph3、中性溶液。

步驟s2：膠原蛋白海綿的制備：

步驟s2-1：配液，使用鹽酸為溶劑，步驟s1-4中的去端肽膠原蛋白為溶質(zhì)，配制膠原蛋白溶液；

步驟s2-2：灌裝，并冷凍干燥，將步驟s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展開鋪平，然后冷凍干燥成膠原蛋白海綿或，冷凍溫度為-80℃，凍干時(shí)間為15h；

步驟s2-3：交聯(lián)，采用熱脫氫法對(duì)步驟s2-2所得的海綿進(jìn)行交聯(lián)，得到一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿；

步驟s3：雙重交聯(lián)膠原蛋白骨組織再生膜的制備：

步驟s3-1：灌模，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿浸入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在70℃干燥8h成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿；

步驟s3-2：交聯(lián)，采用紫外輻射法進(jìn)行交聯(lián)，得到雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜。

對(duì)所得試樣進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)施例2：

一種復(fù)合的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，增強(qiáng)體為交聯(lián)的膠原蛋白海綿。其制備方法為：

步驟s1：膠原蛋白凝膠的制備：

步驟s1-1:取豬皮，去除毛和筋膜，切片，加入脫脂酶，然后在純化水中漂洗24h，脫去油脂，滅活；

步驟s1-2：將步驟s1-1所得脫脂溶液加入到ph值為5的檸檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃溫度下酶解20h；

步驟s1-3：將步驟s1-2所得的酶解溶液使用離心機(jī)離心，取上清液，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為6，使用硫酸鉀溶液鹽析出可溶性去端肽膠原蛋白；

步驟s1-4：將步驟s1-3所得去端肽膠原蛋白溶液裝入透析袋中，將其密封進(jìn)行三層梯度透析，透析時(shí)間為3天，溫度都為25℃，每天更換交換透析液的次數(shù)在3次，得到去端肽膠原蛋白凝膠；所述的三層梯度透析的ph依次為ph1、ph4、中性溶液。

步驟s2：膠原蛋白海綿的制備：

步驟s2-1：配液，使用鹽酸為溶劑，步驟s1-4中的去端肽膠原蛋白為溶質(zhì)，配制膠原蛋白溶液；

步驟s2-2：灌裝，并冷凍干燥，將步驟s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展開鋪平，然后冷凍干燥成膠原蛋白海綿或，冷凍溫度為-20℃，凍干時(shí)間為36h；

步驟s2-3：交聯(lián)，采用輻照滅菌法對(duì)步驟s2-2所得的海綿進(jìn)行交聯(lián)，得到一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿；

步驟s3：復(fù)合膠原蛋白組織再生膜的制備：

灌模，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿浸入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在30℃干燥50h成膜，得到復(fù)合的膠原蛋白組織再生膜，其基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白，增強(qiáng)體是一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿。

對(duì)所得試樣進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)施例3：

一種雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，交聯(lián)的膠原蛋白海綿為增強(qiáng)體。二者復(fù)合后，再進(jìn)行一次交聯(lián)。其制備方法為：。

步驟s1：膠原蛋白凝膠的制備：

步驟s1-1:取牛皮，去除毛和筋膜，切片，加入脫脂酶，然后在純化水中漂洗12h，脫去油脂，滅活；

步驟s1-2：將步驟s1-1所得脫脂溶液加入到ph值為5的檸檬酸溶液中，加入枯草桿菌蛋白酶，然后在25℃溫度下酶解96h；

步驟s1-3：將步驟s1-2所得的酶解溶液使用離心機(jī)離心，取上清液，使用氫氧化鈉和氫氧化鉀的混合溶液調(diào)節(jié)ph值為8，使用硫酸鉀和硝酸鉀的混合溶液鹽析出可溶性去端肽膠原蛋白；

步驟s1-4：將步驟s1-3所得去端肽膠原蛋白溶液裝入透析袋中，將其密封進(jìn)行三層梯度透析，透析時(shí)間為7天，溫度都為25℃，每天更換交換透析液的次數(shù)在3次，得到去端肽膠原蛋白凝膠；所述的三層梯度透析的ph依次為ph4、ph6、中性溶液。

步驟s2：膠原蛋白海綿的制備：

步驟s2-1：配液，使用鹽酸為溶劑，步驟s1-4中的去端肽膠原蛋白為溶質(zhì)，配制膠原蛋白溶液；

步驟s2-2：灌裝，并冷凍干燥，將步驟s2-1所得的溶液注入模具，模具底面具有一定的紋路，展開鋪平，然后冷凍干燥成膠原蛋白海綿或，冷凍溫度為-60℃，凍干時(shí)間為20h；

步驟s2-3：交聯(lián)，采用紫外輻射法對(duì)步驟s2-2所得的海綿進(jìn)行交聯(lián)，得到一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿；

步驟s3：膠原蛋白復(fù)合組織再生膜的制備：

步驟s3-1：灌模，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿浸入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在10℃干燥96h成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿。

步驟s3-2：交聯(lián)，采用紫外輻射法進(jìn)行交聯(lián)，得到雙重交聯(lián)的膠原蛋白膜。

對(duì)所得試樣進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)施例4：

一種雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，交聯(lián)的膠原蛋白海綿為增強(qiáng)體。二者復(fù)合后，再進(jìn)行一次交聯(lián)。其制備方法為：

步驟s1：膠原蛋白凝膠的制備：

步驟s1-1:取豬皮，去除毛和筋膜，切片，加入脫脂酶，然后在純化水中漂洗1～24h，脫去油脂，滅活；

步驟s1-2：將步驟s1-1所得脫脂溶液加入到ph值為4的檸檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃溫度下酶解20h；

步驟s1-3：將步驟s1-2所得的酶解溶液使用離心機(jī)離心，取上清液，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為6，使用硫酸鉀溶液鹽析出可溶性去端肽膠原蛋白；

步驟s1-4：將步驟s1-3所得去端肽膠原蛋白溶液裝入透析袋中，將其密封進(jìn)行三層梯度透析，透析時(shí)間為2天，溫度都為25℃，每天更換交換透析液的次數(shù)在3次，得到去端肽膠原蛋白凝膠；所述的三層梯度透析的ph依次為ph2、ph3、中性溶液。

步驟s2：膠原蛋白海綿的制備：

步驟s2-1：配液，使用鹽酸為溶劑，步驟s1-4中的去端肽膠原蛋白為溶質(zhì)，配制膠原蛋白溶液；

步驟s2-2：灌裝，并冷凍干燥，將步驟s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展開鋪平，然后冷凍干燥成膠原蛋白海綿或，冷凍溫度為-40℃，凍干時(shí)間為25h；

步驟s2-3：交聯(lián)，采用紫外輻射法對(duì)步驟s2-2所得的海綿進(jìn)行交聯(lián)，得到一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿；

步驟s3：雙重交聯(lián)膠原蛋白骨組織再生膜的制備：

步驟s3-1：灌模，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿浸入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在70℃干燥20h成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿；

步驟s3-2：交聯(lián)，采用紫外輻射法進(jìn)行交聯(lián)，得到雙重交聯(lián)的膠原蛋白膜。

對(duì)所得試樣進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)施例5：

一種雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，交聯(lián)的膠原蛋白和殼聚糖復(fù)合海綿為增強(qiáng)體。二者復(fù)合后，再進(jìn)行一次交聯(lián)。其制備方法為：

步驟s1：膠原蛋白凝膠的制備：

步驟s1-1:取豬皮，去除毛和筋膜，切片，加入脫脂酶，然后在純化水中漂洗1～24h，脫去油脂，滅活；

步驟s1-2：將步驟s1-1所得脫脂溶液加入到ph值為4的檸檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃溫度下酶解20h；

步驟s1-3：將步驟s1-2所得的酶解溶液使用離心機(jī)離心，取上清液，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為6，使用硫酸鉀溶液鹽析出可溶性去端肽膠原蛋白；

步驟s1-4：將步驟s1-3所得去端肽膠原蛋白溶液裝入透析袋中，將其密封進(jìn)行三層梯度透析，透析時(shí)間為2天，溫度都為25℃，每天更換交換透析液的次數(shù)在3次，得到去端肽膠原蛋白凝膠；所述的三層梯度透析的ph依次為ph2、ph3、中性溶液。

步驟s2：膠原蛋白海綿的制備：

步驟s2-1：配液，使用鹽酸為溶劑，步驟s1-4中的去端肽膠原蛋白和殼聚糖為溶質(zhì)，配制膠原蛋白高分子復(fù)合溶液；

步驟s2-2：灌裝，并冷凍干燥。將步驟s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展開鋪平，然后冷凍干燥成膠原蛋白海綿或，冷凍溫度為-80℃～-20℃，凍干時(shí)間為15～36h；

步驟s2-3：交聯(lián)，采用二苯基磷酸鹽對(duì)步驟s2-2所得的海綿進(jìn)行交聯(lián)，得到一重交聯(lián)的膠原復(fù)合蛋白海綿；

步驟s2-4：使用溶液脫洗程序去除交聯(lián)劑的殘留，脫洗程序中使用脫洗液為中性的磷酸鹽緩沖液。

步驟s3：雙重交聯(lián)膠原蛋白骨組織再生膜的制備：

步驟s3-1：灌模，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原復(fù)合蛋白海綿浸入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在70℃干燥30h成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿；

步驟s3-2：交聯(lián)，采用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，得到雙重交聯(lián)的膠原蛋白膜。

步驟s3-3，使用溶液脫洗程序去除交聯(lián)劑的殘留，脫洗程序中使用脫洗液為純化水。

實(shí)施例6：

一種雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，交聯(lián)的膠原蛋白海綿與蠶絲纖維網(wǎng)為增強(qiáng)體。三者復(fù)合后，再進(jìn)行一次交聯(lián)。其制備方法如所述的實(shí)施實(shí)例3，其特征在于所述的實(shí)施實(shí)例3中步驟s3-1膠原蛋白復(fù)合組織再生膜的制備：

步驟s3-1：灌模，將單層蠶絲纖維網(wǎng)平鋪于模具底部，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿浸入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在10℃干燥96h成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是蠶絲纖維網(wǎng)與一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿。

步驟s3-1中所述的蠶絲纖維網(wǎng)是厚度為0.06mm、長(zhǎng)寬大小與膠原蛋白海綿一致的水刺布。

步驟s3-1中所述的蠶絲纖維網(wǎng)覆蓋海綿的粗糙面。

實(shí)施例7：

一種雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，交聯(lián)的膠原蛋白海綿與尼龍纖維網(wǎng)為增強(qiáng)體。其制備方法如所述的實(shí)施實(shí)例6。

步驟s3-1：灌模，將單層尼龍纖維網(wǎng)平鋪于模具底部，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿的粗糙面向下浸入模具，在膠原蛋白海綿的光滑面再平鋪單層尼龍纖維網(wǎng)，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在10℃干燥96h成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是尼龍纖維網(wǎng)與一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿。

步驟s3-1中所述的尼龍纖維網(wǎng)是厚度為0.06mm的無(wú)紡布。

步驟s3-1中所述的尼龍纖維網(wǎng)是長(zhǎng)寬大小與膠原蛋白海綿一致的。

實(shí)施例8：

一種雙重交聯(lián)的膠原蛋白組織再生膜，由膠原蛋白作為基體，交聯(lián)的膠原蛋白海綿與聚丙烯纖維網(wǎng)為增強(qiáng)體。其制備方法如所述的實(shí)施實(shí)例6。

步驟s3-1：灌模，將步驟s2-1所得的膠原蛋白溶液注入模具中，將步驟s2-3所得的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合蛋白海綿包覆上聚丙烯纖維網(wǎng)，放入模具，待吸滿溶液之后，取出平鋪在平板上，在10℃干燥96h成膜，基體材料是非交聯(lián)的膠原蛋白溶液，增強(qiáng)體是尼龍纖維網(wǎng)與一重交聯(lián)的膠原蛋白海綿或是膠原復(fù)合海綿。

步驟s3-1中所述的聚丙烯纖維網(wǎng)是厚度為0.08mm取向交叉編織纖維網(wǎng)。

步驟s3-1中所述的聚丙烯纖維網(wǎng)是長(zhǎng)寬略大于膠原蛋白海綿。

對(duì)所得試樣進(jìn)行測(cè)試。

上述實(shí)施例1-8的產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)量的方法如下：

膜的厚度用游標(biāo)卡尺測(cè)量，對(duì)同一張膜，測(cè)量5個(gè)不同位置的厚度，取平均值作為該膜的厚度值。

膜的膨脹率：采用干態(tài)膜用純水或生理鹽水浸泡10分鐘后測(cè)量的厚度除以干態(tài)膜的厚度，所得的比值即為膨脹率。

膜的吸收降解時(shí)間，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb16886的測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)試。

膜的濕態(tài)抗張強(qiáng)度采用拉力測(cè)試機(jī)進(jìn)行測(cè)試，對(duì)寬為1cm的試樣用生理鹽水浸泡10分鐘，充分膨脹后，進(jìn)行測(cè)試。記錄斷裂時(shí)的力與膜的斷裂橫截面積，二者的比值即為濕態(tài)抗張強(qiáng)度。

實(shí)施例1-8的產(chǎn)品的尺寸和性能數(shù)據(jù)見表1。

表1實(shí)施例1-5的產(chǎn)品尺寸和性能數(shù)據(jù)表