一種角蛋白／絲素蛋白共混膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種角蛋白/絲素蛋白雙層膜及其制備方法，特別涉及一種以角蛋白、絲素蛋白為主要原料，制備兼具致密與多孔的雙層結(jié)構(gòu)的復(fù)合蛋白膜的方法，所制備的材料可應(yīng)用于組織工程材料、人造皮膚、口腔種植修復(fù)或藥物緩釋等方面。
【背景技術(shù)】
[0002]三維多孔的細(xì)胞支架材料是生物醫(yī)學(xué)工程的一個(gè)重要方向，能與組織活體細(xì)胞結(jié)合并植入生物體，且具備一定功能的支架材料在科學(xué)研究與臨床應(yīng)用中均具有重要的學(xué)術(shù)意義和實(shí)用價(jià)值。在現(xiàn)有的組織工程支架材料的研究中，大多是針對(duì)骨、血管、神經(jīng)等人工器官的三維支架結(jié)構(gòu)，而對(duì)滿足臨床應(yīng)用中所需的膜材料研究則并不多。
[0003]中國(guó)申請(qǐng)專利“一種生物醫(yī)用材料及其制備方法和用途”(CN1544097A)中，采用膠原蛋白或明膠、葡甘聚糖、硫酸軟骨素或殼聚糖，經(jīng)攪拌、脫泡、改性、冷凍干燥等工藝流程后制成l_3mm的海綿狀多孔膜。
[0004]中國(guó)申請(qǐng)專利“一種載bFGF魚膠原基復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用”(CN104758983A)中，采用魚膠原蛋白與殼聚糖經(jīng)冷凍干燥制備成復(fù)合膜，再經(jīng)硫酸軟骨素交聯(lián)后，引入載bFGF的PLGA微球，反復(fù)冷凍干燥并滅菌后得到無菌的載bFGF魚膠原基多孔復(fù)合材料。
[0005]由此可見，在現(xiàn)有技術(shù)中，多孔膜材料的制備所采用的天然材料有膠原蛋白、明膠、纖維素等，但這些材料中存在著或多或少的缺陷，如生物相容性不好，提取工藝復(fù)雜，成本過高等。因此更多的研究致力于采用理想的天然材料進(jìn)行替代。
[0006]角蛋白作為一種天然的蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性，在人發(fā)、羊毛等毛羽中存在的角蛋白的氨基酸序列中均存在促進(jìn)骨細(xì)胞粘附的RGD (精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸)三肽序列，對(duì)細(xì)胞有很好的親和性和吸附性，還能優(yōu)化骨組織的生長(zhǎng)，因此角蛋白在作為生物醫(yī)用材料方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。
[0007]絲素蛋白是從天然蠶絲中提取的高分子纖維蛋白，其含量約占蠶絲的70?80%。其氨基酸組成中的一部分為人體必需氨基酸，對(duì)人體無毒無副作用，具有優(yōu)異的力學(xué)性能，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)絲素蛋白的應(yīng)用研究也早已從紡織領(lǐng)域向多個(gè)領(lǐng)域拓寬，尤其在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的研究日趨廣泛和深入。
[0008]國(guó)內(nèi)外對(duì)于采用這兩種天然蛋白制得多孔膜的相關(guān)研究如下:
[0009]中國(guó)申請(qǐng)專利“一種冷凍制備角蛋白多孔膜的工藝”(CN102585277B)中，采用冷凍干燥工藝對(duì)羊毛角蛋白溶液直接進(jìn)行凍干制得角蛋白多孔膜。該角蛋白多孔膜厚度均勻，孔洞分散性好，但單一組分的角蛋白多孔膜機(jī)械性能較差。
[0010]中國(guó)申請(qǐng)專利“一種多孔絲素膜及其制備方法”(CN1260363A)中，以蠶絲為主要原料，對(duì)已濃縮的絲素蛋白與添加劑、交聯(lián)劑的混合溶液進(jìn)行冷凍干燥，制成多孔絲素膜。該絲素膜具有較強(qiáng)的機(jī)械性能和良好的生物相容性，但整張膜的手感偏硬，影響了臨床應(yīng)用的可操作性。
[0011]因此一種既有一定柔韌性，又有良好的生物相容性與細(xì)胞活性的蛋白多孔膜及其獲得方法是一個(gè)亟待人們解決的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于針對(duì)已有多孔膜材料的不足，提供一種具有一定強(qiáng)度和柔韌性、可任意彎折、生物相容性良好、可生物降解的兼具致密和多孔雙層結(jié)構(gòu)的角蛋白/絲素蛋白共混膜及其制備方法。
[0013]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0014]本發(fā)明所述的共混膜采用角蛋白和絲素蛋白為主要原材料，以一定濃度的角蛋白與絲素蛋白按不同的體積百分比進(jìn)行混合并制備成凝膠，再通過低溫冷凍、真空干燥的方法獲得。成形后的共混膜為呈多孔結(jié)構(gòu)的多孔膜，其柔而韌，厚度均勻，厚度可控制在ΙΟμπι?5mm之間，膜內(nèi)部的孔與孔之間相互連通，平均孔徑為30?400μπι，孔隙率為10?90%。
[0015]本發(fā)明所述的共混膜的制備方法，步驟如下:
[0016](I)使用還原劑的濃度為0.0lM?0.1M對(duì)剪成0.5?Icm的小段動(dòng)物毛羽進(jìn)行溶解后經(jīng)過濾、透析、濃縮工藝得到角蛋白溶液;對(duì)天然蠶絲進(jìn)行脫膠、溶解、透析、過濾、濃縮，得到絲素蛋白水溶液；
[0017](2)取角蛋白溶液和絲素蛋白溶液，按一定的體積比例配置混合溶液，靜置脫泡后，注入具有特定形狀和尺寸的模具中，在恒溫恒濕條件下形成角蛋白/絲素蛋白復(fù)合凝膠；
[0018](3)將步驟(2)所得到的蛋白復(fù)合凝膠在-20?_80°C的低溫下預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間為4?24小時(shí)，然后在低溫條件下真空干燥形成多孔狀的角蛋白/絲素蛋白共混膜。
[0019]優(yōu)選地，步驟(I)制備所得的角蛋白溶液和絲素蛋白溶液的濃度為I?20%。
[0020]優(yōu)選地，步驟(2)中所述的混合溶液中絲素蛋白的體積比例為5?95%，形成多孔狀的角蛋白/絲素蛋白共混膜的恒溫恒濕條件如下:溫度為20?70°C，濕度為30?70%。
[0021]優(yōu)選地，步驟(2)中為加速溶液-凝膠狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，可加入一定量的添加劑，該添加劑主要為醇類，如乙醇、丙醇等，濃度為I?20%。
[0022]優(yōu)選地，步驟(3)中所述復(fù)合凝膠的凍干條件如下:溫度-90?_105°C，設(shè)備內(nèi)氣壓為I?lObar，凍干時(shí)間為24?48小時(shí)。
[0023]作為本發(fā)明的一種改進(jìn)，所述共混膜還可以是兼具多孔膜與致密膜的雙層結(jié)構(gòu)，即在所述多孔膜上還可以有一層采用流延法制得的透明、無孔狀致密膜:所述多孔膜內(nèi)部連通的多孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞的長(zhǎng)入，為各種細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支架，加速組織和器官的修復(fù);所述致密膜在引導(dǎo)組織再生生長(zhǎng)的過程中發(fā)揮隔膜屏障作用，保證病缺損組織再生所需要的空間，該雙層膜可應(yīng)用于組織工程材料、人工骨材、人造皮膚、口腔種植修復(fù)、器官內(nèi)壁修復(fù)等生物材料方面。
[0024]本發(fā)明所述的兼具多孔膜與致密膜的雙層共混膜的制備方法如下:
[0025](I)對(duì)剪成0.5?Icm的小段動(dòng)物毛羽進(jìn)行溶解、過濾、透析、濃縮，得到角蛋白水溶液，其中經(jīng)適量還原劑溶解得到角蛋白I溶液，經(jīng)過量的還原劑溶解得到角蛋白Π溶液;對(duì)天然蠶絲進(jìn)行脫膠、溶解、透析、過濾、濃縮，得到絲素蛋白水溶液；
[0026](2)取角蛋白I溶液和絲素蛋白溶液，按一定的體積比例配置混合溶液，靜置脫泡后，注入具有特定形狀和尺寸的模具中，采用流延法在恒溫恒濕條件下形成致密層薄膜；
[0027](3)取角蛋白Π溶液和絲素蛋白溶液，按一定的體積比例配置混合溶液，加入一定量的添加劑加速蛋白成膠，緩慢鋪于步驟(2)所述的致密層薄膜上，恒溫恒濕條件下形成角蛋白/絲素蛋白復(fù)合凝膠；
[0028](4)將步驟(3)得到的復(fù)合凝膠在-20?_80°C的低溫下預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間為4?24小時(shí)，然后在低溫真空條件下凍干形成角蛋白/絲素蛋白雙層膜。
[0029]本發(fā)明所述兩種方案的制備方法中:
[0030]優(yōu)選地，所述的動(dòng)物毛羽優(yōu)選為人發(fā)、羊毛、羊絨、駝毛或兔毛，所述的蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、天蠶絲中的一種或幾種。
[O O31 ]優(yōu)選地，制備致密層所用的角蛋白I所使用還原劑的濃度為0.0IM?0.1M，制備多孔層所用的角蛋白Π所使用還原劑的濃度為0.2M?2M，制備所得的角蛋白溶液和絲素蛋白溶液的濃度為I?20 %。
[0032]優(yōu)選地，所述混合溶液中，所述絲素蛋白的體積比例為5?95%，形成致密膜與凝膠的恒溫恒濕條件如下:溫度為20?70°C，濕度為30?70%。
[0033]優(yōu)選地，為加速溶液-凝膠狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，可加入一定量的添加劑，該添加劑主要為醇類，如乙醇、丙三醇、聚乙二醇等，濃度為I?20%。
[0034]優(yōu)選地，共混膜的凍干條件如下:溫度-90?_105°C，設(shè)備內(nèi)氣壓為I?1bar，凍干時(shí)間為24?48小時(shí)。
[0035]采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明與【背景技術(shù)】相比具有以下優(yōu)勢(shì)和效果:
[0036](I)本發(fā)明采用天然絲素蛋白和角蛋白作為原料，所得的復(fù)合膜兼?zhèn)鋬煞N天然蛋白的優(yōu)勢(shì)，比其中任一種蛋白單獨(dú)成膜具有更優(yōu)異的機(jī)械性能和生物相容性；
[0037](2)本發(fā)明中角蛋白的加入改善了純的絲素蛋白成膜后偏硬的手感，提高了所得產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中的可操作性；
[0038](3)本發(fā)明利用絲素蛋白成膠的機(jī)制形成角蛋白/絲素蛋白復(fù)合凝膠的中間體，再經(jīng)凍干成膜，可有效的控制所得多孔膜的厚度和形狀，避免了溶液平鋪凍干過程中易出現(xiàn)的噴瓶現(xiàn)象或成膜不均勻的缺陷；
[0039](4)本發(fā)明采用溶液-凝膠-低溫預(yù)凍-真空干燥的制備工藝，可控制所得多孔膜的各種結(jié)構(gòu)參數(shù)及物理化學(xué)性質(zhì)，簡(jiǎn)單有效，易于產(chǎn)業(yè)化；
[0040](5)本發(fā)明所述的雙層膜兼?zhèn)渲旅軐优c多孔層，在臨床應(yīng)用上發(fā)揮更有效的作用。
【附圖說明】
[0041]圖1為實(shí)施例一中角蛋白/絲素蛋白復(fù)合多孔膜的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖片；
[0042]圖2為實(shí)施例一中角蛋白/絲素蛋白復(fù)合多孔膜內(nèi)部孔徑分布曲線；
[0043]圖3為實(shí)施例二中角蛋白/絲素蛋白雙層膜的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖片；
[0044]圖4為實(shí)施例二中角蛋白/絲素蛋白雙層膜的拉伸應(yīng)力應(yīng)變曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0045]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0046