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一種膠原蛋白膜的制備方法

文檔序號:1738085閱讀:728來源:國知局
專利名稱:一種膠原蛋白膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種膠原蛋白膜的制備方法和用途。
背景技術(shù)
膠原是一種天然蛋白質(zhì),廣泛存在于動物的皮膚、骨、軟骨、牙齒、肌腱韌帶和血管中,是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),起著支撐器官、保護肌體的功能。膠原一般是白色透明、無分支的原纖維,主要存在于生皮中,其次存在于骨頭中。膠原蛋白家庭包括19種膠原蛋白及10種以上膠原樣蛋白,它們由三條左手螺旋的多肽鏈纏繞、右旋、形成繩索樣右手超螺旋結(jié)構(gòu),其I級結(jié)構(gòu)的共同特點為每間隔兩個氨基酸存在一個甘氨酸,Y-Gly-X-Y—序列中,X及Y位置分別為脯氨酸及羥脯氨酸,以限制多肽鏈旋轉(zhuǎn),三螺旋結(jié)構(gòu)常有 4-羥脯氨酸,產(chǎn)生氫鍵及氧橋,使結(jié)構(gòu)相對牢固,通常還有球狀序列插入,使膠原分子更有彈性。膠原具有很強的生物活性及生物功能,能參與細胞的遷移、分化和增殖,使骨、腰、軟骨和皮膚具有一定的機械強度,膠原因其弱的抗原性和良好的生物相容性,在燒傷、創(chuàng)傷、 眼角膜疾病、美容、矯形、硬組織修復(fù)、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域用途廣泛。
膠原蛋白的制備方法眾多,如,吹膜技術(shù)、凍干技術(shù)、電流體動力學(xué)技術(shù)等。隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展,采用電流體動力學(xué)(Electrohydrodynamics)射流技術(shù)成為研究熱點之一,電流體動力學(xué)射流過程中,在噴頭與接收裝置之間建立一個高壓靜電場,當(dāng)電場強度超過臨界值時,噴頭處流出的聚合物溶液或熔體在電場力作用下克服自身的表面張力形成一股帶電噴射細流。由于靜電排斥作用,帶電細流發(fā)生高速彎曲或鞭動,隨著溶劑揮發(fā)或熔體冷卻,最終落在接收裝置上形成纖維膜或粒子簇。根據(jù)產(chǎn)物形貌的區(qū)別,可將靜電射流分為靜電紡絲(簡稱電紡,Electrospinning)和靜電噴霧(簡稱電噴,Electrospraying)兩種形式。
Jamil A. Matthews et al. , “Electrospinning of Collagen Nanofibers,,,Bio macromolecules, 2002, 3(2) :232 238公開了一種利用靜電紡絲制備膠原膜的方法取I型膠原,采用六氟異丙醇溶解,得濃度為83mg/ml的膠原六氟異丙醇溶液;再取Iml玻璃注射器連接針頭,并將其固定在微量注射泵上,將針頭與高壓直流電源相連,推進速度為5. Oml/ h,取20(寬)X30 (長)大小的鋁箔固定在平板接收器,將其接地,設(shè)置其與針頭的距離為 12. 5cm;設(shè)置電壓為25. 0KV,進行靜電紡絲,制備得到了膠原蛋白膜。但是,該方法制備的膠原蛋白膜力學(xué)性能差,制備的膠原蛋白厚度僅為187 μ m,難以滿足實際應(yīng)用的需要。
很多研究者為提高膠原蛋白纖維的強度和模量,對膠原蛋白進行改性或加入其它材料,增加其力學(xué)性能,如在膠原的酸性溶液中加入了聚環(huán)氧乙烷(ΡΕ0),利用靜電紡絲制備了膠原/PEO共混納米纖維,纖維直徑在100 150nm之間。由于PEO與膠原之間的相互作用,纖維具有較好的力學(xué)性能;然而引入其他高分子材料,使其在應(yīng)用方面會有諸多限制,同時也大大降低了膠原膜使用的安全性 ;另外,申請?zhí)?00910209509. 6,發(fā)明名稱 “膠原超細纖維膜材料的制備方法”的專利申請文件中報道利用磷酸鹽和無水乙醇混合液作為膠原電紡液,盡管從技術(shù)上能實現(xiàn)膠原的可紡性,但是后期不容易脫鹽,不僅增加了生產(chǎn)成本,同時在應(yīng)用方面也會受限。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題,本發(fā)明提供一種用靜電紡絲技術(shù)制備納米膠原蛋白膜的新方法,還提供了一種雙層納米膠原蛋白膜的制備方法,以及前述方法制備的膠原蛋白膜及其用途。
本發(fā)明納米膠原蛋白膜的制備方法,包括如下步驟
(I)取膠原蛋白溶于六氟異丙醇中,得8(Tl20mg/ml膠原蛋白六氟異丙醇溶液;
(2)取步驟(I)的膠原蛋白六氟異丙醇溶液進行靜電紡絲,電壓為15 19KV,接收距離12. 5 15cm,推進速度為O. 5^1. 2ml/h,揮去六氟異丙醇,即得納米膠原蛋白膜。
優(yōu)選地,步驟(I)所述膠原蛋白六氟異丙醇溶液的濃度為110mg/m ;步驟(2)所述電壓為16KV,接收距離12. 5cm,推進速度為1. 2ml/h。
進一步優(yōu)選地,包括如下步驟
(I)取膠原蛋白,加入六氟異丙醇,25°C攪拌至溶液澄清透明,配制濃度為IlOmg/ ml的膠原蛋白六氟異丙醇溶液;
(2)取玻璃注射器分次吸取步驟(I)的膠原蛋白六氟異丙醇溶液,并將其固定在微量注射泵上,將針頭與高壓直流電源相連,推進速度為1. 2ml/h,取鋁箔固定在平板接收器, 將其接地,設(shè)置其與針頭的距離為12. 5cm ;設(shè)置電壓為16. 0KV,進行靜電紡絲,在25°C真空干燥,將電紡膜從鋁箔上取下,即得納米膠原蛋白膜。
本發(fā)明雙層膠原蛋白膜的制備方法,包括如下步驟
①按照前述方法制備納米膠原蛋白膜;
②取膠原蛋白,采用吹膜技術(shù)或者靜電噴霧技術(shù)在步驟①的膠原蛋白膜表面制備另一層膠原蛋白膜,得雙層膠原蛋白膜。
其中,所述靜電噴霧技術(shù)包括如下步驟
a、取膠原蛋白,溶于六氟異丙醇中,得5(Tl20mg/ml膠原蛋白六氟異丙醇溶液;
b、取步驟a的膠原蛋白六氟異丙醇溶液進行靜電噴霧,噴于步驟①的納米膠原蛋白膜表面,電壓為15 19KV,接收距離12. 5 15cm,推進速度為O. 5^1. 2ml/h,揮去六氟異丙醇,即得雙層膠原蛋白膜。
其中,步驟a所述膠原蛋白六氟異丙醇溶液的濃度為50mg/ml ;步驟b所述電壓為 16KV,接收距離12. 5cm,推進速度為1. 2ml/h。
所述吹膜技術(shù)是制備膠原蛋白膜的常規(guī)技術(shù),如張焰等,“重建膠原纖維對細胞的影響”,中國組織工程研究與臨床修復(fù),
12(41). 8095-8098. 2008公開的方法;也可以采用如下方法
取膠原蛋白溶于六氟異丙醇中,得O. 01-80mg/ml膠原蛋白六氟異丙醇溶液,置于前述方法制備的膠原蛋白膜表面,干燥,干燥溫度為4°C 37°C,干燥時間為4 48h,即得雙層膠原蛋白膜。優(yōu)選地,膠原蛋白溶液的濃度為O. 01-80mg/ml ;干燥溫度為20°C 26°C,干燥時間為8 24h。
其中,所述膠原蛋白是I型或III型膠原蛋白。
其中,所述膠原蛋白來源于天然活性膠原或重建活性膠原。
其中,所述膠原蛋白來源于水生物或其他哺乳類動物。
其中,所述膠原蛋白來源于?;蛘哓i。
本發(fā)明還提供了前述方法制備的膠原蛋白膜。
本發(fā)明還提供了上述的膠原蛋白膜在制備修復(fù)創(chuàng)面、止血的藥物或保健品中的用途。
本發(fā)明還提供了上述的膠原蛋白膜在制備組織工程體內(nèi)植入膠原膜中的用途。
本發(fā)明以六氟異丙醇為溶劑,通過對靜電紡絲工藝的改進,制備得到單層納米膠原蛋白膜和雙層膠原蛋白膜,其力學(xué)性能顯著優(yōu)于現(xiàn)有膠原蛋白膜,厚度最高可達 2000 μ m,是現(xiàn)有納米膠原蛋白厚度的10. 7倍,顯著優(yōu)于現(xiàn)有方法制備的納米膠原蛋白膜, 無細胞毒性,溶血性和抗原性低,能促進細胞增殖,可用于牙科、骨科、皮膚科等多個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
顯然,根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容,按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段,在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下,還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
,對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1膠原電紡膜照片
圖2掃描電鏡下的膠原納米纖維
圖3膠原電紡+電噴雙層膜照片
圖4細胞增殖試驗結(jié)果
圖5豚鼠致敏試驗局部注射點
圖6豚鼠致敏試驗結(jié)果(生理鹽水)
圖7豚鼠致敏試驗(實施例2膠原膜浸提液)具體實施方式
靜電紡絲設(shè)備型號NS LAB200,市售。
靜電噴霧設(shè)備型號SS_1332Ucalery,市售。
實施例1本發(fā)明納米膠原蛋白膜的制備方法
1、制備方法
(I)精確稱量膠原海綿1. 3531g,放入小燒杯中,吸取12. 3ml六氟異丙醇溶液加入到小燒杯中,25°C在磁力攪拌器上攪拌約6小時至溶液澄清透明,配制濃度為110mg/ml 的膠原六氟異丙醇溶液;
(2)取5ml玻璃注射器分次吸取12ml六氟異丙醇溶液,連接針頭,并將其固定在微量注射泵上,將針頭與高壓直流電源相連,推進速度為1.2 ml/h,取20(寬)X30 (長)大小的鋁箔固定在平板接收器,將其接地,設(shè)置其與針頭的距離為12. 5cm ;設(shè)置電壓為16. OKV, 進行靜電紡絲,在25°C真空干燥箱干燥2小時,將膠原纖維電紡膜從鋁箔上取下,即得納米膠原蛋白膜。
用千分尺測量所得膠原蛋白膜,厚度達到163μ m ;如圖1所示,質(zhì)地柔軟,韌性好,易剪裁,能滿足不同的臨床需求;如圖2所示,掃描電鏡測定其納米直徑約為200nm。
本發(fā)明中的原料膠原蛋白來源較為廣泛,可以來源于水生物或牛、豬等或其他哺乳類動物,也可以是重建膠原,其重建膠原是通過生物化學(xué)反應(yīng)去掉兩邊端肽,重建纖維的可溶性膠原如ZL200810045663.1中提到的。
實施例2本發(fā)明雙層膠原蛋白膜的制備方法
將實施例1所獲得的納米膠原電紡膜,固定在平板接收器上;
配置濃度為50mg/ml的膠原六氟異丙醇溶液,取5ml玻璃注射器分次吸取六氟異丙醇溶液膠原溶液,連接針頭,并將其固定在微量注射泵上,將針頭與高壓直流電源相連, 推進速度為1.2ml/h,取20(寬)X30 (長)大小的鋁箔固定在平板接收器,將其接地,設(shè)置其與針頭的距離為12. 5cm;設(shè)置電壓為16. 0KV,利用電噴工藝噴涂膠原六氟異丙醇溶液, 使其在膠原電紡膜上形成一層納米顆粒,在25°C真空干燥箱干燥2小時,即可;
在電鏡下可見其膠原膜為雙層膜,并且電噴形成的膠原顆粒填補了電紡形成的膠原膜空隙,減小了電紡膠原膜的孔隙率,使該雙層膠原膜具有一面粗糙,一面光滑的效果, 從而更有利于引導(dǎo)單側(cè)細胞再生。
測定發(fā)現(xiàn),該雙層膠原膜厚度為164. 5um。
實施例3本發(fā)明雙層膠原蛋白膜的制備方法
將實施例1所獲得的納 米膠原電紡膜,固定在平板接收器上;
配置濃度為80mg/ml的膠原六氟異丙醇溶液,取5ml玻璃注射器分次吸取六氟異丙醇溶液膠原溶液,連接針頭,并將其固定在微量注射泵上,將針頭與高壓直流電源相連, 推進速度為O. 5ml/h,取20(寬)X30 (長)大小的鋁箔固定在平板接收器,將其接地,設(shè)置其與針頭的距離為12. 5cm;設(shè)置電壓為15. 0KV,利用電噴工藝噴涂膠原六氟異丙醇溶液, 使其在膠原電紡膜上形成一層納米顆粒,在25°C真空干燥箱干燥2小時,即可。
實施例4本發(fā)明雙層膠 原蛋白膜的制備方法
將實施例1所獲得的納米膠原電紡膜,固定在平板接收器上;
配置濃度為120mg/ml的膠原六氟異丙醇溶液,取5ml玻璃注射器分次吸取六氟異丙醇溶液膠原溶液,連接針頭,并將其固定在微量注射泵上,將針頭與高壓直流電源相連, 推進速度為O. 8ml/h,取20(寬)X 30 (長)大小的鋁箔固定在平板接收器,將其接地,設(shè)置其與針頭的距離為15cm;設(shè)置電壓為19. 0KV,利用電噴工藝噴涂膠原六氟異丙醇溶液,使其在膠原電紡膜上形成一層納米顆粒,在25°C真空干燥箱干燥2小時,即可。
實施例5本發(fā)明雙層膠原蛋白膜的制備方法
將實施例1所獲得的膠原蛋白膜,放置于潔凈臺上;
配置濃度為50mg/ml的膠原六氟異丙醇溶液,置于前述方法制備的膠原蛋白膜表面,干燥,干燥溫度為4°C °C,干燥時間為48h,在膠原蛋白膜上形成一層膠原膜,揮干六氟異丙醇,形成膠原雙層膜。
測定發(fā)現(xiàn),該雙層I父原I吳厚度為230um。
實施例6本發(fā)明單層納米膠原蛋白膜制備方法的參數(shù)篩選試驗
1、實驗方法
按照實施例1所述方法制備膠原蛋白膜,其中,膠原蛋白六氟異丙醇溶液濃度、靜電紡絲方法的電壓、接收距離和推進速度如表I所示
表I參數(shù)篩選
權(quán)利要求
1.一種納米膠原蛋白膜的制備方法,其特征在于包括如下步驟(1)取膠原蛋白溶于六氟異丙醇中,制得8(Tl20mg/ml膠原蛋白六氟異丙醇溶液;(2)用步驟(I)的膠原蛋白六氟異丙醇溶液進行靜電紡絲,電壓為15 19KV,接收距離為12. 5 15cm,推進速度為O. 5^1. 2ml/h,揮去六氟異丙醇,即得納米膠原蛋白膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于步驟(I)所述膠原蛋白六氟異丙醇溶液的濃度為110mg/ml ;步驟(2)所述電壓為16KV,接收距離12. 5cm,推進速度為1. 2ml/h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于包括如下步驟(1)取膠原蛋白,加入六氟異丙醇中,25°C攪拌至溶液澄清透明,配制濃度為110mg/ml 的膠原蛋白六氟異丙醇溶液;(2)用玻璃注射器分次吸取步驟(I)的膠原蛋白六氟異丙醇溶液,并將其固定在微量注射泵上,將針頭與高壓直流電源相連,推進速度為1. 2ml/h,取鋁箔固定在平板接收器,將其接地,設(shè)置其與針頭的距離為12. 5cm ;設(shè)置電壓為16. 0KV,進行靜電紡絲,在25°C真空干燥,將電紡膜從鋁箔上取下,即得納米膠原蛋白膜。
4.一種雙層膠原蛋白膜的制備方法,其特征在于包括如下步驟①按照權(quán)利要求Γ3任意一項所述方法制備納米膠原蛋白膜;②取膠原蛋白,采用吹膜技術(shù)或者靜電噴霧技術(shù)在步驟①的納米膠原蛋白膜表面制備另一層膠原蛋白膜,得雙層膠原蛋白膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于所述靜電噴霧技術(shù)包括如下步驟a、取膠原蛋白溶于六氟異丙醇中,制得5(Tl20mg/ml膠原蛋白六氟異丙醇溶液;b、取步驟a的膠原蛋白六氟異丙醇溶液進行靜電噴霧,噴于步驟①的納米膠原蛋白膜表面,電壓為15 19KV,接收距離12. 5 15cm,推進速度為O. 5^1. 2ml/h,揮去六氟異丙醇,即得雙層膠原蛋白膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于步驟a所述膠原蛋白六氟異丙醇溶液的濃度為50mg/ml ;步驟b所述電壓為16KV,接收距離12. 5cm,推進速度為1. 2ml/h。
7.根據(jù)權(quán)利要求Γ6任意一項所述的方法,其特征在于所述膠原蛋白是I型或III型膠原蛋白;所述膠原蛋白來源于天然活性膠原或重建活性膠原;所述膠原蛋白來源于水生物或其他哺乳類動物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米膠原蛋白膜,其特征在于所述膠原蛋白來源于?;蛘哓i。
9.權(quán)利要求Γ8任意一項方法制備的膠原蛋白膜。
10.權(quán)利要求9所述的膠原蛋白膜在制備修復(fù)創(chuàng)面、止血的藥物或保健品中的用途。
11.權(quán)利要求9所述的膠原蛋白膜在制備組織工程體內(nèi)植入膠原膜中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米膠原蛋白膜的制備方法,包括如下步驟(1)取膠原蛋白溶于六氟異丙醇中,得80~120mg/ml膠原蛋白六氟異丙醇溶液;(2)取步驟(1)的膠原蛋白六氟異丙醇溶液進行靜電紡絲,電壓為15~19KV,接收距離12.5~15cm,推進速度為0.5~1.2ml/h,揮去六氟異丙醇,即得納米膠原蛋白膜。本發(fā)明還公開了雙層膠原蛋白膜的制備方法與制備得到的膠原蛋白膜及其用途。本發(fā)明膠原蛋白膜力學(xué)性能優(yōu)良,無細胞毒性,溶血性和抗原性低,生物活性高。
文檔編號D04H13/00GK103046225SQ20131001755
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者孫莉嫚, 彭紅衛(wèi), 陳春會, 李好雨, 劉富俊, 張風(fēng)豪, 朱小舟 申請人:蘇州達普生物技術(shù)有限公司
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