本發(fā)明涉及一種復(fù)合口腔粘膜上皮細(xì)胞的口腔補(bǔ)片制備方法，屬于細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口腔粘膜作為人體生物性屏障的第一道防線，在日常生活中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但口腔粘膜的位置及其周圍環(huán)境導(dǎo)致多種因素可引起口腔粘膜組織缺失，如口腔頜面外科的腫瘤切除，創(chuàng)傷及修復(fù)前的牙槽外科往往有大面積口腔粘膜缺損，臨床上常以皮片移植或皮瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)，但皮片移植常因攣縮導(dǎo)致口腔狹窄、影響功能，局部皮瓣轉(zhuǎn)移則常致局部臃腫，形態(tài)不佳，患者難以接受。而且，自體組織移植是以犧牲正常組織為代價(jià)的“以創(chuàng)傷修復(fù)損傷”的治療模式，既增加了新的創(chuàng)傷，又增加了手術(shù)并發(fā)癥的機(jī)率，且自體組織來源有限，限制了其臨床應(yīng)用。近年來，隨著生物材料的興起，臨床上口腔粘膜缺損修復(fù)取得較為滿意的治療效果，但對于較大面積的口腔粘膜缺損，仍然具有較大的局限性，很難達(dá)到預(yù)期的治療效果。尋找簡便、安全、有效的口腔粘膜修復(fù)材料已成為治療口腔粘膜疾患，提高患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵。組織工程學(xué)是一門新興的學(xué)科，它應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，研究和開發(fā)能修復(fù)損傷組織和改善其功能的生物替代物，通過少量組織細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后構(gòu)建具有生命力的活體組織，達(dá)到修復(fù)組織缺損的目的。
小腸粘膜下層（smallintestinalsubmucosa，sis）是天然細(xì)胞外基質(zhì)類生物衍生材料，它是由一層致密的結(jié)締組織構(gòu)成，主要含有ⅰ、ⅲ型膠原蛋白，無免疫原性，具有抗微生物活性，有良好的生物力學(xué)性能和生物相容性。sis攜帶多種生長因子如fgf-2、ctgf、tgf-b等，可促進(jìn)多種細(xì)胞在材料上黏附、生長和分化，并能促進(jìn)組織再生，是一種良好組織工程的生物支架材料。
運(yùn)用組織工程技術(shù)，將口腔粘膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞種植在支架材料上，構(gòu)建有活性的口腔粘膜修復(fù)材料，為臨床上口腔粘膜缺損修復(fù)重建提供新的途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是使因口腔頜面外科的腫瘤切除，創(chuàng)傷及修復(fù)前的牙槽外科等所造成的大面積口腔粘膜缺損得到有效地修復(fù)及重建。本發(fā)明提供了一種復(fù)合口腔粘膜上皮細(xì)胞的口腔補(bǔ)片制備方法，材料來源充分，能夠使口腔粘膜上皮細(xì)胞在口腔補(bǔ)片中大量增殖，為臨床上口腔粘膜大面積缺損的修復(fù)重建提供新的途徑。為解決上訴技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種復(fù)合口腔粘膜上皮細(xì)胞的口腔補(bǔ)片制備方法，包括以下步驟：
1.口腔補(bǔ)片的制備：采用小腸粘膜下層制備口腔補(bǔ)片。步驟為取材于豬小腸粘膜下層，經(jīng)去細(xì)胞、去dna、病毒滅活、凍干和輻照滅菌等加工過程后獲得。
2.口腔粘膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下于手術(shù)病人口腔內(nèi)獲取口腔粘膜組織。用含雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗，再用pbs液沖洗，用眼科剪除去粘膜下組織，剪成約5mm×5mm的小塊，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培養(yǎng)基并沒過組織塊，4℃消化16～18h，將表層上皮與上皮下層用眼科鑷分開。上皮層加入消化酶37℃消化15min（5min吹打振動(dòng)1次），加fbs液終止消化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，離心，棄上清，pbs液清洗3次，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入培養(yǎng)液3～5ml，置37℃、5%co2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天開始首次換液，以后每2d換液1次。
3.口腔粘膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)口腔粘膜上皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底2/3以上時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，4℃pbs清洗3次，加入消化酶37℃消化，倒置相差顯微鏡下見大部分細(xì)胞變圓脫壁后，加入培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管反復(fù)吹打，形成細(xì)胞懸液，離心，棄上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種新培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
4.口腔粘膜上皮細(xì)胞與口腔補(bǔ)片復(fù)合培養(yǎng)：取步驟1.中獲得的口腔補(bǔ)片，放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用dksfm培養(yǎng)基浸泡1～3天后，加入6～20%的牛血清，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12～16h；取步驟3.中傳代培養(yǎng)的口腔粘膜上皮細(xì)胞，用含0.02％edta的消化酶消化，離心、去上清，pbs反復(fù)漂洗3次后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液稀釋后種至放有口腔補(bǔ)片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～3天換液一次。待細(xì)胞增殖到5～10×105/cm2時(shí)，可移植到口腔粘膜受損區(qū)，并縫合固定。
所述消化酶溶液為0.25%的胰蛋白酶溶液。
步驟2.中所述的雙抗的生理鹽水為含青霉素100ug/ml與鏈霉素100ug/ml的生理鹽水。
步驟2.中所述的fbs為10%的fbs。
所述離心過程使用的轉(zhuǎn)速及時(shí)間為800rpm，5min。
所述的培養(yǎng)液為含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液。
步驟4.中所述的細(xì)胞懸液的接種密度為2～5×106/皿。
步驟4.中所述口腔補(bǔ)片尺寸大小為5cm×4cm。
步驟4.中所述傳代培養(yǎng)的口腔粘膜上皮細(xì)胞為2代培養(yǎng)的細(xì)胞。
本發(fā)明所達(dá)到的有益效果在于：
1.本發(fā)明選擇sis作為口腔補(bǔ)片材料，主要有ⅰ、ⅲ型膠原蛋白具有良好的生物力學(xué)性能，抗微生物活性，良好的細(xì)胞相容性及無抗原性，能促進(jìn)口腔粘膜上皮細(xì)胞的粘附、生長和分化，因此口腔粘膜上皮細(xì)胞能大量增殖形成緊密的細(xì)胞層。
2.本發(fā)明采用口腔粘膜上皮細(xì)胞復(fù)合口腔補(bǔ)片，可提高大面缺損的口腔粘膜修復(fù)效率。
因此，本發(fā)明所提供的一種復(fù)合口腔粘膜上皮細(xì)胞的口腔補(bǔ)片制備方法，材料容易獲取，能夠使口腔粘膜上皮細(xì)胞在口腔補(bǔ)片中大量增殖，提高大面積缺損的口腔粘膜修復(fù)效率，為臨床上運(yùn)用組織工程技術(shù)修復(fù)口腔粘膜缺損提供新的途徑。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明對的技術(shù)方案，而不能以此用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例一
1.口腔補(bǔ)片的制備：采用小腸粘膜下層制備口腔補(bǔ)片。步驟為取材于豬小腸粘膜下層，經(jīng)去細(xì)胞、去dna、病毒滅活、凍干和輻照滅菌等加工過程后獲得。
2.口腔粘膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下于手術(shù)病人口腔內(nèi)獲取口腔粘膜組織。用含青霉素100ug/ml與鏈霉素100ug/ml的雙抗生理鹽水反復(fù)沖洗，再用pbs液沖洗，用眼科剪除去粘膜下組織，剪成約5mm×5mm的小塊，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培養(yǎng)基并沒過組織塊，4℃消化16h，將表層上皮與上皮下層用眼科鑷分開。上皮層加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化15min（5min吹打振動(dòng)1次），加10%的fbs液終止消化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，800rpm，離心5min，棄上清，pbs液清洗3次，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液3ml，置37℃、5%co2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天開始首次換液，以后每2d換液1次。
3.口腔粘膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)口腔粘膜上皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底2/3以上時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，4℃pbs清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化，倒置相差顯微鏡下見大部分細(xì)胞變圓脫壁后，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管反復(fù)吹打，形成細(xì)胞懸液，800rpm，離心5min，棄上清，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種新培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
4.口腔粘膜上皮細(xì)胞與口腔補(bǔ)片復(fù)合培養(yǎng)：取步驟1.中獲得的尺寸大小為5cm×4cm的口腔補(bǔ)片，放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用dksfm培養(yǎng)基浸泡1天后，加入6%的牛血清，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h；取步驟3.中2代培養(yǎng)的口腔粘膜上皮細(xì)胞，用含0.02％edta的0.25%的胰蛋白酶消化，800rpm，離心5min，去上清，pbs反復(fù)漂洗3次后加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液稀釋后按每皿2×106個(gè)的接種密度種至放有口腔補(bǔ)片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1天換液1次。待細(xì)胞增殖到5×105/cm2時(shí)，可移植到口腔粘膜受損區(qū)，并縫合固定。
實(shí)施例二
1.口腔補(bǔ)片的制備：采用小腸粘膜下層制備口腔補(bǔ)片。步驟為取材于豬小腸粘膜下層，經(jīng)去細(xì)胞、去dna、病毒滅活、凍干和輻照滅菌等加工過程后獲得。
2.口腔粘膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下于手術(shù)病人口腔內(nèi)獲取口腔粘膜組織。用含青霉素100ug/ml與鏈霉素100ug/ml的雙抗生理鹽水反復(fù)沖洗，再用pbs液沖洗，用眼科剪除去粘膜下組織，剪成約5mm×5mm的小塊，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培養(yǎng)基并沒過組織塊，4℃消化17h，將表層上皮與上皮下層用眼科鑷分開。上皮層加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化15min（5min吹打振動(dòng)1次），加10%的fbs液終止消化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，800rpm，離心5min，棄上清，pbs液清洗3次，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液4ml，置37℃、5%co2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天開始首次換液，以后每2d換液1次。
3.口腔粘膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)口腔粘膜上皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底2/3以上時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，4℃pbs清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化，倒置相差顯微鏡下見大部分細(xì)胞變圓脫壁后，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管反復(fù)吹打，形成細(xì)胞懸液，800rpm，離心5min，棄上清，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種新培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
4.口腔粘膜上皮細(xì)胞與口腔補(bǔ)片復(fù)合培養(yǎng)：取步驟1.中獲得的尺寸大小為5cm×4cm的口腔補(bǔ)片，放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用dksfm培養(yǎng)基浸泡2天后，加入10%的牛血清，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育14h；取步驟3.中2代培養(yǎng)的口腔粘膜上皮細(xì)胞，用含0.02％edta的0.25%的胰蛋白酶消化，800rpm，離心5min、去上清，pbs反復(fù)漂洗3次后加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液稀釋后按每皿4×106個(gè)的接種密度種至放有口腔補(bǔ)片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。待細(xì)胞增殖到8×105/cm2時(shí)，可移植到口腔粘膜受損區(qū)，并縫合固定。
實(shí)施例三
1.口腔補(bǔ)片的制備：采用小腸粘膜下層制備口腔補(bǔ)片。步驟為取材于豬小腸粘膜下層，經(jīng)去細(xì)胞、去dna、病毒滅活、凍干和輻照滅菌等加工過程后獲得。
2.口腔粘膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下于手術(shù)病人口腔內(nèi)獲取口腔粘膜組織。用含青霉素100ug/ml與鏈霉素100ug/ml的雙抗生理鹽水反復(fù)沖洗，再用pbs液沖洗，用眼科剪除去粘膜下組織，剪成約5mm×5mm的小塊，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含0.25％dispaseⅱ的dksfm培養(yǎng)基并沒過組織塊，4℃消化18h，將表層上皮與上皮下層用眼科鑷分開。上皮層加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化15min（5min吹打振動(dòng)1次），加10%的fbs液終止消化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，800rpm，離心5min，棄上清，pbs液清洗3次，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液5ml，置37℃、5%co2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天開始首次換液，以后每2d換液1次。
3.口腔粘膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)口腔粘膜上皮細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底2/3以上時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，4℃pbs清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化，倒置相差顯微鏡下見大部分細(xì)胞變圓脫壁后，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管反復(fù)吹打，形成細(xì)胞懸液，800rpm，離心5min，棄上清，加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按每毫升1×105個(gè)接種新培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
4.口腔粘膜上皮細(xì)胞與口腔補(bǔ)片復(fù)合培養(yǎng)：取步驟1.中獲得的尺寸大小為5cm×4cm的口腔補(bǔ)片，放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用dksfm培養(yǎng)基浸泡3天后，加入20%的牛血清，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育16h；取步驟3.中2代培養(yǎng)的口腔粘膜上皮細(xì)胞，用含0.02％edta的0.25%的胰蛋白酶消化，800rpm，離心5min、去上清，pbs反復(fù)漂洗3次后加入含有10%fbs的dksfm培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液稀釋后按每皿5×106個(gè)的接種密度種至放有口腔補(bǔ)片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。待細(xì)胞增殖到10×105/cm2時(shí)，可移植到口腔粘膜受損區(qū)，并縫合固定。