本發(fā)明涉及一種在多孔支架結(jié)構(gòu)的表面接枝有包括藥物在內(nèi)的功能成分修飾結(jié)構(gòu)層的支架結(jié)構(gòu)及其制備方法。

背景技術(shù)：

多孔支架材料在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有重要的應(yīng)用，特別是在組織工程和骨再生醫(yī)學(xué)中。常規(guī)的多孔支架材料制備主要有發(fā)泡法、靜電紡絲、模具多孔燒結(jié)法、3d增材打印等。以骨修復(fù)兩次為例，但無論采用包括無機、有機、金屬，或是其復(fù)合材料，即使在其基質(zhì)中共混復(fù)合有生物活性或藥物等成分，因這些制備方法得到的多孔支架表層結(jié)構(gòu)致密，都難以在植入時有效實現(xiàn)所設(shè)計的緩釋或控釋效應(yīng)，無法為組織工程和骨關(guān)鍵修復(fù)過程提供初期細(xì)胞粘附增殖分化急需的如誘導(dǎo)骨生成、促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、抑制細(xì)菌和炎性細(xì)胞等生物活性功能。為了實現(xiàn)支架材料的生物功能，在支架材料表面進(jìn)行功能成分接枝處理，是目前一種常用的方法。目前大多數(shù)通過接枝方法制備功能分子的方法，都需使用硅烷偶聯(lián)劑。如cn201410001001中國專利提供的一種改性醫(yī)用鈦金屬材料，采用了硅烷偶聯(lián)劑在鈦表面接枝聚苯胺。cn201010587242提供的是一種表面固定有抗體的藥物血管支架的制備方法，采用的是在支架上噴涂聚酯，再用偶聯(lián)劑與抗體進(jìn)行交聯(lián)。近年來，leeh.等人報道了聚多巴胺能穩(wěn)定地沉積并附著于各種材料表面（leeh.;dellatores.m.;millerw.m.science.2007,318:426.）。wu,c.等人報道該聚多巴胺涂層能提高sio2多孔支架的體外礦化性能，并提升骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bonemarrowstromalcells，bmscs）的粘附和增殖能力（wu,c.;fan,w.;chang,j.;xiao,y.mussel-inspiredporoussio2scaffoldswithimprovedmineralizationandcytocompatibilityfordrugdeliveryandbonetissueengineering.[j]j.mater.chem.2011,21,18300）。在此基礎(chǔ)上，利用多巴胺的粘附性能將藥物混于多巴胺后粘附著于基底材料上，在cn201210331666.6，cn201010195840.x，cn201611034630.6等文獻(xiàn)中都有所報道。但在目前大部分文獻(xiàn)報道的方法中，藥物等都是通過浸泡或共混的方式附著的，其附著方式不明確，載藥量和控釋力受限。例如，雖然其中cn201210331666.6在所提出的以多巴胺為橋連的生物醫(yī)用材料表面固定功能分子的方法中，提出利用化學(xué)反應(yīng)將功能分子接枝到聚多巴胺層上，但其固定功能分子方法仍是將固定有多巴胺的生物醫(yī)用材料在功能分子中浸泡。

將生物功能性藥物的活性基團(tuán)與改性的支架表面以點擊化學(xué)（clickchemistry）方式進(jìn)行點對點的化學(xué)橋接是近期報道的一種有效的接枝方法，包括利用銅催化的疊氮-炔基husigen環(huán)加成反應(yīng)（copper-catalyzedazide–alkynecycloaddition），以及thiol-ene反應(yīng)如巰基與烯體、非醇醛的羰基化學(xué)、碳碳多鍵如雙烯體與親雙烯體的加成反應(yīng)等（王莉莉等，有機疊氮化合物的合成與應(yīng)用進(jìn)展i.有機疊氮化合物的合成方法，化工科技，2010,18(1):72-75；clickchemistry,apoenttoolinmedicinalsciences,f.musumeci,s.schenone,a.desogus,e.nieddu,d.deodatoandl.botta,currentmedicinalchemistry,2015,vol.22,no.17,2022-2050）。例如，中國專利文獻(xiàn)201410019510.3中提出的空心tio2微球表面接枝聚酰亞胺復(fù)合粒子的制備方法，就是利用這種方法，通過環(huán)加成反應(yīng)將端炔基的聚酰亞胺接枝于疊氮基化的tio2微球。此類方法常具有操作簡單、條件溫和等顯著優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，本發(fā)明提供了一種具有表面定向功能修飾涂層的新結(jié)構(gòu)形式的多孔支架，并進(jìn)一步提供了該多孔支架的制備方法。

本發(fā)明具有表面定向功能修飾涂層的多孔支架，是在多孔支架材料結(jié)構(gòu)的表面被覆有聚多巴胺涂層結(jié)構(gòu)，在聚多巴胺涂層結(jié)構(gòu)表面的羥基和/或氨基部位，以模塊化方式接枝有在生物體液環(huán)境中可釋放具有生物活性功能/作用的包括藥物或生物分子在內(nèi)的功能成分結(jié)構(gòu)層。

上述結(jié)構(gòu)中所述的多孔支架材料結(jié)構(gòu)，可優(yōu)選但并非僅限于由醫(yī)學(xué)中可以接受的成分和/或材料制備而成的結(jié)構(gòu)，一般可為惰性生物材料，或者是降解時間≥3個月的可緩慢降解的生物材料的多孔結(jié)構(gòu)體，包括鈦合金、不銹鋼在內(nèi)的金屬材料的支架結(jié)構(gòu)、由包括氧化硅、氧化鋯、聚氨酯（pu）、聚四氟乙烯（ptfe）、聚苯乙烯（ps）、聚乙烯（pe）、聚碳酸酯（pc）、聚酰胺（pa）在內(nèi)的無機物成分、有機物成分、或由這些材料中的至少一種構(gòu)成的復(fù)合成分。

為保證和提高所述多孔支架材料結(jié)構(gòu)的孔隙，以接枝有更多的所述功能成分，多孔支架材料結(jié)構(gòu)中孔隙的孔徑優(yōu)選為0.01mm~1mm，更好的孔徑可選擇0.3mm~0.8mm，和/或其孔隙率可優(yōu)選為20%~90%，更好的孔隙率可選擇30%~80%。

上述結(jié)構(gòu)中所述的具有生物活性功能/作用的包括藥物或生物分子在內(nèi)的功能成分，可以包括結(jié)構(gòu)中含有端炔基、或可直接轉(zhuǎn)化為端部狀態(tài)的炔基或疊氮基的羥基，和/或氨基的藥物或生物分子；或者是結(jié)構(gòu)中含有可先經(jīng)包括取代方式、加成方式在內(nèi)的化學(xué)方式轉(zhuǎn)化為包括端部狀態(tài)的鹵化物、羥基、巰基、烯基、烯酸、醛類、醚類在內(nèi)的過渡形式結(jié)構(gòu)后，再在同一反應(yīng)系統(tǒng)中或以分步方式進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為相應(yīng)端部狀態(tài)的炔基或疊氮基的藥物或生物分子。

例如，成分中含有端炔基的藥物或生物分子包括如特比奈酚等抗菌類藥物，如炔雌醇等激素類藥物，如厄洛替尼等抗癌類藥物中的至少一種；所述的可先經(jīng)化學(xué)方式轉(zhuǎn)化后再進(jìn)而可轉(zhuǎn)化為相應(yīng)端部狀態(tài)的炔基或疊氮基的藥物或生物分子，包括硫酸軟骨素、膠原蛋白、玻尿酸、肝素、成骨蛋白中的至少一種。

在本發(fā)明上述的多孔支架材料結(jié)構(gòu)中，增加其表面中所被覆的聚多巴胺涂層結(jié)構(gòu)的厚度，可有利于功能成分的接枝量，并可提高所接枝的功能成分結(jié)構(gòu)層的穩(wěn)定性。因此，在上述基礎(chǔ)上，多孔支架表面中被覆的聚多巴胺涂層結(jié)構(gòu)的厚度進(jìn)一步可優(yōu)選的厚度為10~200nm，更好的厚度可為60~500nm。

現(xiàn)有研究表明，疊氮化物和炔烴幾乎完全不與生物分子發(fā)生反應(yīng)，且其分子結(jié)構(gòu)小，不能形成強氫鍵，極性也相對較弱，對連接在其上的其它物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)通常沒有顯著的影響（m.g.finn等，“點擊化學(xué)-釋義與目標(biāo)”,《化學(xué)進(jìn)展》2008,vol.20,no.1:1-4）。例如，其上所連接的相應(yīng)藥物成分在生物體液環(huán)境中，在生物體內(nèi)的酶的作用下很容易被釋放出來，釋放出來的藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)形式可逆轉(zhuǎn)回原態(tài)（“click”reactions:aversatiletoolboxforthesynthesisofpeptide-conjugates,chemsocrev,2014,43,7013-7039；“clickchemistry,apotenttoolinmedicinalsciences”f.musumeci,s.schenone,a.desogus,e.nieddu,d.deodatoandl.botta,currentmedicinalchemistry,2015,vol.22,no.17,2022-2050）

因此，本發(fā)明所述的具有表面定向功能修飾涂層的多孔支架中，以模塊化方式接枝在被覆于支架表面聚多巴胺涂層結(jié)構(gòu)表面的所述功能成分結(jié)構(gòu)層，優(yōu)先推薦的是通過所述多孔支架多巴胺涂層表面的羥基和/或氨基部位經(jīng)炔基化處理或者經(jīng)疊氮化處理后，與經(jīng)疊氮化處理和/或炔基化處理后的所述功能成分，以炔基-疊氮基對應(yīng)的偶聯(lián)方式接枝形成的功能成分結(jié)構(gòu)層。

本發(fā)明上述的多孔支架結(jié)構(gòu)表面被覆的聚多巴胺分子涂層中是由多巴胺聚合后形成的（雖然在不同ph條件下的聚合態(tài)有差異），其結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)主要為羥基和氨基。例如，在酸性條件下其活性基團(tuán)占優(yōu)，且適宜于疊氮化。因此在制備時，一般可優(yōu)先但并非僅限于采用以聚多巴胺涂層疊氮化，對相應(yīng)的藥物或生物分子等功能成分則可采用炔基化。

對本發(fā)明上述具有表面定向功能修飾涂層的多孔支架的制備，一般可包括下述由所述的多孔支架材料形成在其表面背負(fù)有聚多巴胺涂層的基底材料，對基底材料和相應(yīng)的功能成分中的-oh和/或-nh2進(jìn)行炔基化和/或疊氮基化處理，以及將處理后的功能成分在基底材料的聚多巴胺涂層表面進(jìn)行接枝等幾步操作。

第一步，將表面清潔處理并干燥后的所述多孔支架材料，于10℃~80℃條件下，在用含有10mm三羥甲基氨基甲烷且ph值為8.0~9.0的tris溶液配制的含量為0.1~5mg/ml的鹽酸多巴胺溶液中至少浸泡6~72小時，形成在多孔支架材料結(jié)構(gòu)的表面沉積有聚多巴胺涂層的支架，即聚多巴胺涂層的基底材料后，水清洗。優(yōu)選采用超聲方式進(jìn)行清洗，最后可選擇用無水乙醇清洗（也可用超聲方式），以利更好地除盡水分。清洗至洗液的ph值呈中性，干燥后待用。

為使所述的基底材料表面能有更理想的聚多巴胺涂層厚度，此步操作中對表面清潔處理并干燥后的多孔支架材料，可根據(jù)需要按所述方式，一般可在所述鹽酸多巴胺溶液中浸泡沉積1-10次。實驗顯示，通常按所述方式在所述鹽酸多巴胺溶液中浸泡沉積3-6次，即可得到具有滿意厚度聚多巴胺涂層的支架-聚多巴胺涂層基底材料。

第二步，對表面沉積有聚多巴胺涂層的待用基底材料表面和所述的功能成分表面，進(jìn)行包括下述方式的疊氮基化或炔基化處理：

a.炔基化處理：按下述方式之一進(jìn)行炔基化處理：

a-1：結(jié)構(gòu)中的-oh轉(zhuǎn)換為炔基

按下述比例的方式，將0.1~1cm³所述待用的基底材料，或者0.8~2g所述功能成分，分別置于各自的30~80ml極性值為3.5-4.5的有機溶劑中，例如可選擇但不限于四氫呋喃（thf）或乙酸乙酯等常用有機溶劑，在包括常用的氮氣等惰性氣體氛圍中，加入100~400mg包括nah、koh、k2co3或koch3、叔丁醇鉀等堿金屬堿性成分，攪拌溶解后，分別加入與基底材料聚多巴胺涂層表面的羥基，或是與含有羥基的功能成分的表面羥基等摩爾量的具有x-r-c≡ch形式鹵代烷基端炔的炔丙基溴、炔丙基氯等，于20-30℃攪拌反應(yīng)，生成鹵代物，至溶劑提取物無鹵素反應(yīng)，反應(yīng)時間一般可為12~48小時，分別在基底材料聚多巴胺涂層表面，或者是在功能成分表面生成具有炔基的結(jié)構(gòu)（rc≡ch）。酸中和后（可有限使用常用的稀鹽酸），再用水洗除去雜質(zhì)。所得到的炔基化基底材料可直接待用；所得到的功能成分，可用與其炔基化后對應(yīng)的截留分子量的透析袋透析，除去雜質(zhì)，干燥，其中優(yōu)選的是真空干燥或冷凍干燥后，待用。處理過程如式（a-1）所示：

。

a-2：結(jié)構(gòu)中的-nh2轉(zhuǎn)換為炔基

按a-1的比例方式，將所述的基底材料或所述的功能成分分別置于各自的沸點150℃以上的極性溶劑中，例如可優(yōu)選如二甲基甲酰胺（dmf）、二甲基亞砜（dmso）等容積，在常用的氮氣等惰性氣體氛圍中，在堿性成分存在下，分別加入與基底材料聚多巴胺涂層表面的氨基或與含有氨基的功能成分的表面氨基等摩爾量的具有端炔x-r-c≡ch形式的炔丙基溴、炔丙基氯等鹵代烷基成分，于＜100℃的加熱條件下反應(yīng)。其中所述的堿性成分，可優(yōu)選包括常用的碳酸鉀、三乙胺和氫化鈉等堿性成分。反應(yīng)后，可如上述a-1步中的方式，用酸中和并水洗除雜。所得到的炔基化基底材料可干燥后直接待用；所得到的炔基化功能成分用與其分子量對應(yīng)的截留分子量的透析袋透析除去雜質(zhì)，干燥（同樣可優(yōu)選真空干燥或冷凍干燥）后，待用。處理過程如式（a-2）所示：

。

a-3：結(jié)構(gòu)中的-oh和-nh2都轉(zhuǎn)換為炔基

將結(jié)構(gòu)中同時含有羥基和氨基的所述基底材料或所述的功能成分，分別按上述a-1和a-2方式處理，將其中的羥基和氨基都轉(zhuǎn)換為炔基，分別得到待用的炔基化基底材料，或待用的炔基化功能成分。

b．疊氮基化處理：按下述方式之一進(jìn)行疊氮基化處理：

b-1：結(jié)構(gòu)中的-oh轉(zhuǎn)換為疊氮基

按下述比例的方式，將0.1~1cm³所述待用的基底材料，或者0.8~2g所述的功能成分，分別置于各自的30~80ml沸點≥150℃的極性有機溶劑中，所述的溶劑優(yōu)選二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜，加入0.5~1.5ml的有機堿性成分，如三乙胺、甲基乙胺或二甲胺等，在保持為-2~3℃的條件下滴加2-溴異丁酰溴（bibb）、氯乙酸或1,3-溴丙烷1~3ml并反應(yīng)1~4個小時。其中，所述的滴加投料是為防止反應(yīng)體系的溫度升高，例如滴加速度可優(yōu)選的是20~40滴/min。低溫反應(yīng)后，再升至室溫繼續(xù)反應(yīng)24~72小時，分別得到溴化處理或氯化處理的基底材料或者功能成分。溴化或氯化處理后的基底材料或者功能成分，用甲醇或無水乙醇沉淀后，基底材料清洗至清洗液ph值至6.5-7.5；對功能成分的沉淀物用二氯甲烷或丙酮溶解后再用甲醇或無水乙醇沉淀的方式進(jìn)行純化，根據(jù)實際情況和需要，這一沉淀-溶解的純化過程可以多次重復(fù)，純化后清洗至清洗液ph6.5-7.5。然后，將清洗后的基底材料或者功能成分各自放入在50~250ml二甲基甲酰胺（dmf）或二甲基亞砜（dmso）中溶解有過飽和nan3或zn(n3)2?2py的溶液中，于20℃~90℃反應(yīng)6~48小時，冷卻至室溫，分別得到疊氮基化的基底材料或疊氮基化的功能成分，對得到的疊氮基化基底材料經(jīng)水洗除去雜質(zhì)至洗液無鹵素顯色反應(yīng)后，干燥，其中優(yōu)選真空干燥或冷凍干燥，待用；對得到的疊氮基化功能成分用與其分子量對應(yīng)的截留分子量透析袋透析后，水洗除去雜質(zhì)至清洗液無鹵素顯色反應(yīng)，干燥，其中優(yōu)選真空干燥或冷凍干燥，待用。處理過程如式（b-1）所示：

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b-2：結(jié)構(gòu)中的-nh2轉(zhuǎn)換為疊氮基

按下述比例的方式，將0.1~1cm³所述待用的基底材料，或者0.8~2g所述的功能成分，分別置于各自的50~200ml極性有機溶劑中，可優(yōu)選如二甲基亞砜、二氯甲烷或水等溶劑，各自加入在50~150ml二甲基亞砜（dmso）或二甲基甲酰胺（dmf）中溶解有三氟磺酸疊氮（tfn3:cf3son3）或?qū)ο醣降獐B氮（p-no2phso2n3）的溶液，以1~5wt%cuso4或cubr2為催化劑，在0℃~室溫下反應(yīng)24~72小時，分別得到疊氮基化的基底材料或疊氮基化的功能成分。得到的疊氮基化基底材料經(jīng)水洗除去雜質(zhì)至洗液無鹵素顯色反應(yīng)后，干燥（可優(yōu)選真空干燥或冷凍干燥），待用；對得到的疊氮基化功能成分用與其分子量對應(yīng)的截留分子量的透析袋透析后，水洗除去雜質(zhì)，至清洗液無鹵素顯色反應(yīng)后，干燥（同樣可優(yōu)選真空干燥或冷凍干燥），待用。處理過程如式（b-2）所示：

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b-3：結(jié)構(gòu)中的-oh和-nh2都轉(zhuǎn)換為疊氮基

將結(jié)構(gòu)中同時含有羥基和氨基的所述基底材料或所述的功能成分，分別按上述b-1和b-2方式處理，將其中的羥基和氨基都轉(zhuǎn)換為疊氮基，分別得到待用的疊氮基化基底材料，或待用的疊氮基化功能成分。

第三步，以點擊化學(xué)方式在多孔支架材料結(jié)構(gòu)表面形成炔基-疊氮基對應(yīng)接枝的功能成分結(jié)構(gòu)層

在常用的n2氣等惰性氣體氛圍保護(hù)下，將待用的已疊氮基化的基底材料，浸入含有0.5~3mmol濃度待用的已炔基化的功能成分的50~250ml沸點≥150℃的極性有機溶劑中，或是將待用的已炔基化處理的基底材料浸入含有0.5~3mmol濃度待用的已疊氮化的功能成分的50~250ml的沸點≥150℃的極性有機溶劑中，于-2℃~3℃（例如：冰鹽浴中）加入催化量的銅催化液后，在20-100℃反應(yīng)1-24小時。所述的沸點≥150℃的極性有機溶劑可優(yōu)先選擇如n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜等。所述的銅催化液可選用如0.05-0.3mmolcubr；或依次加入20~50μl的硫酸銅溶液(0.1~0.5mol/l)和60~300μl的抗壞血酸鈉溶液(2-4mol/l)等已有報道形式的催化液。反應(yīng)后，用稀氨水清洗除去銅離子，得到在所述基底材料的聚多巴胺涂層表面以疊氮基化-炔基方式經(jīng)環(huán)加成反應(yīng)定向接枝有功能成分修飾涂層結(jié)構(gòu)的多孔支架。反應(yīng)后用所述的稀氨水清洗，可在保證盡可能除干凈銅離子的同時，又能盡量減少其可能產(chǎn)生不利的腐蝕作用的前提下進(jìn)行適當(dāng)選擇。例如，使用濃度為1-2%(v/v)的稀氨水就是一種很好的選擇。

本發(fā)明上述的制備方法中，利用了多巴胺小分子可滲入支架孔隙內(nèi)部，從而在支架表面形成了預(yù)沉積的聚多巴胺涂層。該涂層一方面可以提高支架對藥物等功能成分的粘附性，另一方面利用聚多巴胺涂層含有的大量羥基和氨基作為化學(xué)鍵合的錨定點位，通過分別對基底材料表面的聚多巴胺涂層和相應(yīng)的功能成分進(jìn)行疊氮基化與炔基化處理后，利用其間疊氮基-炔基間“點對點”的點擊式化學(xué)反應(yīng)完成相互接枝。由于疊氮基和炔基相對于其它常見的官能團(tuán)都是化學(xué)惰性的，因此疊氮基與炔基間的偶聯(lián)反應(yīng)速率高，反應(yīng)收率可實現(xiàn)等比定量的關(guān)系，并可同時實現(xiàn)對其它體系較大的兼容性。

相比于現(xiàn)有的對接枝藥物或功能分子直接進(jìn)行浸泡的方法，本發(fā)明采用疊氮與炔基間高效加成反應(yīng)的的制備方法，不僅可使接枝結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)固，接枝效率更高，而且由于多巴胺在弱堿性條件下接觸空氣時，可以在任何固體表面聚合并形成聚多巴胺納米薄膜，幾乎可以粘附于任意的基底上形成聚多巴胺涂層，從而使可以使用的支架材料更具有普適性。而小分子多巴胺可以滲入支架孔隙內(nèi)部實現(xiàn)均勻的高度交聯(lián)聚合，在所形成的不溶的聚多巴胺分子涂層結(jié)構(gòu)中包含了許多的羥基和/或氨基的活性位點，因而只需將涂層和藥物或生物分子等活性成分的活性位點分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的疊氮基或端炔基模塊，就能使其一一對應(yīng)地實現(xiàn)將各種活性成分高效橋聯(lián)接枝于各種材料的支架表面。因此本發(fā)明提出的上述形式具有表面定向功能修飾涂層的多孔支架，既拓展了支架材料的應(yīng)用領(lǐng)域，也為支架材料提供了更多功能選擇，特別是可為骨修復(fù)、血管治療等提供了新手段。

以下結(jié)合由附圖所示實施例的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1支架材料的聚多巴胺（pda）涂層接枝硫酸軟骨素（chs）前后的xps圖譜比較。

圖2是對直接成型的支架和本發(fā)明支架材料表面的掃描電鏡對比圖片。

具體實施方式

實施例1：表面接枝硫酸軟骨素涂層的多孔鈦合金支架材料

第一步，多孔鈦合金的準(zhǔn)備

多孔鈦合金用3d打印的方式制備，長寬分別為10mm，高5mm。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

多孔鈦合金浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。形成結(jié)構(gòu)為支架-聚多巴胺的基底材料。重復(fù)兩次，形成雙層聚多巴胺涂層。

第三步，硫酸軟骨素的炔基化

硫酸軟骨素（分子量20000-50000da）1g，加入50mlthf圓底燒瓶，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加入nah250mg，攪拌15min后，加入炔丙基溴750ul，rt下攪拌24h。截留分子量為1000da的透析袋進(jìn)行透析，除去雜質(zhì)，冷凍干燥。

第四步，基底的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，基底浸入，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的基底。分別用大量二氯甲烷、丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝

1mmol炔基-硫酸軟骨素加入到50mldmf，將基底-n3浸入。加入0.1mmolpmdeta作為配體。冰水浴下，對溶液“抽真空-通氮氣”，3次，在液面下通氮氣30min除盡氧氣。0.1mmolcubr加入封口，溶液淺綠色。60℃下反應(yīng)3h。得基底-硫酸軟骨素。1%（v/v）氨水中清洗除去多余銅離子。得到表面接枝硫酸軟骨素功能修飾涂層的多孔鈦合金支架材料。

實施例2：表面接枝硫酸軟骨素涂層的多孔鈦合金支架材料

第一步，多孔鈦合金的準(zhǔn)備

多孔鈦合金用3d打印的方式制備，長寬分別為10mm，高5mm。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

多孔鈦合金浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。形成結(jié)構(gòu)為支架-聚多巴胺的基底材料。重復(fù)三次，形成三層聚多巴胺涂層。

第三步，基底的炔基化

基底加入到裝有50mlthf的圓底燒瓶，加入nah250mg，震蕩15min讓氣體排出后，加入炔丙基溴750ul，rt下反應(yīng)24h。取出，用超純水沖洗除去雜質(zhì)。

第四步，硫酸軟骨素的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，加入1g硫酸軟骨素，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的硫酸軟骨素。用截留分子量為1000d的透析袋透析，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和，加入溴化的硫酸軟骨素。60℃下反應(yīng)48h，得硫酸軟骨素-n3，截留分子量為1000d透析袋透析，真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝

1mmol疊氮基-硫酸軟骨素加入到50mldmf，將基底-炔基浸入。加入0.1mmolpmdeta作為配體。冰水浴下，對溶液“抽真空-通氮氣”，3次，在液面下通氮氣30min除盡氧氣。0.1mmolcubr加入封口，溶液淺綠色。60℃下反應(yīng)3h。得基底-硫酸軟骨素。1%（v/v）氨水中清洗除去多余銅離子。得到表面接枝硫酸軟骨素的多孔鈦合金支架材料。

對支架材料的聚多巴胺（pda）涂層接枝硫酸軟骨素（chs）前后的xps圖譜比較，如圖1所示。圖1中清楚顯示，接枝硫酸軟骨素后的支架材料聚多巴胺載藥涂層中出現(xiàn)了硫的2p和2s峰。

在圖2所示的對直接成型后未接枝功能成分的支架的表面和本發(fā)明在支架材料聚多巴胺涂層表面接枝了硫酸軟骨素后的表面的掃描電鏡對比圖片中也清楚顯示，直接成型的支架呈光滑微表面（a），本發(fā)明接枝了硫酸軟骨素后的支架材料則呈粗糙微表面（b）。

實施例3：表面含端炔抗菌藥物特比奈酚涂層的多孔鈦合金支架材料

第一步，多孔鈦合金的準(zhǔn)備

多孔鈦合金用3d打印的方式制備，長寬分別為10mm，高5mm。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

多孔鈦合金浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。重復(fù)三次，形成三層聚多巴胺涂層的基底材料。

第三步，基底的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，基底浸入，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的基底。分別用大量二氯甲烷、丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第四步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝（無銅“點擊反應(yīng)”方法）

1mmol含端炔抗菌藥物特比奈酚加入到50mlpbs溶液中，將疊氮化的基底置入其中。在37℃下，反應(yīng)24h，得到表面接枝有比奈酚的多孔鈦合金支架材料。

實施例4：表面接枝膠原蛋白涂層的聚氨酯pu支架材料

第一步，聚氨酯pu支架的準(zhǔn)備

聚氨酯pu支架用發(fā)泡法制備，長寬分別為10mm，高5mm。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

聚氨酯支架浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。形成結(jié)構(gòu)為支架-聚多巴胺的基底材料。

第三步，膠原蛋白的炔基化

膠原蛋白（分子量3000-10000d）1g，加入50mlthf圓底燒瓶，加入nah250mg，攪拌15min，排出氣體后，加入炔丙基溴750ul，rt下攪拌24h。截留分子量為1000d的透析袋進(jìn)行透析，除去雜質(zhì)，冷凍干燥。

第四步，基底的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，基底浸入，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的基底。分別用大量二氯甲烷、丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝。

1mmol炔基-膠原蛋白加入到50mldmf，將基底-n3浸入。加入0.1mmolpmdeta作為配體。冰水浴下，對溶液“抽真空-通氮氣”，3次，在液面下通氮氣30min除盡氧氣。0.1mmolcubr加入封口，溶液淺綠色。60℃下反應(yīng)3h。得基底-膠原蛋白。1%（v/v）氨水中清洗除去多余銅離子。得到表面接枝膠原蛋白的聚氨酯pu支架材料。

實施例5：表面接枝玻尿酸涂層的聚氨酯pu支架材料

第一步，聚氨酯pu支架的準(zhǔn)備

聚氨酯pu支架用發(fā)泡法制備，長寬分別為10mm，高5mm。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

多孔聚氨酯浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。重復(fù)三次，形成三層聚多巴胺涂層的基底材料。

第三步，玻尿酸的炔基化

玻尿酸（分子量100000-200000da）1g，加入50mlthf圓底燒瓶，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅尤雗ah250mg，攪拌15min后，加入炔丙基溴750ul，rt下攪拌24h。截留分子量為8000-14000da的透析袋進(jìn)行透析，除去雜質(zhì)，冷凍干燥。

第四步，基底的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，基底浸入，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的基底。分別用大量二氯甲烷、丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝。（無銅“點擊反應(yīng)”方法）

1mmol炔基化的玻尿酸加入到50mlpbs溶液中，將疊氮化的基底置入其中。在37℃下，反應(yīng)24h，得到表面接枝有玻尿酸涂層的聚氨酯pu支架材料。

實施例6：接枝有肝素涂層的納米羥基磷灰石/聚氨酯復(fù)合支架材料

第一步，納米羥基磷灰石/聚氨酯復(fù)合多孔支架的制備。

采用脂肪族異佛爾酮二異氰酸酯（ipdi）作為硬段、蓖麻油甘油酯作為軟段合成聚氨酯，通過原位聚合法得到納米羥基磷灰石/聚氨酯多孔支架。

第二步，聚多巴胺涂層制備。

納米羥基磷灰石/聚氨酯復(fù)合多孔支架浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。重復(fù)三次，形成三層聚多巴胺涂層的基底材料。

第三步，肝素的炔基化。

肝素（分子量20000-30000da）1g，加入50mlthf圓底燒瓶，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加入nah250mg，攪拌15min后，加入炔丙基溴750ul，rt下攪拌24h。截留分子量為3500da的透析袋進(jìn)行透析，除去雜質(zhì)，冷凍干燥。

第四步，基底的疊氮基化。

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，基底浸入，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的基底。分別用大量二氯甲烷、丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝。

1mmol炔基化的肝素加入到50mlpbs溶液中，將疊氮化的基底置入其中。在37℃下，反應(yīng)24h，得到表面接枝有肝素涂層的納米羥基磷灰石/聚氨酯復(fù)合支架材料。

實施例7：接枝有硫酸軟骨素涂層的聚已內(nèi)酯（pcl）支架材料

第一步，pcl支架的準(zhǔn)備（

通過靜電紡絲的方法制備pcl支架，體積約0.5cm3。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

將pcl支架浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。重復(fù)三次，形成三層聚多巴胺涂層的基底材料。

第三步，硫酸軟骨素的炔基化

硫酸軟骨素（分子量20000-50000da）1g，加入50mlthf圓底燒瓶，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加入nah250mg，攪拌15min后，加入炔丙基溴750ul，rt下攪拌24h。截留分子量為3500da的透析袋進(jìn)行透析，除去雜質(zhì)，冷凍干燥。

第四步，基底的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，基底浸入，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的基底。分別用大量二氯甲烷、丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝

1mmol炔基化的硫酸軟骨素加入到50mlpbs溶液中，將疊氮化的基底置入其中。在37℃下，反應(yīng)24h，得到表面接硫酸軟骨素涂層的pcl支架材料。

實施例8：接枝有硫酸軟骨素涂層的羥基磷灰石多孔陶瓷支架材料

第一步，ha支架的準(zhǔn)備

配制pva/ha漿料，將pva/ha漿料在60-80℃時持續(xù)攪拌20-30分鐘起泡，倒入模具放入烘箱迅速干燥，3-4個小時后發(fā)泡體定型，然后燒結(jié)成型。

第二步，聚多巴胺涂層制備

將ha支架浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。重復(fù)三次，形成三層聚多巴胺涂層的基底材料。

第三步，硫酸軟骨素的炔基化

硫酸軟骨素（分子量20000-50000da）1g，加入50mlthf圓底燒瓶，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加入nah250mg，攪拌15min后，加入炔丙基溴750ul，rt下攪拌24h。截留分子量為3500da的透析袋進(jìn)行透析，除去雜質(zhì)，冷凍干燥。

第四步，基底的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二氯甲烷，基底浸入，再加1ml三乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1mlbibb（2-溴異丁酰溴），冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。得到表面溴化的基底。分別用大量二氯甲烷、丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝

1mmol炔基化的硫酸軟骨素加入到50mlpbs溶液中，將疊氮化的基底置入其中。在37℃下，反應(yīng)24h，得到表面接枝有硫酸軟骨素涂層的羥基磷灰石多孔陶瓷支架材料。

實施例9：表面接枝硫酸軟骨素涂層的聚酰胺pa支架材料

第一步，聚酰胺pa支架材料的準(zhǔn)備

聚酰胺pa支架用發(fā)泡法制備，長寬分別為10mm，高5mm。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

聚酰胺pa支架在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。形成結(jié)構(gòu)為支架-聚多巴胺的基底材料。重復(fù)三次，形成三層聚多巴胺涂層。

第三步，基底的炔基化

基底加入到裝有50mlthf的圓底燒瓶，加入nah250mg，震蕩15min讓氣體排出后，加入炔丙基溴750ul，rt下反應(yīng)24h。取出，用超純水沖洗除去雜質(zhì)。

第四步，肝素的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二甲基亞砜，加入1g肝素，再加1ml甲基乙胺。置于冰水浴，緩慢滴加1ml氯乙酸，冰水浴中反應(yīng)3h，再室溫下反應(yīng)36h。得到表面氯化的肝素。用截留分子量為1000d的透析袋透析，對沉淀物用二氯甲烷溶解后再用無水乙醇沉淀的方式進(jìn)行反復(fù)純化兩次。取120ml二甲基亞砜（dmso），加入zn(n3)2?2py溶解至飽和，加入氯化的肝素。20℃下反應(yīng)48h，得肝素-n3，截留分子量為1000d透析袋透析，水洗除去雜質(zhì)后真空干燥。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝

1mmol疊氮基-肝素加入到50mldmf，將基底-炔基浸入。加入0.1mmolpmdeta作為配體。冰水浴下，對溶液“抽真空-通氮氣”，3次，在液面下通氮氣30min除盡氧氣。0.1mmolcubr加入封口，溶液淺綠色。60℃下反應(yīng)3h。得基底-硫酸軟骨素。1%（v/v）氨水中清洗除去多余銅離子。得到表面接枝肝素的多孔鈦合金支架材料。

實施例10：表面接枝厄洛替尼涂層的多孔鈦合金支架

第一步，多孔鈦合金支架的準(zhǔn)備

多孔鈦合金用3d打印的方式制備，長寬分別為10mm，高5mm。無水乙醇超聲清洗10分鐘，再用蒸餾水超聲清洗5分鐘，烘干。

第二步，聚多巴胺涂層制備

多孔鈦合金支架浸泡在濃度為2mg/ml鹽酸多巴胺溶液中，溶液中的三羥甲基氨基甲烷（tris）濃度為10mm，ph值為8.5，浸泡時間為48小時，反應(yīng)溫度37℃。涂層沉積結(jié)束后，分別用蒸餾水和無水乙醇超聲清洗5分鐘，并干燥。形成結(jié)構(gòu)為支架-聚多巴胺的基底材料。

第三步，基底羥基的疊氮基化

圓底燒瓶加入30mln,n-二甲基甲酰胺，基底浸入，再加1ml二甲胺。置于冰水浴，緩慢滴加2ml1,3-溴丙烷，冰水浴中反應(yīng)2h，再室溫下反應(yīng)24h。取代羥基得到表面溴化的基底。分別用無水乙醇、超純水超聲清洗15min，真空烘箱中干燥。取80ml二甲基甲酰胺（dmf），加入疊氮鈉粉末溶解至飽和。80℃下反應(yīng)48h，得基底-n3，大量超純水超聲清洗，真空干燥。

第四步，基底氨基的疊氮基化

圓底燒瓶加入30ml二甲基亞砜，基底浸入，加入在50ml二甲基亞砜中溶解有三氟磺酸疊氮（tfn3:cf3son3）或?qū)ο醣降獐B氮（p-no2phso2n3）的溶液，以2wt%cubr2為催化劑，在0℃~室溫下反應(yīng)48小時，得到氨基疊氮基化的基底材料，對得到的疊氮基化基底材料經(jīng)水洗除去雜質(zhì)至洗液無鹵素顯色反應(yīng)后，干燥，其中優(yōu)選真空干燥或冷凍干燥，備用。

第五步，用環(huán)加成反應(yīng)接枝。

1mmol端炔基厄洛替尼加入到50mldmf，將基底-n3浸入。加入0.1mmolpmdeta作為配體。冰水浴下，對溶液“抽真空-通氮氣”，3次，在液面下通氮氣30min除盡氧氣。0.1mmolcubr加入封口，溶液淺綠色。60℃下反應(yīng)3h。得基底-厄洛替尼。1%（v/v）氨水中清洗除去多余銅離子。得到表面接厄洛替尼的多孔鈦合金支架材料。