本發(fā)明屬于生物技術領域和化學領域，具體地，本發(fā)明涉及25-羥基膽甾醇用于制備抗腸道病毒的藥物的用途。

背景技術：

腸道病毒屬(enterovirus)歸類于小核糖核酸(rna)病毒科(picornaviridae)，是一類生物學性狀相似的單股正鏈rna病毒，無包膜，基因組長約7.2-8.4kb。腸道病毒以上呼吸道、咽喉和腸道為侵入門戶，先在局部粘膜和咽、扁桃體等淋巴組織和腸道集合淋巴結中初步增殖，然后釋放入血，形成第一次病毒血癥，擴散至帶有受體的靶組織，再次增殖后，引起第二次病毒血癥和臨床癥狀。多數(shù)腸道病毒的受體在組織和細胞中廣泛分布，包括神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肺臟、胰腺、粘膜、皮膚和其它系統(tǒng)，因此，其疾病范圍廣泛。

人腸道病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)、柯薩奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echovirus)和新腸道病毒，至少有72個血清型。

人腸道病毒71型(enterovirusa71，ev71)的基因組編碼一個長鏈多肽，可劃分為結構蛋白區(qū)p1和非結構蛋白區(qū)p2及p3。p3編碼的病毒蛋白酶3cd對p1進行加工、切割，產(chǎn)生結構蛋白vp0、vp1和vp3，vp0可進一步裂解為vp2和vp4，這些結構蛋白在體內(nèi)共同組裝形成病毒衣殼。ev71病毒是手足口病的主要病原體之一。手足口病主要發(fā)病人群為5歲以下嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，咽喉疼痛，手、足、口腔等部位皮膚和粘膜出現(xiàn)紅斑、水皰乃至潰瘍等損害，重癥ev71感染患者通常會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀，并伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，包括急性遲緩性腦癱、腦炎、腦膜炎、腦干腦炎、腦脊髓炎、脊髓灰質(zhì)炎樣綜合征、無菌性腦膜炎等多種神經(jīng)性疾病和神經(jīng)源性肺水腫、肺出血、呼吸道感染、心血管損傷、心肌炎等并發(fā)癥，少數(shù)ev71感染患者還可發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)造成的腸道出血，與自主神經(jīng)紊亂、炎癥反應有關的輕微的肝功能異常，以及多器官功能衰竭。

ev71對人類的健康，尤其是對嬰幼兒的健康構成了極大的威脅。時至今日，ev71的致病機制并不完全清楚，有效的防控手段依舊有限。日前，全球首個ev71滅活疫苗(人二倍體細胞)獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準生產(chǎn)，該疫苗由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所自主研發(fā)(請參見中國專利cn101402944b)。臨床試驗結果顯示，這種疫苗對ev71引起的手足口病的保護率可達97.3％，對于有效降低我國兒童手足口病的發(fā)病率，尤其是減少該病的重癥及死亡病例，保護兒童生命健康具有重要意義。然而，接下來的問題是，僅僅依靠疫苗是否能實現(xiàn)手足口病的控制。以脊髓灰質(zhì)炎的防控歷史為例，2000年之前，全球范圍通過大規(guī)模的疫苗接種實現(xiàn)了脊髓灰質(zhì)炎的根除，但是近幾年，脊髓灰質(zhì)炎仍然在多個國家和地區(qū)流行。因此，實現(xiàn)腸道病毒的控制不僅僅需要有效的疫苗，抗病毒藥物的輔助也是至關重要的。目前臨床上常使用廣譜的抗病毒藥物以及具有清熱解毒作用的中草藥、中成藥來治療手足口病，仍然缺乏對腸道病毒尤其是ev71病毒更具有針對性的藥物。

人腸道病毒68型(enterovirusd68，ev68)的基因組編碼1個前體多聚蛋白，然后不斷被自身蛋白酶水解切割成結構蛋白vp1-vp4和非結構蛋白2a、2b、2c和3a、3b、3c、3d。ev68病毒感染的常見癥狀有：流鼻涕，打噴嚏，咳嗽，肌肉痛，哮喘，呼吸困難，發(fā)熱，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮膚和/或粘膜出現(xiàn)紅斑、水皰和/或潰瘍，及其他嚴重癥狀等。臨床并發(fā)癥有：上呼吸道感染、毛細支氣管炎、支氣管炎及肺炎、手足口病、皰疹性咽喉炎、胸膜痛、無菌性腦膜炎、松弛性癱瘓、新生兒敗血癥及一些嚴重的慢性病。ev68病毒與重癥呼吸系統(tǒng)疾病有關，可以加劇哮喘和肺炎，引發(fā)高熱昏厥和致死性神經(jīng)系統(tǒng)感染，個別病例感染后可出現(xiàn)心肺功能衰竭和中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，甚至引發(fā)死亡。同時，美國疾病預防控制中心報道了一種以脊髓灰質(zhì)異常和肌肉無力為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，部分患者ev68檢測結果呈陽性。

ev68近年來在全球多地暴發(fā)，并誘發(fā)嚴重的呼吸系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，引起嚴重的感染癥狀。目前尚不完全清楚ev68的病毒學特征和致病機制。liu等人發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物普來可那立(pleconaril)可在細胞內(nèi)阻斷ev68感染，可能成為治療ev68感染的候選藥物(liuy,shengj,etal.structureandinhibitionofev-d68,avirusthatcausesrespiratoryillnessinchildren[j].science,2015,347(6217):71-74)。目前為止沒有特異性針對ev68的疫苗，也沒有獲批的安全抗病毒療法可以在臨床治療中應用，迫切需要研發(fā)特異有效的預防及治療藥物來遏制病毒的危害。

25-羥基膽甾醇(25-hydroxycholesterol，25hc)，也叫25-羥基膽固醇、5-膽甾烯-3β,25-二醇(5-cholestene-3β,25-diol)，化學式為c27h46o2，分子量402.65，cas號為2140-46-7，結構式為：

25-羥基膽甾醇是一類天然氧化固醇，在細胞中廣泛存在，由膽固醇代謝而產(chǎn)生，對細胞內(nèi)脂類代謝及免疫調(diào)節(jié)過程中起重要作用。目前，25-羥基膽甾醇主要用于合成或制備其他膽固醇類化合物，是一種常用的化學中間體。也有研究表明它可用于調(diào)節(jié)膽固醇的積累。在病毒生物學研究領域，有25-羥基膽甾醇可能通過抑制細胞膜融合而阻止某些具有包膜的病毒進入宿主細胞的報道，例如已見報道的病毒有丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)、人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)、寨卡病毒(zikavirus)、尼帕病毒(nipahvirus)、埃博拉病毒(ebolavirus，ebov)等(例如參見yongzhichenetal.,interferon-induciblecholesterol-25-hydroxylaseinhibitshepatitiscvirusreplicationviadistinctmechanisms,scientificreports,2014,4,7242:1-8；chunfenglietal.,25-hydroxycholesterolprotectshostagainstzikavirusinfectionanditsassociatedmicrocephalyinamousemodel,immunity,2017(46):446-456；以及中國專利申請cn105362278a)。但目前尚無25-羥基膽甾醇抗腸道病毒的報道。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，25-羥基膽甾醇能有效抑制ev71病毒的復制，且在感染的不同時間點加入，均能有效的抑制ev71病毒的復制。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，25-羥基膽甾醇對同屬于腸道病毒屬的ev68病毒也具有抑制作用。本發(fā)明揭示，25-羥基膽甾醇有望用于制備新型的抗腸道病毒藥物。

本發(fā)明提供了25-羥基膽甾醇或其藥學上可接受的鹽或酯在制備預防和/或治療腸道病毒感染所致疾病和/或癥狀的藥物中的用途。

此外，本發(fā)明還提供了適于所述藥物的給藥途徑、劑型，所述藥物可包含的其他活性成分以及所述藥物與其他藥物的聯(lián)合用藥。

本發(fā)明還提供了用25-羥基膽甾醇或其藥學上可接受的鹽或酯抑制體外細胞中的腸道病毒的非治療目的的方法。

附圖說明

圖1顯示25hc可以抑制ev71病毒的復制。將不同濃度的25hc加入到rd細胞中，37℃放置1h后，加入1moi的ev71，24h后收獲細胞并提取細胞總rna，通過熒光定量pcr檢測ev71mrna的轉(zhuǎn)錄水平(圖1a)，同時蛋白質(zhì)印跡法(westernblot)檢測ev71結構蛋白的表達水平(圖1b)。

圖2顯示感染不同時間點加入25hc均能抑制ev71病毒的復制。在rd細胞被ev71病毒感染前、感染同時或者感染后加入不同濃度的25hc，感染24h后收獲細胞并提取細胞總rna，進行熒光定量pcr檢測ev71mrna的轉(zhuǎn)錄水平。

圖3顯示25hc可以抑制ev68病毒的復制，但對rsv(respiratorysyncytialvirus，呼吸道合胞病毒，屬于副粘病毒科肺病毒亞科肺病毒屬)的復制沒有影響。將不同濃度的25hc加入到rd細胞中，37℃放置1h后，分別加入不同濃度的ev68(圖3a)、rsv(圖3b)、ev71(圖3c)病毒，24h后收獲細胞并提取細胞總rna，進行熒光定量pcr檢測這3種病毒mrna的轉(zhuǎn)錄水平。

序列表說明

seqidno:1示出了用于檢測ev71或ev68的正向引物。

seqidno:2示出了用于檢測ev71或ev68的反向引物。

seqidno:3示出了用于檢測gapdh的正向引物。

seqidno:4示出了用于檢測gapdh的反向引物。

seqidno:5示出了用于檢測rsv的正向引物。

seqidno:6示出了用于檢測rsv的反向引物。

具體實施方式

本發(fā)明提供了25-羥基膽甾醇或其藥學上可接受的鹽或酯在制備預防和/或治療腸道病毒感染所致疾病和/或癥狀的藥物中的用途。

在本發(fā)明中，“藥學上可接受的鹽”是指25-羥基膽甾醇的相對無毒的鹽，它包括25-羥基膽甾醇的所有可能的藥學上可接受的鹽，這些鹽例如可參見s.m.berge,etal.“pharmaceuticalsalts,”j.pharm.sci.1977,66,1-19。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥學上可接受的鹽包括25-羥基膽甾醇的單獨的鹽，或任何比例的所述鹽的任何混合物。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥學上可接受的鹽包括但不限于：25-羥基膽甾醇的堿金屬鹽，如鈉鹽或鉀鹽；堿土金屬鹽，如鈣鹽或鎂鹽；銨鹽或與提供生理可接受陽離子的有機堿形成的鹽，如與葡糖胺、n-甲基-葡糖胺、二甲基-葡糖胺、乙基-葡糖胺、己二胺、乙醇胺、肌氨酸、賴氨酸、三羥甲基氨基甲烷、氨基二丙醇形成的鹽；或季銨鹽，如與四甲基銨、四乙基銨形成的鹽。

在本發(fā)明中，術語“藥學上可接受的酯”是指在人或其他動物體內(nèi)或體外水解生成25-羥基膽甾醇的所有可能的藥學上可接受的酯。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥學上可接受的酯包括25-羥基膽甾醇的單獨的酯，或任何比例的所述酯的任何混合物。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥學上可接受的酯包括但不限于：25-羥基膽甾醇與羧酸例如甲酸、乙酸、叔丁酸、棕櫚酸、硬脂酸、苯甲酸、苯乙酸形成的酯；與磺酸例如甲磺酸、乙磺酸、乙二磺酸、苯磺酸形成的酯；與氨基酸例如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸形成的酯；以及與無機酸例如磷酸、硫酸、亞硫酸形成的無機酯。

此外，本發(fā)明包括25-羥基膽甾醇的所有可能的前藥。

在本發(fā)明中，術語“前藥”包括25-羥基膽甾醇的藥學上可接受的衍生物，其自身可以是生物學活性或生物學非活性的，但其在體內(nèi)停留期間被轉(zhuǎn)化(例如通過代謝或水解)為25-羥基膽甾醇。前藥的一個實例是25-羥基膽甾醇的酯或磷酸鹽。在本發(fā)明中，術語“前藥”還包括活性成分與任何載體的共價結合形式，這種形式會在體內(nèi)釋放活性成分。例如參見testa,b.andmayer,j.m.,hydrolysisindrugandprodrugmetabolism:chemistry,biochemistry,andenzymology,wiley-vch,zurich,2003；bundgaard,designofprodrugs,elsevier(1985)；以及e.b.roche,bioreversiblecarriersindrugdesign,pergamonpress,1987。

此外，本發(fā)明還包括25-羥基膽甾醇的所有可能的代謝物。

應理解，本領域技術人員可在合成25-羥基膽甾醇的過程中或合成后對25-羥基膽甾醇的結構進行多種改造而不影響其抗腸道病毒的活性，例如將25-羥基膽甾醇上的一個或多個氫原子用相同或不同的鹵素、c1-c6-烷基、c3-8-環(huán)烷基、羥基、酯基、氨基、酰基、磺酰基、亞磺?；然鶊F取代，又如將25-羥基膽甾醇與藥學上常用于綴合以提高化合物穩(wěn)定性、半衰期等的物質(zhì)相綴合。預期所有不顯著影響25-羥基膽甾醇的抗腸道病毒活性的改造都將落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

在本發(fā)明中，術語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘。

在本發(fā)明中，術語“c1-c6-烷基”是指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基。

在本發(fā)明中，術語“c3-8-環(huán)烷基”是指具有3-8個碳原子的環(huán)烷基，包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物用于哺乳動物、人或禽類。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述藥物用于人、牛或豬。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述藥物用于人。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述藥物用于16歲以下的兒童，或者所述藥物用于5歲以下的嬰幼兒。

在本發(fā)明中，術語“腸道病毒”是指屬于小rna病毒科的腸道病毒屬的病毒。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述腸道病毒包括柯薩奇病毒a組16、4、5、7、9、10型，b組2、5、13型；?？刹《竞湍c道病毒68、71型。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述腸道病毒是腸道病毒68型或腸道病毒71型。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述疾病包括腸道病毒71型感染所致疾病，這些疾病包括但不限于手足口病、急性遲緩性腦癱、腦炎、腦膜炎、腦干腦炎、腦脊髓炎、脊髓灰質(zhì)炎樣綜合征、無菌性腦膜炎。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是手足口病。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述癥狀包括腸道病毒71型感染所致癥狀，這些癥狀包括但不限于發(fā)熱，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮膚和/或粘膜出現(xiàn)紅斑、水皰和/或潰瘍等損害，惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀，以及神經(jīng)源性肺水腫、肺出血、呼吸道感染、心血管損傷、心肌炎、腸道出血、肝功能異常以及多器官功能衰竭。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述癥狀包括但不限于發(fā)熱，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮膚和/或粘膜出現(xiàn)紅斑、水皰和/或潰瘍。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述疾病包括腸道病毒68型感染所致疾病，這些疾病包括但不限于上呼吸道感染、毛細支氣管炎、支氣管炎、肺炎、手足口病、皰疹性咽喉炎、胸膜痛、無菌性腦膜炎、松弛性癱瘓、新生兒敗血癥。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述癥狀包括腸道病毒68型感染所致癥狀，這些癥狀包括但不限于：流鼻涕，打噴嚏，咳嗽，肌肉痛，哮喘，呼吸困難，發(fā)熱，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮膚和/或粘膜出現(xiàn)紅斑、水皰和/或潰瘍。

在本文中，“預防”是指減少受試者患上疾病的風險或者延遲受試者患病或延遲癥狀出現(xiàn)時間的預防性干預。

在本文中，“治療”是指改善受試者的疾病或癥狀的發(fā)展狀態(tài)的治療性干預，包括使受試者的疾病或癥狀消退，減緩受試者疾病或癥狀的進程，減輕受試者疾病或癥狀的嚴重程度，或減少導致疾病或癥狀的細胞、生理或生物化學病因或機理。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物包含25-羥基膽甾醇或其鹽或酯中的至少一種作為活性成分。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物包含治療有效量的活性成分。

在本發(fā)明中，術語“治療有效量”是指所包含的活性成分的量能夠有效實現(xiàn)所期望的治療反應并對所治療的受試者沒有毒性。例如，“治療有效量”是指在受試者體內(nèi)足以預防和/或治療腸道病毒感染所致疾病和/或病癥的量，而且在受試者體內(nèi)不引起實質(zhì)的細胞毒作用。活性成分的治療有效量取決于具體的受試者的身體狀況、疾病和/或癥狀的嚴重程度以及同期治療的相互作用等。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物還包含其他活性成分。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述其他活性成分選自以下的一種或多種：抗病毒劑、抗菌劑、止痛劑、退熱劑、抗炎劑、麻醉劑等。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物包含治療有效量的活性成分。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物的活性成分之間發(fā)生或不發(fā)生化學上的結合、稠合、綴合或融合。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物還包含惰性的、無毒的藥學上可接受的輔料。

在本發(fā)明中，“藥學上可接受的輔料”是指相對無毒和無害的輔料，任何由輔料引起的副作用都不會削弱活性成分的有益作用。通過本領域已知的方式將輔料與活性成分結合以將活性成分轉(zhuǎn)化為期望的劑型。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物被配制為速釋、緩釋和定時釋放的劑型。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物經(jīng)口服、腸胃外、局部、經(jīng)眼、口腔、舌下或直腸等途徑給藥。

根據(jù)所期望的給藥途徑，可以將所述藥物根據(jù)本領域已知的方法配制為合適的劑型，例如參見a.r.gennaro,remington:thescienceandpracticeofpharmacy,lippincottwilliams&wilkins,21stedition,2005；和l.v.allen,jr.etal.,ansel’spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,8thedition,philadelphia,pa:lippincott,williams&wilkins,2004。

在一個優(yōu)選的實施方案中，將所述藥物口服給藥，將其配制為固體或液體制劑如膠囊劑、丸劑、片劑、錠劑、糖錠、熔化物、散劑、溶液劑、混懸劑或乳劑。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述藥物作為注射劑型經(jīng)腸胃外途徑即皮下、靜脈內(nèi)、眼內(nèi)、滑膜內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)等途徑給藥。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，用于腸胃外給藥的控釋制劑包括本領域已知的脂質(zhì)體、聚合微球和聚合凝膠制劑。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述藥物制成局部給藥的軟膏劑、透皮貼劑、吸入劑、鼻噴霧劑、栓劑等。

本領域技術人員能夠認識到，在制備本發(fā)明所述藥物時，可以使用本領域常規(guī)使用的輔料將其配制為期望的劑型，這樣的輔料包括但不限于：載體、賦形劑、溶劑、稀釋劑、表面活性劑、增稠劑、調(diào)味劑、防腐劑、緩沖劑、分散劑、潤濕劑、乳化劑、助懸劑、崩解劑、增粘劑、吸附劑、著色劑、抗氧化劑、油、脂肪酸、脂肪酸酯、皂類、洗滌劑、澄清劑、膠囊化試劑、軟膏基質(zhì)、螯合劑、甜味劑、助留劑、氣溶膠噴射劑、空氣置換劑、粘合材料、滲透增強劑、增塑劑、硬化劑、片劑抗粘附劑或拋光劑(例如參見remington'spharmaceuticalsciences,e.w.martin,mackpublishing,easton,pa,19^thedition(1995))。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物包含在試劑盒中。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包含標簽和/或說明書，表明所述藥物的治療目的和/或治療方式。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述藥物與其他藥物聯(lián)合給藥。

所述聯(lián)合不引起不可接受的副作用。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述其他藥物包括其他能夠預防和/或治療腸道病毒感染所致疾病和/或癥狀的藥物。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述其他藥物包括但不限于抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、抗感染藥、解熱鎮(zhèn)痛藥、疫苗、中草藥、中成藥、益生菌、維生素、微量元素。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述其他藥物包括但不限于ev71滅活疫苗、ev71減毒疫苗、丙球蛋白、重組人干擾素、重組人白介素-2、阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林、金霉素軟膏、鹽酸嗎啉胍、阿莫西林、對乙酰氨基酚、蒙脫石散、西地碘含片、魚肝油、板藍根、冰硼散、注射用雙黃連、西瓜霜噴劑、清開靈、蒲地藍、維生素b2、維生素c。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述聯(lián)合給藥可以同時給藥或相繼給藥。

本發(fā)明所述藥物單獨給藥或與其他藥物聯(lián)合給藥時所需的給藥劑量、給藥順序和給藥次數(shù)可以由本領域技術人員通過常規(guī)的治療試驗來確定。

本發(fā)明還提供了用25-羥基膽甾醇或其藥學上可接受的鹽或酯抑制體外細胞中的腸道病毒的非治療目的的方法，所述方法包括：在腸道病毒與細胞接觸之前和/或接觸同時和/或接觸之后，使25-羥基膽甾醇或其藥學上可接受的鹽或酯與細胞接觸；優(yōu)選地，25-羥基膽甾醇或其藥學上可接受的鹽或酯的濃度為1.5-15μm；更優(yōu)選地，25-羥基膽甾醇或其藥學上可接受的鹽或酯的濃度為3-12μm。

其中，對25-羥基膽甾醇及其藥學上可接受的鹽和酯以及腸道病毒的規(guī)定如上文所述。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述抑制包括抑制腸道病毒的復制或腸道病毒引起的細胞病變。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述細胞是人的細胞。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是人橫紋肌肉瘤細胞。

應理解，上文所描述的各組實施方案之間可以任意組合。

下面，通過實施例并結合附圖來示例性的描述本發(fā)明的實施方式，以下實施例是用于解釋、而不是以任何方式限制本發(fā)明。如未特別說明，實施例中所用的試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的檢測方法均為本領域技術人員已知的檢測方法。下面實施例中未注明詳細實驗方法的，按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實驗室手冊(sambrook,etal.newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述方法或試劑制造商提供的方法。

實施例

實施例1.25hc對ev71病毒復制的影響

rd細胞(人橫紋肌肉瘤細胞，購自美國atcc(americantypeculturecollection))經(jīng)不同濃度25hc(h1015，購自美國sigma公司)處理后接種ev71病毒(北京株bj/chn/2008)，通過熒光定量pcr檢測ev71的mrna水平，并通過蛋白質(zhì)印跡法檢測ev71病毒的結構蛋白的表達水平。實驗設3次重復，實驗結果取平均值。具體方法如下：

1.1病毒擴增

取ev71病毒30μl與10％fbs(胎牛血清，購自美國hyclone公司，貨號30396)的dmem培養(yǎng)基(購自美國gibco公司，貨號：c11965500)混合接種于在t75(生長面積75cm²)培養(yǎng)瓶中的80％-90％豐度(單位面積內(nèi)細胞分數(shù)，即細胞在培養(yǎng)板中的伸展密度達到總培養(yǎng)板底面積的80-90％)的rd細胞中，37℃下5％co2孵育，每天通過倒置顯微鏡(型號：7s100，購自日本尼康公司)觀察細胞病變(cytopathiceffect，cpe，表現(xiàn)為細胞間隙變大、細胞變大變圓)。直至80％-90％的rd細胞病變后，收集病變細胞沉淀及上清，于-80℃反復凍融3次，12000rpm離心10min去除細胞碎片，將釋放有病毒的上清分裝，并保存于-80℃中備用。

1.225hc處理rd細胞

在80％-90％豐度的rd細胞中分別加入0μm、1.5μm、3μm、6μm或12μm的25hc(用乙醇配制)，于37℃下5％co2培養(yǎng)1h。

1.3病毒接種

取1moi(multiplicityofinfection，感染復數(shù))ev71病毒與10％fbs的dmem混合接種于細胞中。37℃下5％co2孵育24h后棄掉培養(yǎng)基，收獲細胞，用于后續(xù)的熒光定量pcr和蛋白質(zhì)印跡法檢測。

1.4熒光定量pcr

(1)細胞總rna提?。?/p>

在1.3中收獲的各組細胞中，分別加入1mltrizol(總rna抽提試劑，購自美國invitrogen公司)，室溫放置10min；加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s后室溫放置3min，使其自然分相；4℃下12,000g離心15min，將500μl上清小心轉(zhuǎn)移至新的eppendorf管(無rna酶(rnaase))中，加入等體積的異丙醇，混勻后冰上放置10min；4℃下12,000g離心10min，小心棄上清；向rna沉淀中加入1ml75％乙醇(用不含rna酶的水(購自美國amresco公司，貨號e476)配制)，溫和懸浮沉淀；4℃下7,500g離心5min，小心棄上清，室溫干燥沉淀；向沉淀中加入50μl不含rna酶的水，室溫放置10min，以充分溶解rna，測定濃度為200-300ng/μl(用美國分光光度計測定，型號nd-1000)，分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(rt)：

取2μg的rna與0.5μg的oligo(dt)18(購自日本takara公司，貨號rr52a)混勻，使之總體積為15μl，70℃下5min。冰上放置1min。按照美國promega公司的m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶說明書中提供的逆轉(zhuǎn)錄體系進行逆轉(zhuǎn)錄反應：

將上述兩個體系混勻，42℃下60min。

(3)熒光定量pcr：

以gapdh(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作內(nèi)參，通過熒光定量pcr檢測ev71的mrna水平。

以下引物用于檢測ev71：

正向引物：5'-acatggtgtgaagagyctaytgagct-3'，其中y指簡并堿基，代表c或t，序列如seqidno:1所示；

反向引物：5'-acacggacacccaaagtagtcggttccgc-3'，序列如seqidno:2所示。

以下引物用于檢測gapdh：

正向引物：5'-cggagtcaacggatttggtcgta-3'，序列如seqidno:3所示；

反向引物：5'-agccttctccatggtggtgaagac-3'，序列如seqidno:4所示。

按照日本takara公司的2×sybrpremixextaq(pcr預混液)說明書配置pcr反應體系：

使用熒光定量pcr儀(美國bio-rad公司cfx^tmopticsmodule)進行pcr擴增程序：95℃3min；95℃5s，55℃15s，60℃30s+讀板，共45個循環(huán)；95℃，10s；熔解曲線65℃-95℃，5s遞增+讀板。

(4)數(shù)據(jù)處理

擴增過程及熒光信號檢測、數(shù)據(jù)的存儲和分析均由所述pcr儀及自帶軟件完成。每個樣品定量pcr的ct值減去相應樣品gapdh的ct，樣品擴增的倍數(shù)變化的計算采用2^{^δct}法。

結果如圖1a所示。結果表明，25hc能夠有效抑制ev71病毒的復制，隨25hc濃度的增加，抑制ev71病毒的效果增加，25hc濃度達到3μm時，ev71病毒的復制幾乎已被完全抑制。

1.5蛋白質(zhì)印跡法

以β-肌動蛋白(β-actin)作內(nèi)參，進行蛋白質(zhì)印跡法檢測：

(1)對1.3中收獲的各組細胞分別進行如下處理：每1.5×10⁶個細胞加入100μl1×被動裂解液(passivelysisbuffer，由購自美國promega公司的5×被動裂解液配制：1倍體積的5×被動裂解液加4倍體積的水，混勻后使用)，輕輕混勻，室溫裂解30min；4℃下12000g離心10min，收集上清，用bca蛋白定量方法定量(使用購自美國thermo公司的bca蛋白定量試劑盒(23225)，具體方法參見試劑盒的說明書)細胞裂解液的蛋白濃度，將各個樣品的蛋白濃度調(diào)到一致(2μg/μl)，加入10μl的6×上樣緩沖液(300mmtris-hcl(ph6.8)，600mm二硫蘇糖醇，12％(w/v)sds，0.6％(w/v)溴酚藍，60％(v/v)甘油)制備成蛋白樣品，100℃加熱變性5min后置于-20℃保存；

(2)將蛋白樣品用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)分離，然后經(jīng)400ma恒流將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(nc)膜上；

(3)轉(zhuǎn)膜完成后，將nc膜經(jīng)5％脫脂牛奶/pbst(pbs0.1％tween20)室溫封閉2h，加一抗稀釋液(用5％脫脂牛奶按1:1000稀釋)4℃過夜，然后用1‰tweenpbst洗滌三次，每次5min，加入二抗稀釋液(5％脫脂牛奶按1:10000稀釋)，室溫避光孵育30min；1‰tweenpbst洗滌三次，每次10min；之后用odyssey(美國li-cor公司的雙色紅外激光成像系統(tǒng))進行掃描鑒定。其中，針對ev71結構蛋白和β-肌動蛋白，分別使用的一抗是小鼠抗ev71結構蛋白(mab979，購自美國millipore公司)和小鼠抗-β-肌動蛋白單克隆抗體(a5441，購自美國sigma公司)，分別使用的二抗是抗鼠iggdy800二抗(購自美國li-cor公司，貨號：926-32212)和抗鼠iggdy680二抗(購自美國li-cor公司，貨號：926-68070)。

結果如圖1b所示。結果表明，隨著25hc濃度的增加，ev71結構蛋白vp0和vp2的量逐漸減少。

實施例2.感染不同時間點加入25hc對ev71病毒復制的影響

rd細胞被ev71病毒感染前、感染同時、感染后，分別加入不同濃度的25hc，通過熒光定量pcr檢測ev71的mrna水平。實驗設3次重復，實驗結果取平均值。具體方法如下：

在1moiev71病毒接種之前1h(即感染前)、接種同時(即感染同時)、接種之后1h(即感染后)，分別在rd細胞中加入6.25μm或12.5μm的25hc，各組實驗均設只接種病毒不加25hc的對照。病毒接種方法同實施例1.3。各組在感染后于37℃下5％co2孵育24h，棄掉培養(yǎng)基，收獲細胞。對收獲的各組細胞，通過熒光定量pcr檢測ev71的mrna水平，檢測方法同實施例1.4。

結果如圖2所示。結果表明，在rd細胞感染病毒之前、感染同時、感染之后，25hc均能有效抑制ev71病毒的復制。在感染之前用6.25μm或12.5μm的25hc處理細胞，ev71病毒的復制幾乎被完全抑制；在感染同時用12.5μm的25hc處理細胞，ev71病毒的復制幾乎被完全抑制。

實施例3.25hc對ev68病毒復制的影響

rd細胞經(jīng)不同濃度25hc處理后分別接種ev68病毒(genebank號：kf726085.1)、rsv病毒(rsv-a2株病毒，購自美國atcc)或ev71病毒，通過熒光定量pcr檢測不同病毒的mrna水平。實驗設3次重復，實驗結果取平均值。具體方法如下：

3.1病毒擴增

ev68病毒的擴增方法與ev71的相同，如實施例1.1所述。rsv病毒的擴增方法如下：

hep-2細胞(人喉癌細胞，購自atcc，編號：atccccl-23，細胞濃度1.8×10⁵個/ml)接種于75cm²細胞培養(yǎng)瓶。37℃下co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞匯合率達到60-70％。棄去原培養(yǎng)基，3mlopti-mem(gibco公司產(chǎn)品，貨號：31985-070)洗1次。加入200-250μlrsv毒株和2mlopti-mem，混勻。37℃下co2培養(yǎng)箱中孵育2.5h，每15min搖晃細胞瓶使液體分布均勻。換為維持液(含2％胎牛血清和1％青鏈霉素的opti-mem培養(yǎng)基)，37℃下co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h。至細胞病變明顯且約30％細胞漂浮時，置于乙醇-干冰混合物中速凍，至細胞瓶內(nèi)液體完全凍結。37℃水浴迅速融化，再次置于乙醇-干冰混合物中至細胞瓶內(nèi)液體完全凍結。37℃水浴迅速融化，反復吹打后3000rpm4℃離心10min。取上清，分裝，-80℃保存。

3.225hc處理rd細胞

在80％-90％豐度的rd細胞中分別加入0μm、3μm或12μm的25hc，于37℃下5％co2培養(yǎng)1h。

3.3病毒接種

分別向rd細胞中接種2moi的ev68病毒、或2moi的rsv病毒、或1moi的ev71病毒。3種病毒的接種方法相同，如實施例1.3所述。37℃下5％co2孵育24h后棄掉培養(yǎng)基，收獲細胞。

3.4熒光定量pcr

對收獲的各組細胞，通過熒光定量pcr檢測ev68病毒、rsv病毒和ev71病毒的mrna水平，檢測方法如實施例1.4所述。用于檢測ev68的引物與用于檢測ev71的引物相同，序列如seqidno:1和seqidno:2所示；用于檢測rsv的引物如下：

正向引物：5'-agatcaacttctgtcatccagcaa-3'，序列如seqidno:5所示；

反向引物：5'-ttctgcacatcataattaggagtrtcaat-3'，序列如seqidno:6所示。

3種病毒的檢測結果分別如圖3a、3b、3c所示。結果表明，25hc也能夠有效抑制同屬于腸道病毒屬的ev68病毒的復制，隨25hc濃度的增加，抑制ev68病毒的效果增加；而對于不屬于腸道病毒屬的rsv病毒，25hc對其沒有抑制活性。

以上實施例為示例性實施例，不應理解為對本發(fā)明的限制。本領域技術人員能夠認識到，在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進等，均包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，除非另有定義，本文中應用的全部技術和科學術語均具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員通常所理解的相同的意義。如果出現(xiàn)矛盾，將以本說明書包括的定義為準。本文中所有的出版物、專利申請、專利和文獻的全部內(nèi)容及它們引用的所有出版物、專利申請、專利和文獻均以引用的方式納入本文中。

序列表

<110>中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所

<120>一種羥基膽甾醇25hc及其用途

<130>cp1170200/cb

<160>6

<170>patentin版本3.3

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acatggtgtgaagagyctaytgagct26

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acacggacacccaaagtagtcggttccgc29

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cggagtcaacggatttggtcgta23

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agccttctccatggtggtgaagac24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

agatcaacttctgtcatccagcaa24

<210>6

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ttctgcacatcataattaggagtrtcaat29