本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于硬膜缺損修復(fù)的生物補(bǔ)片及其制備方法。

背景技術(shù)：

硬膜是保護(hù)腦（脊髓）組織和防止腦脊液滲漏的一道重要屏障。硬膜缺損在神經(jīng)外科臨床上頗為常見，創(chuàng)傷、腫瘤侵蝕、炎癥破壞、先天性疾病及顱腦手術(shù)、脊髓手術(shù)等均可造成硬膜缺損，進(jìn)而導(dǎo)致腦脊液滲漏、皮下積血/積液、切口延迂不愈、顱內(nèi)感染、腦組織膨出、癲癇等并發(fā)癥。因而，長期以來，通過手術(shù)修補(bǔ)硬膜，保持硬膜的完整，保護(hù)腦（脊髓）組織，防止腦脊液滲漏，已成為神經(jīng)外科界的共識(shí)。傳統(tǒng)的硬腦膜重建材料主要取自自體組織，材料來源有限，并加重患者的痛苦，近年來人工硬腦膜修補(bǔ)材料已被廣泛接受。

目前，國內(nèi)外已有多種人工硬膜材料進(jìn)入臨床應(yīng)用，大致可分為3類：人工合成材料、同種異體材料和異種生物材料。

人工合成材料，包括不可吸收合成材料和可吸收合成材料。不可吸收的人工合成材料對接受移植的宿主永遠(yuǎn)是異物，植入后可導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)、疤痕或包裹反應(yīng)、機(jī)械壓迫、遲發(fā)性出血、術(shù)腔感染等問題?？晌盏娜斯ず铣刹牧?，存在腦適應(yīng)性差，與腦組織接觸處有慢性纖維化，降解產(chǎn)物易導(dǎo)致炎癥和粘連反應(yīng)等缺點(diǎn)。

同種異體材料，包括異體人硬腦膜、闊筋膜，無細(xì)胞人體真皮等。這類材料經(jīng)多種技術(shù)手段處理滅活，組織相容性好。但是存在一些難以解決的問題，如可能傳播宿主疾病、來源局限、價(jià)格昂貴、倫理問題，以及組織間隙大，易導(dǎo)致腦脊液滲漏等，限制了其應(yīng)用。

異種生物材料，常見來源有牛腱、牛/豬心包、牛/豬的腹/胸膜及豬小腸粘膜下層等，這些動(dòng)物組織去除細(xì)胞成分以及免疫原性之后，所得到的細(xì)胞外基質(zhì)成分，可以開發(fā)出理想的硬膜生物修補(bǔ)材料，但不同來源的產(chǎn)品都各有優(yōu)缺點(diǎn)。

由牛腱提取的膠原膜可用于硬膜缺損修補(bǔ)，國內(nèi)已有數(shù)個(gè)此類產(chǎn)品上市，但此類材料用于硬膜修補(bǔ)存在如下缺點(diǎn)：降解速率過快，組織未長成之前材料已降解；韌性較差，容易破裂；粘附力不夠強(qiáng)，腦脊液可從貼敷周邊的縫隙中滲出，形成積液；貼敷到缺損部位時(shí)被組織液浸潤后，無法調(diào)整位置，對使用者經(jīng)驗(yàn)要求較高。

來自于牛/豬心包、牛/豬腹膜或胸膜的硬膜補(bǔ)片產(chǎn)品具有力學(xué)強(qiáng)度高，致密性好等優(yōu)點(diǎn)。但其加工過程多需經(jīng)環(huán)氧化物或戊二醛等化學(xué)劑處理，存在以下缺點(diǎn)：有潛在的細(xì)胞毒性；使用前需反復(fù)清洗以去除化學(xué)殘留物；降解速率較慢，與組織再生不匹配，可導(dǎo)致纖維化、慢性炎癥反應(yīng)、與顱骨或腦組織粘連等并發(fā)癥；質(zhì)地硬，無法與腦組織表面完美貼合，必須嚴(yán)密縫合。

在異種生物材料中，小腸粘膜下層(smallintestinalsubmucosa,sis)來源的脫細(xì)胞基質(zhì)是目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的最理想的組織修復(fù)材料之一。sis基質(zhì)材料具有以下優(yōu)點(diǎn)：韌性好，克服了牛腱來源提取制得的膠原膜韌性不夠的缺點(diǎn)；無需環(huán)氧化物或戊二醛交聯(lián)，避免了交聯(lián)劑的潛在細(xì)胞毒性；材質(zhì)柔軟，可與腦組織表面完美貼合；可誘導(dǎo)組織生長，組織生長與材料降解同步，吸收完全，組織再生塑性完美。另外，sis中還含有多種生長因子，可以為組織再生創(chuàng)造合適的微環(huán)境，即使經(jīng)過脫細(xì)胞處理的sis仍含有這些生長因子，如fgf-2和tgf-β。這些生長因子在組織的修復(fù)和重構(gòu)中有著重要的促進(jìn)作用，這是其它細(xì)胞外基質(zhì)材料和人工聚合物(如膠原、殼聚糖、聚乳酸和聚羥基乙酸)所不能比擬的。

sis基質(zhì)材料作為一種理想的硬膜替代材料，目前國內(nèi)以該種材料的硬膜補(bǔ)片僅有一家進(jìn)口產(chǎn)品——美國cookbiotechincorporated生產(chǎn)的生物硬腦膜修補(bǔ)片（商品名：biodesignsurgisis）。該產(chǎn)品在歐美國家已占據(jù)10～30％的生物硬腦膜片市場，進(jìn)入我國市場已近10年。但是surgisis的生產(chǎn)工藝（cn102176929b）僅進(jìn)行sds清潔劑、過氧乙酸、異丙醇和堿溶液等處理步驟，雖然考慮了消毒、脫脂等步驟，但未針對性地采用去免疫原性物質(zhì)工藝，導(dǎo)致了細(xì)胞殘留量、dna含量過高，例如surgisis系列產(chǎn)品中的oasis^tm的dna含量為0.42ng/mg（gilberttw,etc,quantificationofdnainbiologicscaffoldmaterials.jsurgres2009,152(1):135–139.），而且對存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的天然抗原成分——α-gal抗原也未考慮。

近年來，國內(nèi)一些廠家對sis產(chǎn)品的制備進(jìn)行了深入研究。發(fā)明專利cn103272275b采用近交系動(dòng)物小腸粘膜下層組織為原料保證了不同批次產(chǎn)品的穩(wěn)定性和統(tǒng)一性，以機(jī)械振蕩與超聲波振蕩工藝去除殘留dna，克服了biodesignsurgisis產(chǎn)品dna殘留量較多的問題，該專利產(chǎn)品的dna殘留量為120±15pg/g，明顯低于biodesignsurgisisdna殘留量的250±45pg/g，但是該專利的脫細(xì)胞和脫脂過程僅采用低濃度的堿溶液在較短時(shí)間內(nèi)處理，脫細(xì)胞和脫脂效果欠佳，并且也未涉及去除α-gal抗原的工藝。發(fā)明專利cn101366975b和cn101366979b對sis材料采用了過氧乙酸消毒、堿溶液脫細(xì)胞、dna酶和α-半乳糖苷酶處理的工藝，雖然考慮了去除免疫原性物質(zhì)dna和α-gal抗原，但其脫細(xì)胞和脫脂工藝僅為短時(shí)間的堿溶液處理，效果欠佳。發(fā)明專利cn103405811b對sis材質(zhì)的處理雖然包括了消毒、胰蛋白酶、dna酶和α-半乳糖苷酶處理等步驟，但是未涉及脫脂工藝。發(fā)明專利cn101433735b對sis材料雖然采用了“過氧乙酸+乙醇”消毒、有機(jī)溶劑脫脂、“高滲處理+胰蛋白酶處理+酸處理+堿處理”脫細(xì)胞以及表面活性劑去垢等工藝，但是該工藝中使用毒性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑脫脂，若有機(jī)溶劑去除不徹底，可有導(dǎo)致組織毒性反應(yīng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)；該工藝中胰蛋白酶濃度過高且處理時(shí)間過長，可能會(huì)破壞細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)；而且此發(fā)明工藝并未涉及去除dna和α-gal抗原的步驟。

綜上所述，目前sis制備過程尚未有一種能完整地考慮去除殘留細(xì)胞、脂質(zhì)、dna和α-gal抗原等免疫原性物質(zhì)的工藝，可引起產(chǎn)品免疫原性物質(zhì)含量過高，易導(dǎo)致植入體內(nèi)后發(fā)生免疫毒性反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有硬膜生物補(bǔ)片制備技術(shù)的不足，提供一種使用sis制備、免疫原物質(zhì)含量低、能保留天然細(xì)胞外基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的硬膜生物補(bǔ)片及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明使用sis制備硬膜生物補(bǔ)片的制備方法，采用了預(yù)處理、消毒、脫脂、脫細(xì)胞、去dna、去α-gal抗原、冷凍干燥和滅菌等工藝處理。

上述硬膜生物補(bǔ)片的制備方法，具體步驟如下：

下面步驟中，除特別說明之外，sis材料與溶液的比例均在1:5~1:20（v/v）之間。

（1）預(yù)處理

取新鮮屠宰動(dòng)物的豬小腸組織清洗潔凈，置于0.01%~0.5%醋酸溶液浸泡10~120min，去腥，使用物理刮除法除去豬小腸空腸的粘膜層、肌層、漿膜層、淋巴結(jié)，分離出粘膜下層，切成片段，使用純化水沖洗至少3遍。

（2）消毒

使用濃度為0.5～1.5％的過氧乙酸和濃度為15～25％的乙醇的混合水溶液，超聲條件下，室溫浸泡30~120min，進(jìn)行消毒。之后使用純化水超聲清洗至少3遍。

（3）脫脂

使用濃度為90-100%的乙醇，超聲條件下，常溫浸泡0.5-12h。之后使用純化水超聲清洗至少3遍。

（4）脫細(xì)胞、去dna和去α-gal抗原

使用含0.01～0.10％胰蛋白酶和含0.01～0.05%edta的混合水溶液，超聲條件下，于36±2℃條件下浸泡15-40min。之后使用pbs超聲清洗至少3遍；

使用含0.05～10u/mldna酶的水溶液，超聲條件下，于36±2℃條件下浸泡15-40min。之后使用pbs漂超聲清洗至少3遍；

使用含0.05～10u/mlα-半乳糖苷酶的水溶液，超聲條件下，于20-37℃條件下浸泡15-40min。之后使用pbs超聲清洗至少3遍；

使用濃度為5-40mm的naoh水溶液，超聲條件下，常溫浸泡20-60min。之后使用pbs超聲清洗直至中性。

（5）凍干、滅菌

將sis片材3～12層疊加，固定于模具上，冷凍干燥后，裁剪成臨床使用所需規(guī)格，采用pet包裝袋進(jìn)行包裝，最后進(jìn)行輻照滅菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

采用了系統(tǒng)的去除免疫原性物質(zhì)工藝，包括使用乙醇處理去除脂質(zhì)、使用胰蛋白酶和堿溶液處理脫細(xì)胞，使用dna酶處理去除dna，使用α-半乳糖苷酶處理去除α-gal抗原等步驟。與已有類似產(chǎn)品相比，免疫原物質(zhì)含量更低，如殘留細(xì)胞量不大于1個(gè)/鏡下視野（400×）、dna殘留量不大于120pg/g、α-gal抗原為陰性（免疫熒光檢測法）、脂質(zhì)含量不大于0.1%，所以植入體內(nèi)后生物相容性更好，免疫排斥反應(yīng)更低，安全性更好。

本發(fā)明所使用的酶處理方法，其濃度和作用時(shí)間既能有效去除免疫原性物質(zhì)又不會(huì)破壞細(xì)胞外基質(zhì)正常結(jié)構(gòu)，產(chǎn)品掃描電鏡下顯示膠原纖維束結(jié)構(gòu)完整；阻水性檢測顯示具阻止液體通過作用；用于比格犬硬腦膜缺損修補(bǔ)時(shí)可有效防止腦脊液滲漏，且植入材料跟周圍正常組織相容性好。

本發(fā)明的硬膜生物補(bǔ)片由3～12層單層sis構(gòu)成，用于硬膜缺損修補(bǔ)時(shí)，短期可提供一個(gè)良好的致密性屏障以防止腦脊液滲漏；長期可作為組織支架誘導(dǎo)硬膜組織長入，逐漸與周圍硬膜組織形成一個(gè)整體，修復(fù)缺損，防止腦脊液滲漏，同時(shí)補(bǔ)片逐步降解，組織再生與補(bǔ)片降解速度同步。

附圖說明

圖1所示的是本發(fā)明實(shí)施例1的樣品圖。

圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例1的切片he染色圖。

圖3所示的是本發(fā)明實(shí)施例1的電鏡掃描圖。

圖4所示的是本發(fā)明實(shí)施例1的用于比格犬硬腦膜修補(bǔ)術(shù)的組織切片圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。

實(shí)施例1

（1）預(yù)處理

取新鮮屠宰動(dòng)物的豬小腸組織清洗潔凈，置于0.5%醋酸溶液浸泡30min，豬小腸與醋酸溶液的比例為1:5，使用物理刮除法除去豬小腸空腸的粘膜層、肌層、漿膜層、淋巴結(jié)，分離出粘膜下層，切成片段，使用純化水沖洗3遍。

（2）消毒

使用含有1.0％過氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，sis材料與混合水溶液的比例為1:10，超聲條件下，室溫浸泡100min，進(jìn)行消毒。之后使用純化水超聲清洗3遍。

（3）脫脂

使用濃度為95%的乙醇，sis材料與乙醇的比例為1:10，超聲條件下，常溫浸泡2h。之后使用注射用水超聲清洗3遍。

（4）脫細(xì)胞、去dna和去α-gal抗原

使用含0.02％胰蛋白酶和含0.02%edta的混合水溶液，sis材料與胰蛋白酶/edta溶液的比例為1:5，超聲條件下，于37℃條件下浸泡30min。之后使用pbs超聲清洗3遍；

使用含5u/mldna酶的水溶液，sis材料與dna酶溶液的比例為1:5，超聲條件下，于37℃條件下浸泡20min。之后使用pbs漂超聲清洗3遍；

使用含5u/mlα-半乳糖苷酶的水溶液，sis材料與α-半乳糖苷酶溶液的比例為1:5，超聲條件下，于30℃條件下浸泡20min。之后使用pbs超聲清洗3遍；

使用濃度為25mm的naoh水溶液，sis材料與naoh溶液的比例為1:20，超聲條件下，常溫浸泡50min。之后使用pbs超聲清洗直至中性。

（5）凍干、滅菌

將sis材料4層疊加，固定于模具上，冷凍干燥，裁剪成4cm×7cm規(guī)格，采用pet包裝袋進(jìn)行包裝，最后進(jìn)行輻照滅菌。產(chǎn)品如圖1所示。

實(shí)施例2：對實(shí)施例1制備得到的樣品進(jìn)行物理性能檢測、化學(xué)性能檢測、組織學(xué)檢測、生長因子檢測、生物學(xué)性能檢測和動(dòng)物試驗(yàn)。

1.物理性能檢測

1）阻水性

方法：參照《yy/t0471.3-2004接觸性創(chuàng)面敷料試驗(yàn)方法第3部分：阻水性》的方法進(jìn)行檢測。

結(jié)果：具有阻水性。

2）縫合強(qiáng)度

方法：用3-0非吸收縫合線在補(bǔ)片兩邊中央距邊緣2mm處縫合，將縫合線另一端與樣品的另一端分別固定在拉力儀兩端上，以20mm/min的速度進(jìn)行拉伸，直到縫合點(diǎn)被撕裂，記錄最大力值。按上述方法對3批樣品進(jìn)行檢測。

結(jié)果：縫合強(qiáng)度在3n~5n范圍。

3）拉伸強(qiáng)度

方法：將樣品沿兩個(gè)方向分別裁剪為寬度為10mm形狀；裁剪后在相對濕度40%~60%、溫度22±2℃環(huán)境內(nèi)放置2小時(shí)后進(jìn)行試驗(yàn)。夾具間距為25mm，將試樣兩端固定在拉伸試驗(yàn)機(jī)的夾頭上，以100mm/min的速度拉伸，記錄斷裂時(shí)的最大力值。按上述方法對3批樣品進(jìn)行檢測。

結(jié)果：拉伸強(qiáng)度在30n~35n范圍。

4）頂破強(qiáng)度

方法：按照《yy0500-2004心血管植入物人工血管》8.3.3.2探頭破裂強(qiáng)度的測量方法選取9.5mm直徑探頭進(jìn)行檢測。按上述方法對3批樣品進(jìn)行檢測。

結(jié)果：頂破強(qiáng)度在85n~90n范圍。

2.化學(xué)性能檢測

1）酸堿度

方法：按照《gb/t14233.1醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第1部分：化學(xué)分析方法》中規(guī)定的酸堿度方法進(jìn)行。

結(jié)果：檢驗(yàn)液與空白對照液的ph值之差不超過1.5。

2）細(xì)菌內(nèi)毒素

方法：按照gb/t14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分:生物學(xué)試驗(yàn)方法》中規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)方法進(jìn)行。

結(jié)果：細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于2.15eu/片，符合與腦脊液接觸醫(yī)療器械對細(xì)菌內(nèi)毒素限量的要求。

3）dna殘留量

方法：依據(jù)yy/t0606.25-2014《動(dòng)物源性生物材料dna殘留量測定法：熒光染色法》進(jìn)行檢測。

結(jié)果：dna殘留量為80±12pg/g。

4）α-gal抗原含量

方法：將樣品用多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，片厚3微米。利用生物素標(biāo)記bsi-b4與α-gal抗原的特異親和特性進(jìn)行免疫組化反應(yīng)。染色結(jié)果判定：深棕黃色顆粒為強(qiáng)陽性（+++），棕黃色顆粒為陽性（++），黃色顆粒為弱陽性（+），未見著色為陰性（-）。

結(jié)果：為陰性（-）。

5）脂質(zhì)含量

方法：參照《gb/t5009.6食品中脂肪的測定》中索氏抽提法進(jìn)行測定。

結(jié)果：脂質(zhì)含量為0.08%。

3.組織學(xué)檢測

1）光學(xué)顯微鏡觀察

方法：用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切成0.4微米的薄片，經(jīng)二甲苯脫蠟、系列酒精脫水，蘇木精—伊紅染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞殘留情況和基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)。

結(jié)果：無細(xì)胞和細(xì)胞碎片殘留；膠原纖維連續(xù)，無斷裂，如圖2所示。

2）超微結(jié)構(gòu)觀察

方法：使用電子掃描鏡進(jìn)行掃描。

結(jié)果：材料呈多孔結(jié)構(gòu)，膠原纖維無斷裂，如圖3所示。

4.生長因子檢測

方法：將組織搗碎后使用采用ellisa法檢測成纖維細(xì)胞生長因子的含量，具體操作方法詳見試劑盒使用說明書。

結(jié)果：含量為9540-9937pg/g。

5.生物學(xué)性能檢測

方法：參照gb/t16886系列方法進(jìn)行試驗(yàn)。

結(jié)果：細(xì)胞毒性反應(yīng)小于或等于1級；無遲發(fā)型超敏反應(yīng)；皮內(nèi)反應(yīng)顯示試驗(yàn)樣品與溶劑對照平均記分之差小于1.0；無致熱性；無溶血反應(yīng)；遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變（ames）試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)、小鼠淋巴瘤試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)、無染色體畸變性；無急性全身性毒性反應(yīng)；無亞慢性全身性毒性；肌肉植入30天、60天、90天跟陰性對照品的組織反應(yīng)無明顯區(qū)別。

6.動(dòng)物試驗(yàn)

方法：采用庫克（cook）生物技術(shù)公司生產(chǎn)的生物硬腦膜修補(bǔ)片（注冊證編號：國食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2014第3462661號）作為對照，應(yīng)用硬膜生物補(bǔ)片進(jìn)行beagal犬硬腦膜缺損修補(bǔ)術(shù)。

結(jié)果：植入3個(gè)月后，植入材料與正常硬腦膜邊界不清，已融合在一起；植入材料纖維已被新生組織替代；植入材料部位與正常硬腦膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別，可見纖維母細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等細(xì)胞存在，可見毛細(xì)血管生成；蛛網(wǎng)膜和腦組織正常。硬膜生物補(bǔ)片修補(bǔ)硬腦膜缺損3個(gè)月的組織切片如圖4所示。

本發(fā)明的上述實(shí)施例是對本發(fā)明的說明而不能用于限制本發(fā)明，與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。