本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2013年4月23日、發(fā)明名稱(chēng)為“作為骨移植替代物的含有部分脫乙酰殼多糖的自硬化生物活性接合劑組合物”的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)no.201380029068.6的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明在骨折和骨缺陷的醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)，其涉及部分脫乙酰殼多糖的化合物和組合物，及其醫(yī)學(xué)用途。發(fā)明背景當(dāng)疾病或創(chuàng)傷引起骨骼空洞時(shí)，或無(wú)論何時(shí)骨折的愈合受損時(shí)，通常的外科手術(shù)技術(shù)涉及從髂骨收集骨頭并且將骨移植物轉(zhuǎn)移至受傷部位。將這稱(chēng)為骨自體移植。自體移植用于填補(bǔ)骨空洞，提供了損傷有效愈合需要的骨傳導(dǎo)和骨生成特性。通常認(rèn)為這種技術(shù)是整形外科手術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于與骨收集相關(guān)的頻繁發(fā)病，帶來(lái)了嚴(yán)重的缺陷。因此，工業(yè)和學(xué)術(shù)界同樣針對(duì)消除對(duì)骨自體移植的需求，需要具有骨傳導(dǎo)和骨生成特性的骨移植替代物。這樣的骨移植替代物通常稱(chēng)為合成骨移植替代物。迄今為止，沒(méi)有出現(xiàn)單一的產(chǎn)品證明能給實(shí)質(zhì)性地骨缺陷損傷側(cè)提供了骨傳導(dǎo)性以及骨生成特性。殼多糖是從甲殼動(dòng)物殼獲得的天然生物聚合物，但也可以獲自其他無(wú)脊椎動(dòng)物和真菌。通過(guò)殼多糖聚合物的n-乙酰葡糖胺殘基的脫乙酰，通常通過(guò)用濃堿水解n-乙酰連接，獲得殼聚糖。根據(jù)定義，殼聚糖通常描述為d-葡糖胺(d)和n-乙酰-d-葡糖胺(a)的共聚物，其不溶于ph高于6.2(游離胺基的等電點(diǎn))的水中，但在低于約6.2的ph下溶解。通常，常規(guī)殼聚糖共聚物中約75-100％單體單元是d-葡糖胺，可以將其描述為75-100％脫乙酰殼聚糖，或具有75-100％的脫乙酰程度(dd)。因此，這樣的材料中的0-25％單體是n-乙酰-d-葡糖胺基因(a)。當(dāng)脫乙酰的程度低于約75％時(shí)，殼多糖聚合物呈現(xiàn)出不同的溶解特性，這樣具有從約75％降至約40％dd的材料通常稱(chēng)為部分脫乙酰殼多糖，在本文中稱(chēng)為pdc。本發(fā)明的發(fā)明人之前已經(jīng)描述了部分脫乙酰殼多糖聚合物和寡聚物的生物特性。wo03/026677描述了pdc寡聚物用于治療類(lèi)風(fēng)濕性病癥的用途。wo2006/134614討論了部分脫乙酰殼多糖聚合物和寡聚物的生物特性，并且討論了這樣的寡聚物怎樣作為殼多糖酶的阻斷劑。chaecho等(j.craniofacialsurgeryvol.16no2，2005年3月)描述了使用含有殼聚糖-硫酸鈣復(fù)合物的固體小球的實(shí)驗(yàn)及其對(duì)兔子中有缺陷的脛骨的骨生成的作用，使用具有90％dd的殼聚糖。yamada等，(j.biomed.matresearchvol.66ano.3，2003年9月1日，pp500-506)研究和討論了殼聚糖對(duì)生物礦化作用的效果，并且研究了補(bǔ)充至培養(yǎng)基中的殼聚糖對(duì)成骨細(xì)胞的作用。klokkevold等(jperiodontol.1996年11月；67(11):1170-75)評(píng)價(jià)了殼聚糖對(duì)成骨祖細(xì)胞分化的作用。wo2004/028578公開(kāi)了用于刺激骨-形成和骨-固結(jié)的組合物，其包含骨形態(tài)形成蛋白(bmp)作為制劑中的活性成分，使用三聚磷酸鹽和殼聚糖的溶液，其中兩種溶液將在混合時(shí)立即固化，在臨床中引起特定的操作問(wèn)題。wo01/41822描述了自膠凝礦物質(zhì)-聚合物混合制劑，其包含(i)包含溶解的殼聚糖并且具有6.5至7.4ph的水基熱膠凝液體成分，和(ii)包含鈣的固體成分，所述液體和固體成分混合在一起形成非硬化熱膠凝組合物，其在體溫下形成凝膠。wo2006/057011公開(kāi)了以1:1比例共同沉淀的羥磷灰石和殼聚糖的固體植入物(殼聚糖具有87％的脫乙酰程度)，以及具有“油灰”-樣稠度的組合物，含有總共5％殼聚糖、磷酸鈣和聚二甲基硅氧烷，并且固液比為2:1。油灰-糊狀物的凝固時(shí)間短于6分鐘。測(cè)試了糊狀物用于愈合大鼠中的誘導(dǎo)性骨損傷。本領(lǐng)域通常認(rèn)為殼聚糖自身不是骨傳導(dǎo)性的(參見(jiàn)，例如，venkatesan和kim，“chitosancompositesforbonetissueengineering-anoverview(用于骨組織工程化的殼聚糖組合物-綜述”，mardrugs2010；8(8)：2252-2266。為了有效且低成本的骨愈合治療，仍然很重視可替換的且更有效的，臨床應(yīng)用實(shí)用的產(chǎn)品的進(jìn)一步研發(fā)。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)仔細(xì)地研究了部分脫乙酰殼多糖(pdc)聚合物和寡聚物的生物作用，并且研發(fā)了新的且有效的刺激新骨組織再生的組合物。本發(fā)明提供了可注射的原位自硬化生物活性接合劑材料。本發(fā)明的組合物可用作人工骨移植替代物。組合物具有幾個(gè)實(shí)際益處，如：-天然和無(wú)毒成分，在混合過(guò)程中沒(méi)有冒煙或臭味，-良好的生物相容性且避免了宿主組織對(duì)外來(lái)物體的反應(yīng)，-在固化過(guò)程中產(chǎn)熱低，-允許空洞的注射和填補(bǔ)，沒(méi)有任何相關(guān)滲漏，-良好的可塑性和可注射性，這使得允許使用最小入侵的技術(shù)(注射)來(lái)應(yīng)用，-粘結(jié)性和良好的潤(rùn)濕區(qū)域的特性，允許注入潮濕的環(huán)境中，而沒(méi)有過(guò)度分解或丟失完整性，-合適的工作時(shí)間，允許合適的施用時(shí)間，在原位具有相對(duì)快速的固化，-原位固化時(shí)接近生理ph和鹽度，-良好的散裝容積，允許液體成分(如，血液或血液成分、骨髓或蛋白質(zhì)分離物的溶液等)的混合。-防止受損的宿主骨組織中疤痕組織形成，并且促進(jìn)空洞填補(bǔ)組合物的表面上和內(nèi)部的新骨組織的再生。-具有有益的抗微生物特性，并且因此有助于最小化感染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的新組合物依賴(lài)于pdc的特性，這取決于脫乙酰的程度和分子量，并且使用具有40-75％范圍脫乙酰程度的pdc。其他參數(shù)可以合適地優(yōu)化，如本文中進(jìn)一步描述的。本發(fā)明的組合物作為試劑盒來(lái)提供，其具有包含pdc的固體部分和液體部分，在使用前混合?；旌系慕M合物含有在1:1.2至1:6范圍中，并且更優(yōu)選在1:1.5至1:4的范圍中的低固液比。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于愈合骨缺陷和病癥(如，骨折)的方法。附圖簡(jiǎn)述圖1：用于測(cè)量粘結(jié)性/分層的設(shè)置的說(shuō)明。(1)水位，(2)接合劑組合物，(3)網(wǎng)。圖2：具有不同脫乙酰程度(dd)的組合物的注射強(qiáng)度/阻力的測(cè)量，參見(jiàn)實(shí)施例2。圖3：本發(fā)明的接合劑組合物的抗壓強(qiáng)度，使用不同的脫乙酰程度和不同含量的pdc。圖4：用于微-ct分析的下頜骨體積的標(biāo)準(zhǔn)化(參見(jiàn)實(shí)施例3)。包圍下頜骨的整個(gè)后部的較大圓柱體(lc)和包圍植入的組合物的小圓柱體(sc)的方向。圖5：在植入后7天沿著大鼠下頜骨的表面形成的總體積，與第0天的總體積進(jìn)行比較(0d70dd)。7-8個(gè)個(gè)體的平均和sem(實(shí)施例3)。圖6：手術(shù)后14天，通過(guò)植入了70％dd聚合復(fù)合物的大鼠的下頜骨的橫截面。截面在鉆孔前面的1-2mm。上圖顯示了下頜骨的h&e染色的石蠟切片。下圖呈現(xiàn)了通過(guò)相同下頜骨的相同區(qū)域的微-ct構(gòu)造的橫截面(參見(jiàn)實(shí)施例3)。圖7：在右腿脛骨中接受了本發(fā)明的組合物的綿羊脛骨左腿中的空洞的微ct構(gòu)造。該圖表示了手術(shù)后3個(gè)月后三個(gè)不同平面(x、y和z)中的橫截面(參見(jiàn)實(shí)施例4)。該圖顯示了怎樣形成與鉆孔同心的具有不同半徑的實(shí)際圓柱體。圖8：體內(nèi)手術(shù)后3個(gè)月，三個(gè)不同平面(x、y和z)中接受了本發(fā)明組合物的右腿脛骨的微ct構(gòu)造。貫穿植入組合物的內(nèi)部，與礦化組織的分散島一起，沿著組合物的表面，可以注意到密集的礦化組織。圖9：本發(fā)明的植入組合物內(nèi)部，具有2mm半徑的實(shí)際球體內(nèi)部形成了礦化(每mm3)。(參見(jiàn)實(shí)施例4)。圖10：實(shí)際圓柱體r3和實(shí)際外殼r4-r3、r5-r4和r6-r5中的骨礦化(每mm3)。(參見(jiàn)實(shí)施例4)?？斩从蒭來(lái)表示，填補(bǔ)了本發(fā)明組合物的空洞由br來(lái)表示。圖11：本發(fā)明的植入組合物的顯微圖像顯示出植入組合物內(nèi)部新骨的形成(參見(jiàn)實(shí)施例4)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了易于使用的適用于骨外科手術(shù)的試劑盒，其包含分開(kāi)包裝并且通過(guò)γ照射滅菌的固體和液體部分。就在手術(shù)前，將液體部分與固體部分混合，產(chǎn)生液體或糊狀接合劑。接合劑混合物可以方便地注入骨空洞或骨折中，并且具有良好的可塑性和良好的粘結(jié)性。其還允許使用最小入侵的技術(shù)，如通過(guò)針的注射在骨中應(yīng)用。在其他實(shí)施方案中，將組合物施用于現(xiàn)有的骨表面上，例如，使用抹刀或類(lèi)似工具來(lái)施用。如本文中所解釋的，將本發(fā)明的組合物優(yōu)化，通過(guò)刺激成骨細(xì)胞在植入的復(fù)合材料的表面和內(nèi)部停留并增殖，來(lái)提供骨缺陷的機(jī)械支持并且增強(qiáng)新骨組織的再生。如就ph和鹽度而言，通過(guò)形成理想的生理?xiàng)l件，和通過(guò)控制固液比的促進(jìn)細(xì)胞滲透和復(fù)合物的生物降解性/再吸收，來(lái)獲得這一效果。本發(fā)明進(jìn)行了優(yōu)化，以控制植入的復(fù)合物的物理化學(xué)和生物特性。這可以涉及以下的一種或多種：通過(guò)組合物的酸(其優(yōu)選是磷酸)和部分脫乙酰的殼多糖的緩沖能力控制ph，通過(guò)仔細(xì)選擇電解質(zhì)來(lái)控制離子強(qiáng)度以及通過(guò)合適調(diào)節(jié)pdc聚合物的脫乙酰程度和組合物中的pdc的相對(duì)含量控制水結(jié)合能力/潤(rùn)濕區(qū)域特性和注射力。通過(guò)免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性家族18種殼多糖酶，在原位水解pdc，獲得了成骨細(xì)胞的生物刺激物。這得到了我們?cè)趯?shí)施例3中進(jìn)一步顯示和討論的數(shù)據(jù)的支持(參見(jiàn)實(shí)施例3“結(jié)果”)。這將產(chǎn)生pdc寡糖的生物活性分子物質(zhì)的持續(xù)釋放。因此，這些寡聚分子將隨著復(fù)合材料分解而逐漸釋放，并且擴(kuò)散至鄰近組織中，提供了成骨細(xì)胞的持續(xù)刺激，侵襲退化的復(fù)合物，其又將被新的骨組織替代。對(duì)于這個(gè)完整過(guò)程的優(yōu)化，固液比起著關(guān)鍵作用。因此，為了優(yōu)化以上特性，已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)了混合的組合物含有約1:1.2至約1:6范圍的低的固液比是有利的。這對(duì)應(yīng)于組合的混合物中約14wt％至45wt％固體部分的范圍。優(yōu)選，組合物具有約1:1.3至約1:4范圍的固液比或約1:1.3至約1:3的范圍，并且更優(yōu)選在約1:1.5至約1:3的范圍中，如在約1:2至約1:3的范圍中，包括但不限于1:1.2、1:1.33、1:1.15、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:3和1:4的比例。(這些比例對(duì)應(yīng)于組合混合物中44.4％、42.9％、40％、35.7％、33.3％、30.8％、28.6％、25％和20％的固體部分的重量含量)。具有優(yōu)選的固液比(s/l)的接合劑組合物在人體中具有良好的粘結(jié)性(顯示出少的分層)和良好的潤(rùn)濕區(qū)域特性，具有最小的分解，意味著材料維持其完整性，并且沒(méi)有從注射位點(diǎn)擴(kuò)散出來(lái)。這允許良好的空洞填補(bǔ)能力，包括滲入海綿狀和多孔的骨中，對(duì)骨組織兼具有最初的和長(zhǎng)期的粘附性。盡管低s/l比例可能導(dǎo)致接合劑降低的機(jī)械強(qiáng)度，優(yōu)化的s/l比和殼聚糖含量促進(jìn)了更快的接合劑降解，允許細(xì)胞更有效地滲入復(fù)合物中，并且成骨pdc和羥磷灰石可用于早期開(kāi)始的骨再生。因此，低的初始機(jī)械強(qiáng)度得到早期開(kāi)始的骨生成的補(bǔ)償，并且隨后新骨的形成，快速獲得了機(jī)械負(fù)荷?？梢砸愿鞣N方式評(píng)價(jià)機(jī)械強(qiáng)度，其中一些描述于所附實(shí)施例1中。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物具有在鹽水溶液(0.9％nacl)中在37℃下24h固化后作為最終抗壓強(qiáng)度測(cè)量的機(jī)械強(qiáng)度，在0.2至10n/mm2的范圍中，如在0.5-5n/mm2的范圍中，或在0.5-2.5n的范圍中。作為所需的組合物的低s/l比的結(jié)果，本發(fā)明的固化接合劑組合物將具有相當(dāng)大含量的游離水，表示所形成的復(fù)合植入物開(kāi)放、多孔性質(zhì)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在固化后具有約40-90％范圍，或更優(yōu)選，40-70wt％范圍，如50-70wt％，如約55-65wt％，并且更優(yōu)選60-65wt％，如約60wt％的游離水含量(通過(guò)在105℃下干燥24h釋放的水)。這些值是指在體外形成的、在鹽水溶液中固化24h(0.9％nacl)接合劑中測(cè)量的游離水含量。通常，s/l比越低，固化復(fù)合物干燥過(guò)程中失水量越多。例如，2的s/l比可以導(dǎo)致約60±5％固化濕重的失水量?？梢砸愿鞣N方式評(píng)價(jià)粘結(jié)性/分解或完整性丟失。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通過(guò)將一定量的新鮮混合的組合物置于在含有鹽溶液的燒杯中的液體表面下的網(wǎng)上(例如，大約1mm網(wǎng))，對(duì)于評(píng)價(jià)這種特性是有用的，其中用磁棒攪拌溶液。(參見(jiàn)實(shí)施例1中的更多描述)。優(yōu)選，在短時(shí)間攪拌后，如10min，基本上所有的材料，如超過(guò)95％，或更優(yōu)選，超過(guò)98％，并且再更優(yōu)選，超過(guò)99％，并且最優(yōu)選，超過(guò)99.9％仍然粘附。混合的組合物接合劑優(yōu)選具有接近于中性的ph，或在約6.0至7.8的范圍中，并且更優(yōu)選在6.5至7.4的范圍中，最優(yōu)選約ph7。含有磷酸鈣的固體部分通常基本上是堿性的，而為了中和堿性磷酸鹽，液體部分通常是酸性的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，液體部分包含一種或多種酸，所述酸選自但不限于磷酸、鹽酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、甲酸、丙酸、蘋(píng)果酸和谷氨酸。足以中和混合組合物的酸的合適濃度/含量取決于組合物的s/l比、磷酸鹽的含量以及pdc的dd。使用較低的s/l比(固體較少)，需要較少含量的酸。本發(fā)明實(shí)施方案中優(yōu)選的酸是磷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，液體成分包含至少約5％磷酸，如約2.5-20wt％磷酸，如2.5-15wt％，或5-15％，如約5％，約8％，約10％，約12％或約15％。在其他有用的實(shí)施方案中，液體部分包括一種或多種其他的酸，作為磷酸的替換或除了磷酸以外另外的酸，如上述任一種或多種酸。在這些實(shí)施方案中，酸的總量應(yīng)當(dāng)優(yōu)選在混合堿性固體部分和液體部分后足以中和溶液。因此，優(yōu)選酸度至少與5％磷酸溶液的相同。因此，液體部分可以合適地具有約1至2.5，并且更優(yōu)選約1至2范圍的ph。在其他實(shí)施方案中，可以通過(guò)在液體部分中提供具有5％磷酸溶液當(dāng)量濃度(n)的含量的酸來(lái)獲得所述酸度。pdc自身也具有緩沖能力，因此常規(guī)的磷酸化自硬化復(fù)合物與本發(fā)明優(yōu)選的組合物相比，在固化過(guò)程中顯示出更快的且不太好控制的ph下降。pdc的存在意味著pdc可以消耗(中和)羥磷灰石形成過(guò)程中殘余的質(zhì)子，并且由此降低ph變化。因此斷定如果除了磷酸以外或替代磷酸使用其他酸，需要更多磷酸鈣來(lái)提供足夠的磷酸鹽含量。在整體組合物中，混合固體和液體部分后，由此獲得的組合物的酸含量?jī)?yōu)選為至少約2.0％磷酸，或等量的其他酸(含或不含磷酸)，如約2.5-25％，如約3.5-15％，或5-10％磷酸或其等價(jià)物。本發(fā)明的組合物具有良好的可注射性。使用5ml注射器(b.braun或等價(jià)物)，具有12mmid和2mm出口，注射2-3ml本發(fā)明的新鮮接合劑組合物的最佳注射力優(yōu)選在約10-30n范圍中，并且更優(yōu)選不高于約20n，并且更優(yōu)選低于約15n或低于約10n。這可以按照實(shí)施例1中所述的來(lái)測(cè)量。本發(fā)明的組合物包括摻入固體部分中的pdc；這在接合劑的凝固中具有決定性的作用。脫乙酰程度(dd)越高，凝固時(shí)間越短。另一方面，凝固是溫度相關(guān)的，即，溫度越高，凝固時(shí)間越快。因此，可以通過(guò)選擇具有合適參數(shù)的pdc并且因此根據(jù)實(shí)際操作需求優(yōu)化組合物來(lái)控制接合劑凝固時(shí)間。在室溫(20-25℃)下，使用50％ddpdc，獲得的凝固時(shí)間為30min，而在<5℃下，凝固時(shí)間超過(guò)>3h。本文中所用的術(shù)語(yǔ)凝固時(shí)間是指從混合到接合劑硬化至不能按照本文中所述的易于施用并且不破碎不能再模制的程度的時(shí)間點(diǎn)。另一個(gè)有用的術(shù)語(yǔ)是工作時(shí)間或使用時(shí)間，這是指最初混合后(并且短暫等待組合物變得足夠粘)并且直至達(dá)到凝固時(shí)間，組合物可以工作/使用的時(shí)間。對(duì)于本發(fā)明的組合物，室溫(20-25℃)下的使用時(shí)間優(yōu)選為從初始混合開(kāi)始的2-25分鐘，如從混合開(kāi)始的2-20分鐘或3-20分鐘。這可以根據(jù)確切的組合物和手術(shù)室中的溫度而改變。通常，對(duì)于越低的s/l比組合物，工作時(shí)間開(kāi)始的等待時(shí)間段更長(zhǎng)，如對(duì)于1:2至1:3范圍的s/l比，3-8分鐘的范圍，但這用稍后的凝固時(shí)間進(jìn)行了補(bǔ)償。因此，當(dāng)s/l比為1:1.5時(shí)，室溫下的工作時(shí)間通常從混合開(kāi)始約2分鐘至約9分鐘，而s/l比較低時(shí)，如1:2，工作時(shí)間從混合開(kāi)始約6分鐘，持續(xù)至從混合開(kāi)始約20分鐘，因此獲得了較長(zhǎng)的使用時(shí)間。使用甚至更低的s/l值(如1:2.5或1:3)時(shí)，工作時(shí)間進(jìn)一步變化，混合后更晚再開(kāi)始，但組合物保持可工作更長(zhǎng)時(shí)間。通常通過(guò)調(diào)節(jié)pdc的相對(duì)含量來(lái)獲得所需的機(jī)械強(qiáng)度，這對(duì)于接合劑的機(jī)械特性是關(guān)鍵的。接合劑在總接合劑約20％pdc(w/w)下達(dá)到峰抗壓強(qiáng)度。通常，可以制備具有50％pdc(w/w)的接合劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含混合組合物(固體和液體部分)總重的10wt％或更低含量，如組合部分的約2-10％，并且在一些實(shí)施方案中，在約2.5-5％范圍中的pdc。此外，施用于骨空洞或骨折中時(shí)，接合劑組合物中的pdc含量對(duì)成骨作用具有影響，越高的含量產(chǎn)生越多的成骨作用。對(duì)于本發(fā)明的組合物，固體部分優(yōu)選包含3-30wt％pdc；具有超過(guò)所述含量pdc的接合劑可以誘導(dǎo)過(guò)度的骨生長(zhǎng)，這取決于乙?；某潭群湍Ｊ?。更優(yōu)選，固體部分包含5-15wt％，如5-10％的pdc。優(yōu)選本發(fā)明組合物中的pdc包含再生的聚合物，其已經(jīng)經(jīng)歷了溶解和隨后的雜質(zhì)過(guò)濾并且從基質(zhì)除去內(nèi)毒素，并且此后在合適的干燥過(guò)程中干燥。在其他實(shí)施方案中，這種再生的殼聚糖可以被傳統(tǒng)殼聚糖或部分脫乙酰的具有相似脫乙酰程度、分子量和顆粒大小的殼多糖替代，只要基本上是純的并且含有低水平的內(nèi)毒素。此外，在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的pdc或殼聚糖的鹽形式或其他形式，如季殼聚糖(quaternarychitosan)、羧甲基殼聚糖等，可以用于接合劑的制劑中。本發(fā)明組合物中的pdc優(yōu)選是具有低于100eu/g內(nèi)毒素水平的高度純化的pdc。這確保了接合劑的良好生物相容性并在接觸骨組織時(shí)提供了即時(shí)的成骨作用。如所述的，本發(fā)明中使用的pdc材料具有40-75％，并且更優(yōu)選約40-70％，如約40-60％，包括約40％、約45％、約50％，或約50-60％，如，例如，55％或60％dd的脫乙酰程度。此外，pdc優(yōu)選在脫乙酰過(guò)程中脫乙酰至隨機(jī)形式(即，殼多糖的脫乙酰，這是獲得用于本發(fā)明的合適殼多糖衍生物的優(yōu)選方式)，使得塊狀(blockwise)n-乙酰-d-葡糖胺(a)或d-葡糖胺(d)部分(例如，a-a-a-a或d-d-d-d)的存在最小化。通過(guò)體內(nèi)內(nèi)源性殼多糖酶的水解時(shí)，這樣所需的半隨機(jī)脫乙?；牧暇推浜俊⒎肿恿?、家族18殼多糖酶的阻斷和對(duì)殼多糖酶樣蛋白質(zhì)的親和性產(chǎn)生了最佳的寡聚物長(zhǎng)度，以獲得用于骨組織再生的最佳治療目的。脫乙酰程度和剩余乙酰基團(tuán)的分布對(duì)pdc聚合物和寡聚物的成骨活性具有顯著影響。脫乙酰越低和乙酰基團(tuán)更均勻的分布，pdc呈現(xiàn)出更好的成骨活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，半均勻分布是有利的，即，不是如上所述的塊狀分布并且同時(shí)也不是乙酰基團(tuán)完全均勻的分布(例如，在具有50％dd的pdc中，n-乙酰葡糖胺殘基不必定是100％地每隔一個(gè)單體分布)。如本文中涉及的pdc的分子量(mw)是指pdc聚合物的加權(quán)平均分子量。pdc的mw影響組合物的各種特性；這些包括機(jī)械強(qiáng)度、可注射性、可塑性、粘結(jié)性或分層、填補(bǔ)能力、凝固時(shí)間等。優(yōu)選的可工作mw為10-1000kda，因此，本發(fā)明組合物中的pdc的優(yōu)選mw在所述范圍內(nèi)。可塑性和分層特性隨著mw提高而提高；然而，非常高的mw不能有利地作用于可注射性和填補(bǔ)能力。對(duì)于本發(fā)明的組合物，殼多糖材料的優(yōu)選范圍在30-200kda內(nèi)。高和低mw的混合物可以平衡各種矛盾的特性，例如，可注射性vs.分層特性。另一方面，寡聚物形式的治療性pdc的摻入可以縮短愈合過(guò)程。在特定的實(shí)施方案中，組合物包括部分脫乙酰的殼寡聚物(chitooligomer)，通常在寡聚物鏈中具有約3-12個(gè)糖殘基范圍的寡聚合物長(zhǎng)度和約30-70％范圍的dd值，作為pdc材料的一部分，如pdc材料的總含量的約5-25wt％，如約5％、10％或15％。這將促進(jìn)骨生成的早期開(kāi)始。試劑盒制備和包裝后，優(yōu)選用γ照射的滅菌。γ照射可以影響初始pdc材料的mw，因此如果組合物中的pdc材料在照射之前具有200至1000kda范圍的mw，在γ照射后，照射可以給予30-200kda的最終mw。在一些實(shí)施方案中，有效的初始mw范圍為10至超過(guò)1500kda，并且最終mw范圍為10至1000kda。最終mw的最優(yōu)選范圍如上所述，在30-200kda范圍內(nèi)，并且因此優(yōu)選的初始mw范圍在20-1000kda內(nèi)，如100-1000kda范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選在200-1000kda范圍內(nèi)，如使用光散射檢測(cè)儀，通過(guò)gpc/sec系統(tǒng)測(cè)量的。本文內(nèi)容中γ照射的可工作劑量?jī)?yōu)選在9至100kgray范圍中，最佳優(yōu)選的劑量在20-35kgray范圍中。優(yōu)選，本發(fā)明組合物中的pdc具有不超過(guò)500μm的顆粒大小。在酸性環(huán)境中，這樣的材料快速溶解并且與磷酸鈣反應(yīng)，以調(diào)節(jié)接合劑特性。如所述的，本發(fā)明具有摻入固體部分中的pdc。這具有避免存儲(chǔ)過(guò)程中可能的酸降解的附加優(yōu)勢(shì)。這確保了接合劑合理的貨架期并且避免較差的接合劑特性和經(jīng)濟(jì)損失的產(chǎn)生。此外，磷酸鈣包括在組合物的固體部分中。在本發(fā)明的優(yōu)選組合物中，磷酸鈣將形成低晶體沉淀的羥磷灰石，以確保最佳的同化作用以及在體內(nèi)形成骨組織。優(yōu)選，組合物固體部分包含酸性磷酸鈣和堿性磷酸鹽。在與液體部分混合并中和時(shí)，磷酸鈣導(dǎo)致沉淀的羥磷灰石的形成。鈣與磷的最優(yōu)比例，ca/p比，在約1.6至1.7的范圍中，然而，1.2至2.2范圍中的ca/p比是可工作的，其是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選范圍。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸鈣是α-磷酸三鈣和磷酸四鈣。這些優(yōu)選具有高于80％的純度。(根據(jù)發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)，低于80％的純度也可以使用，并且沒(méi)有產(chǎn)生較差的成骨特性)。導(dǎo)致羥磷灰石形成的其他磷酸鈣的組合也可以用于本發(fā)明中。硫酸鈣是易碎的，并且提供比磷酸鈣低的強(qiáng)度，因此在體內(nèi)易于具有比磷酸鈣更快的再吸收速率。硫酸鈣和磷酸鈣的混合物可以結(jié)合接合劑在體內(nèi)的再吸收速率和機(jī)械特性的益處。磷酸鈣應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具有不超過(guò)180μm，更優(yōu)選小于約100μm的顆粒大小。機(jī)械強(qiáng)度與顆粒大小成反比。最優(yōu)大小為50μm或更小。在一些實(shí)施方案中，組合物在固體部分中包含甘油磷酸鈉。甘油磷酸鈉可以用于進(jìn)一步提高接合劑的機(jī)械特性并且將接合劑的鹽度調(diào)節(jié)至生理?xiàng)l件。在其他實(shí)施方案中，也可以使用其他磷酸鹽，作為甘油磷酸鈉的替換或除了甘油磷酸鈉以外，包括磷酸氫鈉、磷酸氫二鈉等。如上所述，本發(fā)明進(jìn)一步提供了基于使用本發(fā)明組合物的方法，用于愈合骨折的骨頭。這些方法包括提供如上所述的固體部分和液體部分，并且以約1:1.2至約1:6固體部分比液體部分的比例將兩個(gè)部分混合在一起，并且更優(yōu)選在如上所述和限定的范圍中，如最優(yōu)選以約1:2的比例。將這兩個(gè)部分混合，并且混合允許固化合適的時(shí)間，直至獲得所需的稠度和粘度，這時(shí)，組合物的“工作時(shí)間”開(kāi)始，然后插入混合物，優(yōu)選通過(guò)注入希望愈合的骨折部位。組合物的操作非常適合涉及整形外科手術(shù)的臨床程序。填補(bǔ)骨空洞時(shí)，產(chǎn)品可以用于替代骨移植物，以促進(jìn)骨折愈合中的結(jié)合，促進(jìn)如脊柱融合術(shù)手術(shù)、骨切除術(shù)中的融合，例如，在牙周外科手術(shù)、骨癌外科手術(shù)中，如保肢外科手術(shù)、外周骨的非結(jié)合重建、良性過(guò)程中的骨性(ostelytic)過(guò)程的修復(fù)中等等。因此斷定本發(fā)明還提供了本文中所述的pdc材料通常用作用于修復(fù)和愈合骨的藥物，特別是在如本文中所述的組合物試劑盒中提供pdc時(shí)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：具有1:2s/l比的本發(fā)明的特定組合物的材料特性將固體和液體成分分開(kāi)混合，并在使用前用刮刀立即組合和混合。表1組合物成分相對(duì)含量固體部分：磷酸四鈣46α-磷酸三鈣35甘油磷酸鈉11pdc，50％dd8液體部分磷酸20磷酸鈣4水176質(zhì)地：就在混合后的接合劑組合物在工作時(shí)間開(kāi)始時(shí)具有乳狀糊狀物的質(zhì)地。使用5mlb.braun注射器(12mmid和2mm出口)測(cè)量的注射強(qiáng)度在15-30n范圍中。組合物在室溫(20-25℃)下的工作時(shí)間在初始混合開(kāi)始的3-25分鐘內(nèi)，即室溫下25分鐘的凝固時(shí)間，但在3℃下長(zhǎng)達(dá)3h。將2g組合物置于5ml未緩沖鹽水(0.9％nacl)中時(shí)，初始ph為7.4。6小時(shí)后，ph為6.84，1天后，為6.47，并且在5天后，為5.94。如下測(cè)定組合物的粘結(jié)性：將50ml鹽水(0.9％nacl)置于100ml燒杯中，在底部具有2.5cm磁攪拌棒，并且在低于表面1cm的深度放置25目網(wǎng)。將0.5ml即可使用的接合劑注射在網(wǎng)上(以圓形運(yùn)動(dòng)，提供“圓環(huán)”形狀)。設(shè)置顯示于圖1中。將溶液以100rpm的速度攪拌10min。測(cè)定注射的接合劑的精確重量(通過(guò)稱(chēng)重注射前后的注射器的重量)。攪拌時(shí)間后，將溶液轉(zhuǎn)移至濁度測(cè)量試管并且測(cè)量濁度，表示為ntu。校準(zhǔn)曲線：通過(guò)使用各自的接合劑作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)制備儲(chǔ)備懸浮液。將稱(chēng)重部分的接合劑(精確到0.0000g)徹底分散，以產(chǎn)生1000ntu的濁度。通過(guò)連續(xù)稀釋?zhuān)瑢?chǔ)備懸浮液用于制備具有0、200、400、600、800和1000ntu的標(biāo)準(zhǔn)懸浮液。用接合劑含量相對(duì)懸浮液濁度繪制曲線，獲得了線性圖。因此，通過(guò)測(cè)量10min攪拌后的測(cè)試溶液的濁度，確定分散的接合劑含量。使用這種測(cè)量，確定了<0.1％的接合劑組合物已經(jīng)分層并且分散于鹽溶液中。更多的機(jī)械特性：使用測(cè)力計(jì)測(cè)量了抗穿透性，通過(guò)將針(3mmod)壓入嵌入96孔平板(ф6.7×13mm)中的完全固化的組合物中5mm的深度來(lái)測(cè)量。通過(guò)在鹽溶液(0.9％nacl)中在37℃下孵育24小時(shí)來(lái)固化組合物。針對(duì)每個(gè)組合物使用了6-8次重復(fù)，使用mts測(cè)試儀(mtsinsight10，edenprairie，mn，usa)，測(cè)量了表1中所列組合物(s？l比為1：2)的抵抗力為8.08±0.34n/mm2。還測(cè)試了具有不同s/l比的組合物的穿透。具有1:1.5s/l比的組合物具有17,25n/mm2的抗穿透性，與s/l1:2組合物(6,221n/mm2)相比，這幾乎是三倍，而具有1:1s/l比的組合物具有測(cè)量的32,82n/mm2的抗穿透性。從5mm位移的穿透力計(jì)算了接合劑的強(qiáng)度。早先的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示出所述的穿透測(cè)試和傳統(tǒng)的壓力測(cè)試(cct)之間的線性相關(guān)。實(shí)施例2：脫乙酰對(duì)機(jī)械特性的作用注射力：按照實(shí)施例1中所述的配制了兩種組合物，但使用兩種不同dd值，50％和70％的pdc。使用mts測(cè)試儀，在具有12mmid和2mm出口的b.braun5ml注射器中進(jìn)行了注射測(cè)試。結(jié)果顯示于圖1中。(在25℃或3℃下進(jìn)行了測(cè)試，參見(jiàn)圖2)。抗壓強(qiáng)度：按照實(shí)施例1制備了三種組合物，但使用三種不同dd值，40％、70％和94％的pdc，并且s/l比為1。使用mts測(cè)試儀，使用20mm/min的十字頭速度，使用500n測(cè)力計(jì)，測(cè)試了抗壓強(qiáng)度。將測(cè)試過(guò)程中的初始接合劑溫度設(shè)定在3和25℃。結(jié)果顯示于圖3中。在壓力測(cè)試中，對(duì)于每個(gè)處理，重復(fù)5次，每次使用ф9.6×15mm大小。將這些樣本在鹽水(0.9％nacl)中在37℃下孵育24h用以固化，并且測(cè)試條件與注射測(cè)試所述的相同。實(shí)施例3：在大鼠下頜骨模型中的體內(nèi)測(cè)試組合物-脫乙酰程度的優(yōu)化介紹：大鼠下頜骨(顎骨)是骨愈合研究經(jīng)常使用的模型(bonerepairinratmandiblebyrhbmp-2associatedwithtwocarriers(通過(guò)與兩種載體相關(guān)的rhbmp-2的大鼠下頜骨的骨修復(fù))；micron，第39卷，第4期，2008年6月，第373-379頁(yè)，paulomardeganissa等；boneformationintrabecularbonecellseededscaffoldsusedforreconstructionoftheratmandible(用于大鼠下頜骨重建的小梁骨細(xì)胞接種支架的骨形成)；internationaljournaloforalandmaxillofacialsurgery，第38卷，第2期，2009年2月，第166-172頁(yè)，h.schliephake等，boneregenerationintheratmandiblewithbonemorphogeneticprotein-2:acomparisonoftwocarriers(使用骨形態(tài)形成蛋白-2的大鼠下頜骨中的骨再生：兩種載體的比較)；otolaryngology-headandnecksurgery，第132卷，第4期，2005年4月，第592-597頁(yè)，oneidaa.arosarena,wesleyl.collins；spontaneousbonehealingofthelargebonedefectsinthemandible(下頜骨中大的骨缺陷的自發(fā)性骨愈合)；internationaljournaloforalandmaxillofacialsurgery，第37卷，第12期，2008年12月，第1111-1116頁(yè)，n.ihanhren,m.miljavec)。下頜骨是對(duì)喂食和咬動(dòng)引起的恒應(yīng)力起反應(yīng)的代謝上活動(dòng)的骨。我們已經(jīng)研發(fā)了用于大鼠下頜骨中關(guān)鍵骨損傷的動(dòng)物模型，使用微-ct分析來(lái)測(cè)量新的骨生長(zhǎng)和成骨應(yīng)答以及組織學(xué)檢查，以將微-ct構(gòu)造的礦化特征翻譯成礦化骨組織。大鼠顎的咬肌窩(massetericfossa)的中間區(qū)域中直徑4mm的鉆孔提供了影響骨機(jī)械特性的關(guān)鍵大小的空洞(圖4)。這確保了骨對(duì)損傷有應(yīng)答，補(bǔ)償了由激活適當(dāng)?shù)某晒菓?yīng)答引起的骨結(jié)構(gòu)弱化。微-ct分析能夠使用限定部分的下頜骨來(lái)定量礦化作用(圖4)。這證明了這是用來(lái)評(píng)價(jià)注入這個(gè)空洞中作為骨植入物的生物材料的成骨作用的極好工具。在這個(gè)研究中，模型用來(lái)評(píng)價(jià)基于磷酸鈣的可注射骨空洞填充劑中不同殼多糖衍生物的骨生長(zhǎng)刺激作用。這些殼多糖衍生物是三種不同脫乙酰的殼多糖聚合物，50％、70％和96％脫乙酰的，和一種50％脫乙酰的寡聚物(t-chostm，genishf.，iceland)?；谖覀冎暗拇笫箢€研究，植入時(shí)間調(diào)整為7天。聚合物的乙?；坪鯇?duì)于誘導(dǎo)新骨形成是重要的，顯示出50dd聚合物活性最大，而96％dd聚合物無(wú)活性。材料和方法用于這個(gè)研究中的殼多糖衍生物如下：50ddpdc。脫乙酰程度50％。(表1中所述的相同材料)。70ddpdc。脫乙酰程度70％。96ddpdc。脫乙酰程度96％。50dd寡聚物(t-chostm，genishf.，iceland)。t-chostm沒(méi)有單體并且含有低于10％的二聚物和三聚物。八聚物是組合物中最大量的寡聚物。所有聚合物的平均分子量大于130kda，如通過(guò)大小排阻色譜判定的。生產(chǎn)了四種不同植入物組合物的試劑盒，每種試劑盒含有固體成分(固體部分)和液體成分(液體部分)。固體成分(一試管)含有0.155g殼多糖衍生物，0.904g磷酸四鈣和0.701gα-磷酸三鈣，0.220g甘油磷酸鈉和0.098g氫氧化鈣(固體部分的總重為2.078g)。液體成分(一試管)含有0.398g磷酸和3.504g水，總重為3.902g(s/l比1:1.88)。將一個(gè)固體和一個(gè)液體成分放入鋁薄片和熱密封的塑料袋中，產(chǎn)生完整的即可使用的試劑盒。所有試劑盒通過(guò)γ照射滅菌(20kgy；radiationcenter，oregonstateuniversity，usa)。在手術(shù)過(guò)程中和植入之前，以無(wú)菌方式混合成分，放入注射器中，并且保持在4℃，直至植入。測(cè)試動(dòng)物是spraguedawley雄性大鼠(260-280g)，由丹麥的taconic供應(yīng)。在到達(dá)和離開(kāi)時(shí)在臨床上檢查動(dòng)物，在手術(shù)前在實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)適應(yīng)和生長(zhǎng)30天。在手術(shù)那天，動(dòng)物的平均重量為413g，范圍為430-464g。實(shí)驗(yàn)在冰島動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)(icelandiccommitteeonanimalexperimentsapproval)的許可(執(zhí)照號(hào)0709-0405)下進(jìn)行。通過(guò)整形外科醫(yī)生和麻醉師進(jìn)行了手術(shù)，藥物劑量和動(dòng)物護(hù)理由獸醫(yī)來(lái)管理。通過(guò)剃毛和消毒，將每只動(dòng)物的左顎準(zhǔn)備用于外科手術(shù)。通過(guò)平行于下頜骨并且在下頜骨下緣上方的切口，進(jìn)入下頜骨。通過(guò)咬肌(musculusmasseter)纖維的鈍的和無(wú)創(chuàng)傷的解剖，進(jìn)入咬肌窩(fossamasseterica)。使用4mm牙鉆，通過(guò)咬肌窩的中央部分鉆出4mm孔。用無(wú)菌鹽水(5ml)徹底沖洗后，使用eppendorf分配器給孔注入25μl實(shí)驗(yàn)測(cè)試制劑或留著未處理(空的孔洞對(duì)照)。用縫合將外科手術(shù)傷口閉合。使用39只動(dòng)物建立了總共6組。表2顯示了實(shí)驗(yàn)設(shè)定。表2.實(shí)驗(yàn)設(shè)定。每個(gè)組中的動(dòng)物數(shù)量，孔的處理和存活期的持續(xù)時(shí)間。動(dòng)物數(shù)量處理植入時(shí)間(天)4空的孔洞7470％dd聚合物0896％dd聚合物7770％dd聚合物7850％dd聚合物；7850％dd寡聚物；7最后，用異氟烷將大鼠麻醉，并且在麻醉下，最后從心臟放血。然后從頜關(guān)節(jié)解剖出左顎，并且放入ph7.0的50mm磷酸鹽緩沖液中的3.7％甲醛中。在微-ct掃描儀(來(lái)自generalelectricinspectiontechnologies的nanotom)中進(jìn)行了掃描。將樣品固定于充滿(mǎn)固定溶液的密閉塑料圓柱體中并且安放在ct-掃描儀的旋轉(zhuǎn)臺(tái)上。使用al-體模和塑料體模(pet)作為用于灰度值比較的參照點(diǎn)進(jìn)行了掃描。放大倍數(shù)為4，三維像素大小為12.50μm/三維像素邊緣，收集的圖像數(shù)量為1080(步長(zhǎng)為0,33°)，暴露時(shí)間為2000ms，均幀為3，跳幀(frameskipped)為1。x-射線設(shè)定為100kv，125μa，使用電子管(tubemode)0，并且無(wú)濾波器。使用伴隨ct-掃描儀的datos-x軟件進(jìn)行了體積重建。使用來(lái)自volumegraphics的volumegraphicsstudiomax2.0進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。限定了圓柱形的體積，包括從最后面的臼齒的遠(yuǎn)側(cè)邊緣往后延伸的整個(gè)骨頭，包括下頜突、角狀突、冠突和具有或不具有植入物的孔(圖3；lc)。通過(guò)灰度值截留/灰度值限定，測(cè)定了總的骨體積(舊骨和新骨)和該體內(nèi)內(nèi)的植入材料。在具有植入物的顎的情況中，限定了垂直于較大圓柱體的較小圓柱體，包括植入材料(圖3；sc)。從通過(guò)大的圓柱體測(cè)定的總的骨和植入物體積減去該圓柱體內(nèi)的植入材料的體積。這樣，獲得了處理和未處理顎的總骨體積(新骨和舊骨)的估算值(圖3)。微-ct掃描后，將樣品放入緩沖的固定溶液中。將選擇的樣品在decalc(histolab，no.00601，gothenburg，瑞典)中脫鈣3hr。然后將樣本脫水，石蠟包埋，切片(2μm)并用蘇木精-曙紅染色。使用連接數(shù)碼相機(jī)(leicadfc290)的光學(xué)顯微鏡(leicadm2000，德國(guó))檢查切片并拍照。結(jié)果在7天的時(shí)間段內(nèi)，乙?；臍ぞ厶钦T導(dǎo)了礦化顎骨體積的增加(圖4)。計(jì)算每組的平均礦化骨體積(ambv，以mm3計(jì))(平均值±sem)。在兩個(gè)對(duì)照組之間沒(méi)有觀察到顯著差異(空的孔洞組和零天組，各自為69.4±3.1和71.1±2.3；圖5)。對(duì)于脫乙酰殼多糖聚合物，ambv與％dd值負(fù)相關(guān)；96dd組具有71.9±2.9的平均值，70dd組為84.2±4.5的值，50dd組為87.3±3.8(圖5)。與空的孔洞組相比，70dd和50dd組的ambv顯著提高(各自為18和23％)。令人感興趣的，96dd組(96％脫乙酰殼聚糖)對(duì)礦化骨體積不具有顯著作用(圖5)。寡聚物復(fù)合物(t-chostm植入物)誘導(dǎo)11％的骨體積(圖5)。這種誘導(dǎo)是顯著的(p<0.05)。然而，由于較差的物理化學(xué)特性，t-chostm植入物常常被咬碎并且離開(kāi)空洞。微-ct掃描檢查時(shí)，這種情況是明顯的。在鉆孔中，大部分的t-chostm植入物已經(jīng)不見(jiàn)。聚合物顯然對(duì)于這種骨接合劑制劑的機(jī)械穩(wěn)定性是必需的。圖6顯示了植入基于70％dd聚合物的可注射組合物后14天，通過(guò)相同的大鼠下頜骨的組織學(xué)和微-ct橫截面的比較。切片是鉆孔前沿的1-2mm。礦化組織(a、b和c)，通過(guò)微-ct分析表征為新骨，顯示出新形成的骨組織，如通過(guò)蘇木精-曙紅染色切片所判定的。所有新骨具有比原始顎骨低的密度，通過(guò)微-ct和組織學(xué)檢查來(lái)判定。組織學(xué)制備物揭示了小梁骨形成，在新骨長(zhǎng)出物內(nèi)具有血管形成。新骨長(zhǎng)出物通常來(lái)自覆蓋骨外表面的骨膜，而不是骨缺陷自身(圖6)。因此，可以聲明這種pdc誘導(dǎo)的骨長(zhǎng)出物位于鉆孔遠(yuǎn)側(cè)，遍布下頜骨骨表面，主要沿著暴露于顎內(nèi)的最大機(jī)械應(yīng)力的部位。這只可以通過(guò)能夠遍布骨相關(guān)組織分散的小分子的活性來(lái)解釋。這些小分子最可能是通過(guò)植入物中的pdc聚合物的原位水解形成的pdc寡聚物。這種水解最可能是通過(guò)白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)表達(dá)的家族18殼多糖酶來(lái)催化的。這些活性殼多糖酶將分裂部分乙?；臍ざ嗵蔷酆衔?，形成各種大小的pdc寡聚物。這些所述pdc寡聚物從植入的組合物擴(kuò)散至鄰近組織中，并且介導(dǎo)這種應(yīng)答骨的機(jī)械應(yīng)力的遠(yuǎn)側(cè)骨生長(zhǎng)促進(jìn)。實(shí)施例4：綿羊脛骨近側(cè)中關(guān)鍵骨空洞的處理通過(guò)植入四十五只5歲大(年齡5.83±0.71，平均±sd)的綿羊的脛骨近側(cè)的骨骺中來(lái)測(cè)試如實(shí)施例1(表1)和實(shí)施例2中所述的組合物。所有綿羊以相似的方式進(jìn)行手術(shù)，15只保持3個(gè)月用于短期評(píng)價(jià)，15只保持13個(gè)月用于長(zhǎng)期評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)在冰島動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)的許可(執(zhí)照號(hào)0709-0405)下進(jìn)行。通過(guò)整形外科醫(yī)生和麻醉師進(jìn)行了手術(shù)，藥物劑量和動(dòng)物護(hù)理由獸醫(yī)來(lái)管理。液體和固體成分的混合用于這個(gè)樣品中的部分脫乙酰殼多糖聚合物具有以下特性：50％脫乙酰程度：1％醋酸的1％溶液中的100％溶解性；460cp的溶液粘度；溶液中<10ntu的濁度；330kda的表觀平均分子量；內(nèi)毒素含量93eu/g。將試劑盒的固體和液體成分倒入無(wú)菌塑料杯中，并且用無(wú)菌刮刀攪拌和捏合2分鐘，形成粘性漿液。外科手術(shù)程序在每只動(dòng)物的骨的前后邊緣之間的中部和左右脛骨粗隆的高度，鉆出直徑8mm的孔。以垂直角度通過(guò)皮層鉆出進(jìn)入孔，并且隨后將鉆孔機(jī)改變方向至45°向上，結(jié)束于脛骨平臺(tái)面的下方。在鉆孔程序過(guò)程中鉆孔機(jī)沒(méi)有冷卻。鉆孔后，通過(guò)用40-50ml無(wú)菌鹽水沖洗和徹底抽吸，徹底沖洗掉鉆孔的骨碎片。將測(cè)試試劑盒的液體和固體成分混合后，將1.5ml漿液放入5ml安裝有無(wú)菌移液尖端的無(wú)菌注射器中，并且將全部?jī)?nèi)含物注入鉆孔中，確保材料到達(dá)，以填補(bǔ)從脛骨平臺(tái)開(kāi)始向下和向外至皮層開(kāi)口的鉆孔的完整空間。左腿孔留著空的，并且用作陰性對(duì)照。此后，用4-0連續(xù)vicryl皮下縫合閉合兩條腿的外科手術(shù)傷口，并且用4-0etilone連續(xù)皮內(nèi)縫合閉合皮膚。外科手術(shù)和醒來(lái)后，將動(dòng)物移回羊圈恢復(fù)，在那仔細(xì)監(jiān)控它們，直至能走動(dòng)。樣品的死后處理移出后，立即將骨樣品放入ph7.0的50mm磷酸鹽緩沖液的3.7％甲醛中，并且此后連同羥磷灰石體模標(biāo)準(zhǔn)品一起在微ct-掃描儀(來(lái)自generalelectricinspectiontechnologies的nanotom)中掃描。還掃描了通過(guò)離體制備的并且使其在鹽水中在37℃下靜置和硬化24h的圓柱狀樣品，以獲得來(lái)自零時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)。掃描后，將骨樣品鋸成4mm厚的切片，并且返回緩沖的固定劑中，持續(xù)最少4周。完成固定階段后，將樣品放入中性ph的15％edta溶液中，用于脫鈣，持續(xù)長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月，定期更新edta溶液。脫鈣后，制備用于組織學(xué)(石蠟)的樣品，并且使用蘇木精-曙紅染色。微ct分析將原始微ct數(shù)據(jù)接受使用來(lái)自volumegraphics的datos-x軟件和volumegraphicsstudiomax2.0的體積重建和數(shù)據(jù)分析。重建的體積包括脛骨的完整垂體(hypophysisofthetibia)，從脛骨平臺(tái)到達(dá)并且向下3cm，包括鉆孔和全部可能在鉆孔外發(fā)現(xiàn)的植入材料。通過(guò)灰度值截留/灰度值限定，確定了該重建體積內(nèi)的舊骨、新骨和植入材料的體積。標(biāo)準(zhǔn)品中羥磷灰石的濃度越高，在微ct圖像中顯示出更亮的灰度值(“更白”)。因?yàn)榱u磷灰石是鈣化骨中誘導(dǎo)x-射線減弱的主要成分，標(biāo)準(zhǔn)品的灰度值可以用于估算樣品中礦化的程度和分布。通過(guò)比較羥磷灰石標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的灰度值，因此可以判定礦化程度。ct圖像中最亮的區(qū)域表示具有最高礦化程度的組織。為了定量評(píng)價(jià)，限定了4mm長(zhǎng)和3mm半徑的虛擬圓柱體并且相對(duì)于鉆孔方向的縱軸仔細(xì)并同心地定向(圖7)。在保持固定的圓柱體的方向的同時(shí)，將半徑逐步提高至4、5和6mm，并且測(cè)量每個(gè)圓柱體中的礦物體積。在所有樣品中重復(fù)這種分析，包括空洞(左脛骨)和具有植入物的孔。通過(guò)從較寬的圓柱體減去較窄的圓柱體，如從半徑4mm減去半徑3mm(r4-r3)，r5-r4和r6-r5，獲得了每個(gè)圓柱體1mm外殼(管)的礦物相體積。將所有圓柱體殼的礦物相體積標(biāo)準(zhǔn)化至1mm3的標(biāo)準(zhǔn)體積，獲得礦物密度，并且使用sigmastat和sigmaplot軟件對(duì)這一數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果從所有樣品制備橫截面微ct圖像，顯示出3個(gè)平面中的植入材料和周?chē)慕M織。將這些圖像用于目測(cè)和限定用于礦物密度定量評(píng)價(jià)的虛擬圓柱體。將組織學(xué)切片用于評(píng)價(jià)組織對(duì)植入材料的應(yīng)答，著重于炎癥、異物反應(yīng)、疤痕組織形成和新形成的骨組織的體征。微ct數(shù)據(jù)的解釋體內(nèi)3個(gè)月后，目測(cè)揭示了圍繞植入物的明顯的新骨的密集外殼并且很好地連接鄰近的小梁骨組織。植入物內(nèi)部密集結(jié)構(gòu)的島表明遍布材料散射的骨形成(圖8)。體內(nèi)13個(gè)月后，這甚至更明顯，與體內(nèi)3個(gè)月相比，顯示出周?chē)耐鈿じ?，并且植入物?nèi)的骨形成更明顯。離體和體內(nèi)樣品中的礦物密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)揭示了體內(nèi)3個(gè)月過(guò)程中礦物密度降低21％。體內(nèi)3和13個(gè)月之間，植入物的礦物密度再次提高33％(圖9)。在3個(gè)月和13個(gè)月時(shí)，空洞沒(méi)有顯示出任何礦化組織的生長(zhǎng)。然而，圍繞空洞的密度骨組織的薄外殼是明顯的。這通過(guò)了r4-r3數(shù)據(jù)的定量評(píng)價(jià)得到了證實(shí)(圖10)。這揭示了8mm鉆孔是這個(gè)模型中的臨界骨縫隙。使用matlab(matrixlaboratory)和mimics(醫(yī)學(xué)成像分割軟件)軟件，通過(guò)測(cè)量3個(gè)月和13個(gè)月時(shí)的灰度值分布，來(lái)定量植入物和骨變化。結(jié)果證明了3個(gè)月時(shí)植入物和骨之間灰度值分布的顯著差異。然而，在13個(gè)月時(shí)，植入物的灰度值分布變得與周?chē)堑幕叶戎捣植枷嗨?。這些結(jié)果表明植入物在10個(gè)月期間的形態(tài)學(xué)變化，表明植入物材料到骨組織的漸進(jìn)性轉(zhuǎn)變。通過(guò)組織學(xué)分析的證實(shí)3個(gè)月后的脛骨的組織學(xué)評(píng)價(jià)顯示出植入材料完全是生物相容性的，沒(méi)有炎癥或異物反應(yīng)的體征。疤痕組織形成是可以忽略的。圍繞完整植入物的新骨組織的外殼是明顯的，大范圍地整合至鄰近小梁骨中，并且新骨的島在整個(gè)植入物中散布(圖11)。組織學(xué)切片的內(nèi)襯圖像和微ct切片的同系物圖像證實(shí)了被圍繞植入物和遍布植入物散布的高密度(最高程度的x-射線減弱)表征的區(qū)域是新形成的骨組織。本發(fā)明涉及以下實(shí)施方式：1.一種用于骨愈合醫(yī)療的組合物試劑盒，其包括a.固體部分，包括具有40-75％脫乙酰程度的部分脫乙酰殼多糖(pdc)和磷酸鈣；b.酸性液體部分，包括水和酸；在分開(kāi)的小瓶中提供所述部分，在使用前混合，其中固體與液體部分的重量:重量比在1:1.2至1:6的范圍中。2.實(shí)施方式1的組合物試劑盒，其中pdc具有40-60％范圍，并且優(yōu)選約50％的脫乙酰程度。3.實(shí)施方式1的組合物試劑盒，其中所述固體部分包括3-30wt％，優(yōu)選5-15wt％的pdc。4.實(shí)施方式1-3任一項(xiàng)的組合物試劑盒，其中所述液體部分包括一種或多種選自磷酸、鹽酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、甲酸、丙酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和谷氨酸的酸。5.實(shí)施方式1-4任一項(xiàng)的組合物試劑盒，其中所述液體部分具有等于至少5wt％磷酸的酸度。6.實(shí)施方式1的組合物試劑盒，其中所述液體部分進(jìn)一步包括氫氧化鈣。7.實(shí)施方式1的組合物試劑盒，其中所述固體與液體部分的重量比在約1:1.3至約1:4的范圍中。8.實(shí)施方式7的組合物試劑盒，其中所述固體與液體部分的重量比在約1:1.5至約1:3的范圍中。9.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，其包括含量為組合部分的0.5-10wt％范圍，優(yōu)選約1-5wt％范圍的pdc。10.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，其中所述pdc已經(jīng)溶解和沉淀。11.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，其中所述磷酸鈣包括磷酸四鈣、α-磷酸三鈣和可以形成羥磷灰石和/或透鈣磷石的沉淀物的其他磷酸鈣中的一種或多種。12.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，其中所述固體部分包括甘油磷酸鈉。13.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，其中組合物在混合后在室溫下開(kāi)始硬化，并且在室溫下具有約15-30分鐘范圍內(nèi)的凝固時(shí)間。14.實(shí)施方式13的組合物試劑盒，所述組合物在混合后具有如通過(guò)可注射性確定的粘度，所述粘度用具有12mmid和2mm出口的5mlb.braun注射器測(cè)量時(shí)，低于30n。15.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，其中所述組合物不包括骨形態(tài)形成蛋白或選自骨髓、血液、骨和成骨蛋白的其他生物因子。16.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，進(jìn)一步在固體部分中包括硫酸鈣。17.上述任一項(xiàng)實(shí)施方式的組合物試劑盒，用γ照射將其滅菌。18.用作用于修復(fù)和愈合骨頭的藥物的具有40-75％范圍的脫乙酰程度的部分脫乙酰殼多糖(pdc)。19.根據(jù)實(shí)施方式18的用作藥物的具有40-75％范圍的脫乙酰程度的pdc，其中將所述pcd包含在根據(jù)實(shí)施方式1-17任一項(xiàng)的組合物試劑盒中。20.一種骨愈合的方法，其包括：-將固體部分和酸性液體部分混合在一起，形成是液體、半液體或糊狀接合劑混合物的混合物，所述固體部分包括具有40-75％范圍的脫乙酰程度的部分脫乙酰殼多糖(pdc)和磷酸鈣，所述酸性液體部分包括水和酸，其中固體部分與液體部分的重量:重量比在1:1.2至1:6的范圍中；-將所獲得的混合物施用于待愈合的骨頭部位。21.實(shí)施方式20的方法，其中通過(guò)注射來(lái)進(jìn)行所述施用。22.實(shí)施方式20的方法，其中所述施用是通過(guò)如刮刀來(lái)施用于骨表面。23.實(shí)施方式20的方法，其中固體部分與液體部分的重量:重量比在約1:1.3至約1:4的范圍中。當(dāng)前第1頁(yè)12