一種制備生物性復合氣管補片的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領域，尤其涉及一種制備生物性復合氣管補片的方法及其制備的氣管補片及應用。
【背景技術】
[0002]由于氣管先天畸形、腫瘤切除、外傷等各種病因，常會導致氣管壁部分缺失。如果直接將氣管縱行縫合，可能會造成醫(yī)源性氣道狹窄，引起一系列并發(fā)癥包括反復發(fā)作的致命性肺炎，此時將氣管切斷再吻合是目前解決這一難題的主要方法。但是，行長段氣管切除術(成人大于全長的50%，兒童大于30%)后，由于兩斷端距離太遠造成吻合口張力過大，手術無法進行。故尋找一種良好的補片材料對缺損的氣管壁進行修補，對于解決這一臨床問題有著重要的意義。
[0003]同種異體移植作為最經(jīng)典的器官替代、修復和重建方法，已經(jīng)有百余年的歷史，并在多個領域取得一定的成功。但是，一方面供體器官的嚴重缺乏在世界范圍內(nèi)面臨的難題；另一方面，由于控制排異反應存在，需要長期服用免疫抑制劑所帶來的巨大副作用不容小覷。即便是在長期堅持服用藥物的情況下，慢性排異反應也無法阻止，移植物最終會失去功能，從而需要再次手術或其他替代治療。更重要的是，研究表明氣管粘膜上皮細胞具有很高的MHC I和MHC II抗原，異體上皮細胞是免疫攻擊的把目標和重要環(huán)節(jié)，所以造成氣管的同種異體移植成功率更低、風險更大。降低移植物的免疫原性，減少排異反應是同種異體移植亟待解決的問題。
[0004]組織工程是在體外構建具有生命力的活體植入體內(nèi)。從而達到修復缺損、重建功能、提高生活質(zhì)量之目的。理想的氣管補片應該最大限度地降低移植物的免疫原性，并且盡可能的保留細胞外基質(zhì)。組織工程氣管正好滿足了這些基本條件，是目前該領域研究的熱點。2008年瑞典的Macchiarini醫(yī)生利用氣管脫細胞支架材料完成了第一例成功的組織工程氣管移植手術，標志著氣管重建的組織工程時代的開始。然而，由于這一技術仍然依賴于供體捐獻氣管以制作脫細胞氣管支架，所以氣管來源仍然面臨挑戰(zhàn)。另一方面，由于受者的細胞要經(jīng)過很長一段時間的復雜培養(yǎng)工藝才能定植、攀附到脫細胞氣管支架上，所以這種制作方法的效率仍然有待提高。
[0005]最近的十年，增材制造技術，也就是人們熟悉的“三維打印技術”的快速發(fā)展，為生物醫(yī)學界帶來新的啟迪。它是一種個性化制備復雜支架和組織工程植入物的多功能快速成型技術。而生物打印在傳統(tǒng)三維打印的基礎上，進一步實現(xiàn)了對于細胞空間分布的精確定位。可是，目前研究得到的三維打印氣管補片存在生物相容性差、細胞成活率低、制作工藝復雜、產(chǎn)品可塑性差、無法滿足個性化需求等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術中的上述問題提出了一種制備生物性復合氣管補片的方法，通過精確調(diào)控多種細胞的空間分布、改善補片材料配方、完善內(nèi)部結(jié)構設計，能夠臨床提供安全可行的氣管補片產(chǎn)品。
[0007]本發(fā)明解決上述技術問題所采取的技術措施為:
[0008]—種制備生物性復合氣管補片的方法，包括以下步驟:
[0009]步驟一，利用支氣管鏡，無菌刷取支氣管上皮細胞，體外培養(yǎng)擴增；提取耳廓軟骨細胞，消化、分散，體外培養(yǎng)擴增；
[0010]步驟二，將膠原和透明質(zhì)酸與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射徹底滅菌，均勻分散于滅菌培養(yǎng)液中；
[0011]步驟三，將所述步驟二中所得的軟材料和培養(yǎng)液以1:1的體積比相混合，制成重懸細胞的軟材料混合物；
[0012]步驟四，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物；
[0013]步驟五，分別將所述步驟一中擴增培養(yǎng)的支氣管上皮細胞和軟骨細胞消化、重懸、計數(shù)并離心，棄去上清后，重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料；
[0014]步驟六，將所述步驟五中的支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料分別置于兩只低溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于3D打印機上備用；將所述步驟四中的硬材料混合物置于高溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.1毫米的打印機針頭，加載于3D打印機上備用；
[0015]步驟七，使用建模軟件構建貼合的三層矩形片狀結(jié)構模型，依次為上皮細胞層、軟骨細胞層和硬材料層，所述上皮細胞層由支氣管上皮細胞生物復合材料組成，所述軟骨細胞層由軟骨細胞生物復合材料組成，所述硬材料層由硬材料混合物組成；
[0016]步驟八，將結(jié)構模型導入打印機并進行3D打印，得到生物性復合氣管補片。
[0017]為進一步優(yōu)化上述技術方案，本發(fā)明所采取的技術措施還包括:
[0018]上述步驟八具體包括:
[0019]步驟1，將結(jié)構模型導入打印機驅(qū)動程序，分層解析；
[0020]步驟2，將一片無菌載玻片置于打印機作業(yè)平臺上，校準定位打印機針頭；
[0021]步驟3，設置打印機運行參數(shù):硬材料混合物加熱溫度為150-210°C，內(nèi)部結(jié)構間隙為0.2-0.5毫米，墨倉內(nèi)驅(qū)動氣壓為0.1-0.5Bar，針頭運行速度為5_10毫米/秒；支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料保持室溫，內(nèi)部結(jié)構間隙為0.1-0.3毫米，墨倉內(nèi)驅(qū)動氣壓為0.1-0.3Bar，針頭運行速度為7_13毫米/秒；
[0022]步驟4，啟動打印流程，按照設置的運行參數(shù)打印硬材料層；
[0023]步驟5，打印軟骨細胞層，完成軟骨細胞層的打印后暫停打印作業(yè)，用超聲霧化機將三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于軟骨細胞層上，使之充分交聯(lián)；
[0024]步驟6，繼續(xù)打印作業(yè)，打印上皮細胞層，完成后用超聲霧化機將三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于上皮細胞層上，使之充分交聯(lián)；
[0025]步驟7，用鑷子小心將制作完成的生物性復合氣管補片從載玻片上揭下，無菌條件下修剪成受體所需求的形狀。
[0026]上述步驟二為將10%膠原和5%透明質(zhì)酸按照質(zhì)體積比與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射24小時徹底滅菌，以8%質(zhì)量體積比分散于滅菌培養(yǎng)液中。
[0027]上述步驟四為將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物。
[0028]上述步驟五為分別將所述步驟一中擴增培養(yǎng)的支氣管上皮細胞和軟骨細胞消化、重懸、計數(shù)并離心，棄去上清后，按照I X 16個/毫升的細胞濃度重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料。
[0029]上述步驟七中構建的貼合的三層矩形片狀結(jié)構模型中，所述上皮細胞層和軟骨細胞層厚度為0.2毫米，所述硬材料層為0.6毫米。
[0030]上述步驟5中的三聚磷酸鈉水溶液我8 %三聚磷酸鈉水溶液。
[0031 ] 上述步驟6中的三聚磷酸鈉水溶液我8 %三聚磷酸鈉水溶液。
[0032]另一方面，本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述方法所制備的生物性復合氣管補片。
[0033]最后一方面，本發(fā)明還提供根據(jù)上述方法所制備的生物性復合氣管補片的應用。
[0034]本發(fā)明采用上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，具有如下技術效果:
[0035]本發(fā)明的生物材料配方生物相容性好，用于打印氣管補片，避免了對于供體氣管的依賴；本發(fā)明所用材料同時具備柔韌性和一定機械強度，補片的內(nèi)部結(jié)構設計亦有所改進，使之可以根據(jù)臨床需要進行彎折和修剪；將由受體自己的氣道上皮細胞和軟骨細胞擴增得到的種子細胞打印于補片上，避免了患者對于細胞的排異反應；制備時的種子細胞由終末分化的成熟細胞組成，避免了使用干細胞所帶來的誘導分化難題和成瘤風險；細胞的空間分布在打印中精確可控，按照組織學規(guī)律分布(上皮朝向管腔，軟骨朝向縱膈)加速了修復過程；植入的補片可在體內(nèi)降解，減少了異物殘留體內(nèi)所帶來的并發(fā)癥，避免了二次手術取出的風險。
【附圖說明】
[0036]圖1為本發(fā)明的生物性復合氣管補片的結(jié)構示意圖。
【具體實施方式】
[0037]本發(fā)明提供了一種制備生物性復合氣管補片的方法，包括以下步驟:
[0038]步驟一，利用支氣管鏡，無菌刷取支氣管上皮細胞，體外培養(yǎng)擴增；提取耳廓軟骨細胞，消化、分散，體外培養(yǎng)擴增；
[0039]步驟二，將膠原和透明質(zhì)酸與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射徹底滅菌，均勻分散于滅菌培養(yǎng)液中；
[0040]步驟三，將所述步驟二中所得的軟材料和培養(yǎng)液以1:1的體積比相混合，制成重懸細胞的軟材料混合物；
[0041]步驟四，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物；
[0042]步驟五，分別將所述步驟一中擴增培養(yǎng)的支氣管上皮細胞和軟骨細胞消化、重懸、計數(shù)并離心，棄去上清后，重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料；
[0043]步驟六，將所述步驟五中的支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料分別置于兩只低溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于3D打印機上備用；將所述步驟四中的硬材料混合物置于高溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.1毫米的打印機針頭，加載于3D打印機上備用；
[0044]步