專利名稱：一種具有生物活性的人工硬腦膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有生物活性的人工硬腦膜及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硬腦膜缺損在神經(jīng)外科臨床工作中常見，工業(yè)、交通、戰(zhàn)爭(zhēng)等原因造成的開放性顱 腦損傷、腫瘤的侵蝕、先天性腦膜缺損及其它顱腦疾患原因均可引發(fā)硬腦膜缺損。硬腦膜缺 損需及時(shí)修補(bǔ)以防腦脊液外溢，防止腦的膨出和大氣壓的壓迫，否則將危及人體生命。硬腦 膜缺損還能引發(fā)顱內(nèi)感染、腦粘連、皮下積液等并發(fā)癥，經(jīng)常會(huì)引起如癲痛、頭痛、腦功能障 礙等疾病。
目前硬腦膜的代用品雖有很多，修復(fù)硬腦膜的材料可分為自體筋膜、同種異體材
料、天然及人工合成材料、異種材料4類。目前市場(chǎng)上現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品各有其優(yōu)缺點(diǎn) ①目前自體筋膜重建硬腦膜仍然是臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，但術(shù)后早期腦脊液漏及皮下
積液的發(fā)生率仍然較高，易導(dǎo)致粘連等并發(fā)癥，可能引起供區(qū)不愈或功能障礙。 ②同種異體和異種材料無法完全避免免疫排斥，殘留的抗原會(huì)導(dǎo)致不同程度的炎
癥反應(yīng)，造成纖維變性和腦粘連。易對(duì)腦組織產(chǎn)生癱痕，剌激。同種異體材料來源受限，難以
形成商業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)由于異體或異種來源，無法安全避免帶來病毒傳播的危險(xiǎn)。例如來
源于牛的材料的人工腦膜，因歐洲瘋牛病發(fā)生后，其來源大打折扣，而安全性也大受懷疑。 ③合成的天然材料基本為天然膠原蛋白。但蛋白來源使其無法完全避免免疫排
斥。行修補(bǔ)時(shí)所用膠原蛋白容易被吸收，無法起著充分隔離頭皮軟組織與腦組織作用而不
利于之后的顱骨修補(bǔ)手術(shù)等問題，不利于術(shù)后處理。 ④不可吸收材料/部分吸收材料的不可吸收部分對(duì)受體永遠(yuǎn)是異物，可能導(dǎo)致慢 性炎癥反應(yīng)、術(shù)區(qū)感染、延期出血，在顱腦敏感區(qū)，會(huì)產(chǎn)生對(duì)中樞的壓迫并引起其它并發(fā)癥。
⑤不可吸收/部分吸收材料長(zhǎng)期存在于體內(nèi)，還會(huì)產(chǎn)生不同程度的結(jié)締組織增生 包裹，更嚴(yán)重的是溶脹碎裂和植入后周圍組織愈著形成纖維性包裹，即所謂"膜片致癌"。
⑥不同的不可吸收材料還各有不足如金屬類還不利于CT、核磁及放射檢查和治 療；硅橡膠生有凝血、吸收類脂物后會(huì)溶脹碎裂，抗張強(qiáng)度差等問題，滌綸布類外面可形成 較厚的癱痕，其下方易與腦粘連等缺點(diǎn)；碳纖維本身機(jī)械性能有限。 ⑦已有的可吸收人工腦膜產(chǎn)品在降解速度、降解性能上在有一定缺陷，臨床應(yīng)用 范圍有限。 總之，目前人工腦膜在臨床應(yīng)用上都存在著不足，缺少一種具有可被完全吸收、且 具有良好的柔韌性、彈性及生物組織相容性、防止腦粘連等綜合品質(zhì)較高的人工腦膜產(chǎn)品。 現(xiàn)有產(chǎn)品不利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及臨床推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有人工硬腦膜產(chǎn)品的不足，提供一種可被完全吸收、具有良好的柔韌性、彈性及生物組織相容性、防止腦粘連、可完全降解吸收且降解速度適中、能 促進(jìn)硬膜化過程、不帶病毒、無免疫排斥的、可根據(jù)需要任意裁剪、制備成本較低、生產(chǎn)周期 短、保存、運(yùn)輸容易、臨床應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣泛的具有生物活性的人工硬腦膜。
本發(fā)明的另一目的是提供上述人工硬腦膜的制備方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的 —種具有生物活性的人工硬腦膜，由納米仿生支架及附著于其上的水溶膠構(gòu)成， 所述水溶膠內(nèi)包覆有細(xì)胞因子和/或藥物。 所述人工硬腦膜至少包含相連的兩層結(jié)構(gòu)，面向大腦的一層為疏水性的防粘連電
紡層，背向大腦的一層為親水性的納米細(xì)胞支架層；所述面向大腦的一層和背向大腦的一
層之間還可以有過渡層；任意兩個(gè)相鄰層之間的連接方式優(yōu)選通過電紡連接。 所述親水性的納米細(xì)胞支架層由靜電紡制成，即背向大腦面的電紡層，為細(xì)胞支
架層，是為了有效誘導(dǎo)干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的遷入，該層則采用生物相容性好的親水性材
料，再者，通過靜電紡絲參數(shù)調(diào)整，設(shè)計(jì)上控制平均孔徑達(dá)到20 100i!M范圍。這樣有利
于成纖維細(xì)胞的遷入、粘附、增殖和生長(zhǎng)分化。 所述面向大腦的一層為防粘連層，采用疏水性材料，不利于細(xì)胞的遷入，從而達(dá)到 防粘連的目的；本發(fā)明對(duì)制備該層材料的靜電紡絲參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，控制防粘連電紡層孔徑 在3 i！ M以下。材料的孔隙孔徑在納米以下，比細(xì)胞小一到二個(gè)數(shù)量級(jí)，從而阻止細(xì)胞進(jìn) 入，防止腦粘連產(chǎn)生。因?yàn)槿梭w細(xì)胞直徑平均在10 20 ii M， 一般成纖維細(xì)胞直徑在20 30 ii M之間。腦膜主要分布成纖維細(xì)胞及其分泌的膠原纖維，平均孔徑在3 ii M以下，已經(jīng) 可以有效的防止腦粘連的產(chǎn)生。靜電紡纖維得到的孔隙大小分布很大程度上依賴于纖維直 徑，已知纖維直徑減小時(shí)，孔徑也在同時(shí)減小。據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，纖維直徑在4 10 ii M時(shí)， 孔徑為20 45 ii M。文獻(xiàn)報(bào)道，靜電紡再生絲素纖維非織造織物的平均孔徑可達(dá)到2 ii M。
在細(xì)胞支架層和防粘連層之間還可以通過靜電紡絲技術(shù)增加過渡層。所述過渡 層在細(xì)胞支架層和防粘連層之間起過渡作用，其孔徑為細(xì)胞支架層孔徑和防粘連層孔徑之 間；所用材料可以是細(xì)胞支架層和防粘連層兩層材料的混合，也可以是其它材料。過渡層的 孔徑可以是非均一的，從細(xì)胞支架層到防粘連層，不斷調(diào)整參數(shù)，其孔徑逐漸變小；材料也 可以是非均一的，實(shí)現(xiàn)方法可以參照細(xì)胞支架層或防粘連層。加入過渡層，是因?yàn)榧?xì)胞支架 層和防粘連層所用的材料性質(zhì)和孔徑相差比較大，僅管目前已有直接連接不同孔徑性能的 靜電紡絲層的報(bào)道，但在實(shí)際工藝操作過程中，增加過渡層，可以使細(xì)胞支架層和防粘連層 兩層接連更為自然穩(wěn)固。由上述說明不難看出，過渡層并非本發(fā)明人工硬腦膜的一個(gè)必不 可少的功能層，即使沒有過渡層本發(fā)明也仍然可以實(shí)施，但過渡層的加入可以從制備工藝 上使得本發(fā)明更好地實(shí)施，因此是一個(gè)優(yōu)選方案。 所述細(xì)胞因子是對(duì)成纖維細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化起作用的因子，如堿性成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。由于人工腦膜的主要作用是在硬膜再生之前起到密封腦、防止腦脊液 漏、保護(hù)腦的作用，納米仿生支架已經(jīng)為成纖維細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化提供了良好的 支架，同時(shí)由于細(xì)胞因子的作用，可以加速硬膜化的過程。本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞因子是對(duì)硬 膜化過程有促進(jìn)作用的因子，如堿性成纖維因子，堿性成纖維細(xì)胞因子是目前公認(rèn)的可以 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖并加速硬膜化過程的細(xì)胞因子，其它如白細(xì)胞介素，集落剌激因 子，TNF、血小板源生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子也有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，有加速腦硬膜化過程的作用。本發(fā)明
5通過下文將述及的制備方法將這些細(xì)胞因子成功包覆于水溶膠內(nèi)。 所述止血和防粘連藥物、抗感染藥物或抗腫瘤藥物的一種或藥學(xué)常規(guī)可混合使用 的幾種藥物的混合物，但通過本發(fā)明的制備方法以及材料的選擇將這些藥物成功包覆于水 溶膠內(nèi)，共同構(gòu)成人工腦膜的優(yōu)良產(chǎn)品。所述藥物優(yōu)選止血因子、曲尼斯特、放線菌素D、 尼莫司汀、長(zhǎng)春新堿、氨芐西林等。 止血藥物可以起到迅速止血，加快愈合，而防粘連藥物則可進(jìn)一步減少腦粘連的 產(chǎn)生。因?yàn)橛材X膜的修復(fù)在很多情況下是因?yàn)槟X腫瘤而導(dǎo)致的，而腦腫瘤的復(fù)發(fā)將導(dǎo)致硬 腦膜的再次損傷。在靜電紡電紡溶液中加入抗腫瘤藥物如放線菌素D、尼莫司汀等都可以降 低腦腫瘤的復(fù)發(fā)率。在因腦腫瘤而導(dǎo)致的硬腦膜修復(fù)手術(shù)中，加入這類藥物可大大降低腦 腫瘤的復(fù)發(fā)率?？垢腥舅幬锟蛇x自抗生素，如氨芐西林，螺旋霉素，磺胺，喹諾酮類抗生素等 可防止細(xì)菌感染，在臨床上可降低腦膜移植的感染率。 本發(fā)明的人工硬腦膜的制備是通過靜電紡制得納米仿生支架、利用生物打印技術(shù) 將水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架、水溶膠固化后即得人工硬腦膜。所述生物打印技 術(shù)是近年來出現(xiàn)的新技術(shù)。生物打印能按預(yù)定計(jì)劃精確定位，這和打印技術(shù)的特點(diǎn)是一致 的。生物打印與一般打印的不同僅在于其墨水和接受打印的紙張不一樣。生物打印的紙片 是在體內(nèi)可降解的生物紙片；生物打印的"生物墨水"是特制的細(xì)胞溶液或有生物活性的細(xì) 胞因子溶液。生物打印技術(shù)是將這種特制溶液噴射到可生物降解的生物紙片上。打印后再 將紙片按一定順序的堆疊。由于使用了打印技術(shù)，可以將細(xì)胞或/和細(xì)胞因子組成的生物 墨水精確的結(jié)合到預(yù)定部位；而按特定的堆疊方式的生物紙片則會(huì)形成三維結(jié)構(gòu)。理論上 如果所用的生物墨水是細(xì)胞溶液，則形成三維的組織結(jié)構(gòu)和器官，最后生物紙片降解，細(xì)胞 保留下來，形成立體結(jié)構(gòu)，例如，活的三維組織、血管和器官。但是生物打印技術(shù)仍處于基礎(chǔ) 研究的階段，相關(guān)文獻(xiàn)也集中于理論探討層面，還沒有出現(xiàn)直接利用細(xì)胞通過生物打印技 術(shù)制備人工器官的具體技術(shù)方案，也沒有任何采用生物打印技術(shù)成功制備人工硬腦膜的相 關(guān)報(bào)道。本發(fā)明基于上述理論，通過大量實(shí)驗(yàn)總結(jié)得到生物墨水的具體組成、生物紙片的具 體組成和制備方法、三維結(jié)構(gòu)的最終實(shí)現(xiàn)方案，從而解決了通過生物打印方法制備人工硬 腦膜的技術(shù)難題。 本發(fā)明利用生物打印技術(shù)制備人工硬腦膜的方法包括以下步驟 (1)制備電紡溶液、含有細(xì)胞因子和/或藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； (2)用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架；所述納米紡生支架紡成
至少兩層結(jié)構(gòu)，面向大腦的一層紡成疏水性的防粘連層，背向大腦的一層紡成親水性的細(xì)
胞支架層； (3)用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子和/或藥物的水溶膠溶液打印到所述納米仿生 支架上，水溶膠固化后即得人工硬腦膜。 上述方法中，步驟(2)和(3)可重復(fù)一次或者更多次，以得到不同厚度的硬腦膜。
所述"制備含有細(xì)胞因子和/或藥物的水溶膠溶液"也可以在步驟(2)和步驟(3) 之間進(jìn)行，不影響本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)。 所述水溶膠溶液中加入細(xì)胞因子和/或藥物；所述細(xì)胞因子或藥物同前所述。
所述水溶膠可以是以下聚合物制成的水溶膠多糖類聚合物，如淀粉、纖維素、海 藻酸、透明質(zhì)酸或殼聚糖；多肽類聚合物，如膠原、聚L 賴氨酸或聚L 谷胺酸；合成的親基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N 聚代丙烯酰胺。上述聚 合物制備的水溶膠通過改變溫度、酸堿度、經(jīng)紫外線照射或者加入交聯(lián)劑(固化液)等方 法，可由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)。 所述電紡溶液是一種或兩種以上聚合物混合的電紡溶液，親水性聚合物材料選自 硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸、改性纖維素、海藻酸、淀粉、纖維素、明膠、纖維蛋 白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、親水性聚氨酯、聚乙 二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚乙 烯醇或聚丙交酯；疏水性聚合物材料選自疏水性聚氨酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙 交酯或聚對(duì)苯二甲酸乙二酯。由于目前高分子材料改性研究在不斷發(fā)展，原本親水性材料 改性為疏水或疏水材料改性為親水都越來越常見，范圍也越來越廣。 將上述材料溶于一定的溶劑，形成電紡液，就可以通過靜電紡絲技術(shù)制得納米仿 生支架。 上述電紡溶液的溶劑可以為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰 胺、四氫呋喃、二甲基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、 二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它們的任意混合物。上述的高分子材料和溶劑用于靜電 紡絲的相關(guān)技術(shù)，例如材料與溶劑的重量比例等參照現(xiàn)有技術(shù)。
所述防粘連層的靜電紡的優(yōu)選工藝參數(shù)為 微量注射泵的速率為0. 1 5. 0毫升/小時(shí)，高壓發(fā)生器的電壓為5 40KV，接收 距離為5. 0 30. 0厘米。細(xì)胞支架層的靜電紡的工藝參數(shù)為0. 5 20. 0毫升/小時(shí)，調(diào) 節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為10 45KV，調(diào)節(jié)接收裝置的接收距離為5. 0 30. 0厘米。此處通 過靜電紡制備得到纖維直徑平均孔徑在3 ii M或以下，纖維直徑在50 1000nM之間。
所述疏水性的電紡溶液可選擇疏水性的L 聚乳酸和e 己內(nèi)酯，兩者重量比為 50 : 50或30 : 70或70 : 30，作為共聚高分子材料，數(shù)均分子量是150000 5(K)000，溶 于六氟異丙醇或二氯甲烷；可用溶液總重量百分比8 14%的聚己內(nèi)酯的氯仿/甲醇混合 溶液；或者其他合適的聚合物及溶劑。 疏水性電紡支架層作為"生物紙片"，可在其上打印止血和防粘連藥物、抗感染藥
物及抗腫瘤藥物，也可用混紡紡入，具體的混紡方法可以參考現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)內(nèi)容。 將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為0. 1 10毫升/
小時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為10 45KV，調(diào)節(jié)接收裝置的接收距離為10 40厘米，并將
纖維接收為膜狀結(jié)構(gòu)。 此處通過靜電紡制備得到纖維直徑平均孔徑在3iiM或以下。纖維直徑在50 1000nM之間。 所述親水性的電紡溶液選擇的親水性材料作制備細(xì)胞支架層，可以選用親水性聚 氨酯或者天然明膠、纖維素、殼聚糖、硫酸軟骨素等親水性材料；優(yōu)選的方案親水性聚氨 酯，與/或天然明膠，硫酸軟骨素、聚乙二醇，重量比20 80 : 80 20，紡絲液為溶液總重 量的3 15% ;或者用親水性聚氨酯與天然明膠，或硫酸軟骨素，重量比20 80 : 80 20，紡絲液為溶液總重量的3 15% ;也可選用其他合適聚合物及溶劑，親水性的納米細(xì)胞 支架層孔徑為20 200 ii M。納米細(xì)胞支架層纖維直徑介于5 200 ii M。
以親水性納米支架層作為生物紙片，可以在其上打印細(xì)胞因子，止血藥物、防粘連藥物、抗感染藥物或抗腫瘤藥物。 所述親水性電紡支架層的靜電紡絲參數(shù)如下接收距離從15 25cm，電壓15 45KV，纖維平均直徑在500 10000nm開啟靜電紡絲，在已紡好的防粘連層上繼續(xù)紡細(xì)胞支架層。 所述電紡溶液中添加藥物或因子的優(yōu)選方案是含有溶液質(zhì)量百分比濃度為 0. 001 0. 05%的堿性成纖維細(xì)胞成長(zhǎng)因子，溶液質(zhì)量百分比濃度為3%的芐氨西林，溶液 質(zhì)量百分比濃度為O. 001 0. 05%的止血因子，在用于因腦腫瘤而導(dǎo)致的腦膜修復(fù)手術(shù) 中，可以包含有0. 01 5%的尼莫司汀。 所述過渡層溶液中的靜電紡絲參數(shù)如下接收距離從10 30cm，電壓10 45KV， 開啟靜電紡絲，在已紡好的防粘連層上繼續(xù)紡過渡層，在過渡層上繼續(xù)紡細(xì)胞支架層。
過渡層可以添加藥物或因子，也可以不添加。 因?yàn)檫^渡層所采用的工藝參數(shù)是在細(xì)胞支架層和防粘連層之間，所以，由于過渡 層的連接，可能使制備的防粘連層和細(xì)胞支架層之間的接連有緩沖區(qū)，孔徑和材料變化不 至于過于突兀，從而影響人工腦膜產(chǎn)品的應(yīng)用效果。 優(yōu)選方案為聚氨酯與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為70 : 30，紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。纖 維平均直徑在500 20000nm。 上述用生物打印制備所述雙層人工腦膜更具體的步驟是 1、制備防粘連層制備防粘連層的電紡溶液、含有藥物或止血因子的水溶膠溶液 和交聯(lián)劑溶液； (1)將配置好的0. 1M交聯(lián)劑溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于靜電紡絲 裝置及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專利報(bào)道進(jìn)行改裝， 例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用 作止血因子定位打印。 (2)用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得防粘連層的納米仿生支架；所用靜電紡 絲參數(shù)為前述的防粘連層靜電紡參數(shù)。 (3)用噴墨打印機(jī)將含有止血因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架上，水 溶膠固化后即得。 步驟(2)、 (3)可以重復(fù)，直到得到適合厚度的防粘連層。關(guān)閉靜電紡絲和打印。 調(diào)整靜電紡絲和打印的材料和參數(shù)。
2、制備細(xì)胞支架層制備細(xì)胞支架層的電紡溶液、含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液；
(1)在紡好的防粘連層上，繼續(xù)接收靜電紡絲，制得細(xì)胞支架層的納米仿生支架， 所制得的細(xì)胞支架層仍浸于前述的交聯(lián)劑溶液中；這里所采用的靜電紡絲參數(shù)是細(xì)胞支架 層的電紡參數(shù)，電紡參數(shù)同上。
(3)用噴墨打印機(jī)將含有堿性成纖維細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生
支架上，水溶膠固化后即得。
(2) 、 (3)可重復(fù)以得到合適的厚度。 制得的產(chǎn)品經(jīng)清洗、滅菌，包裝后貯存，本發(fā)明人工硬腦膜保存、運(yùn)輸容易。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果( — )本發(fā)明提供了一種新的修復(fù)硬腦膜的材料，解決了現(xiàn)有產(chǎn)品易發(fā)生腦粘連、易帶病毒、易產(chǎn)生免疫排斥等缺陷，本發(fā)明硬腦膜具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、機(jī)械特性能滿足適應(yīng)癥對(duì)抗拉伸強(qiáng)度及柔韌性的要求。 2、雙層設(shè)計(jì)，內(nèi)側(cè)面(即面向大腦的一面)光滑，能防粘連，能起著很好地隔離頭 皮軟組織與腦組織的作用，外側(cè)面(即背向大腦的一面)和側(cè)邊則為多孔結(jié)構(gòu)，允許細(xì)胞長(zhǎng) 入；可促使盡早自體成纖維細(xì)胞以及某些未分化的細(xì)胞向膠原內(nèi)部沁潤生長(zhǎng)浸潤，促使腦 膜早日修復(fù)。利于日后進(jìn)行顱骨修復(fù)手術(shù)。 3、能夠在新生組織生成后被完全吸收的，避免了膜片致癌。 4、不含活細(xì)胞成分，不使用外源細(xì)胞和蛋白，免除了因此而帶來免疫排斥、病毒傳 播、疾病傳染的諸多風(fēng)險(xiǎn)；能杜絕疾病傳播。 5、使用的材料是目前已經(jīng)證實(shí)對(duì)人體無毒無害的安全生物材料，具有良好的生物 組織相容性，無異物排斥反應(yīng)，無毒性反應(yīng)，無致癌、致畸作用。不會(huì)帶來免疫排斥、病毒傳 播、疾病傳染的諸多風(fēng)險(xiǎn)，也不會(huì)帶來其它毒害作用； 6、人工腦膜材料來源充分，成本較低，避免了天然材料來源不足，成本高，改性復(fù) 雜的缺點(diǎn)，貯存運(yùn)輸簡(jiǎn)單。 7、人工腦膜的制備方法工藝步驟簡(jiǎn)化，生產(chǎn)時(shí)間短，能有效避免加工過程中產(chǎn)品 受到污染，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)容易實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)低成本、高效率的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 8、根據(jù)本發(fā)明制備的人工腦膜臨床應(yīng)用簡(jiǎn)單，由于在處理中沒有引入戊二醛等毒 性物質(zhì)，在臨床應(yīng)用時(shí)不需要再進(jìn)行嚴(yán)格的浸泡和清洗，也因此避免了由于提前浸泡造成 的預(yù)選尺寸不夠而使產(chǎn)品報(bào)廢的情況。 ( 二 )本發(fā)明成功利用生物打印技術(shù)將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng) 因子等細(xì)胞因子按設(shè)計(jì)要求，精確結(jié)合于納米支架上。采用生物打印技術(shù)結(jié)合納米支架，可 以達(dá)到細(xì)胞因子有效按所的濃度和精確位點(diǎn)結(jié)合，可以同時(shí)結(jié)合多種不同濃度、不同分布 的不同細(xì)胞因子，納米支架同時(shí)作為細(xì)胞因子緩釋控制體系，細(xì)胞因子可控釋放。這樣可以 最大限度模擬體內(nèi)生理環(huán)境，形成有利于成細(xì)胞遷移、聚集、分化的微環(huán)境，吸引成纖維細(xì) 胞進(jìn)入硬腦膜缺損部位，并聚集、分化，加速了硬膜化過程；與沒有加入細(xì)胞因子的人工腦 膜相比，或者與單純用混紡技術(shù)加入細(xì)胞因子的人工腦膜相比，其過程大為縮短。因此，可 在臨床上加速創(chuàng)傷愈合，縮短病程，減輕病人痛苦。(三)本發(fā)明用生物打印將藥物加入了人工腦膜，比單純利用靜電紡絲技術(shù)的人 工腦膜相比，可有效防止感染、防粘連、防腦腫瘤復(fù)發(fā)。此種效應(yīng)與沒有加入藥物的人工腦 膜相比，其感染率大為降低，腦粘連發(fā)生率和腦腫瘤復(fù)發(fā)率大為降低。而且，由于用生物打 印技術(shù)可以精確定位，加入的藥物的量可以按需要調(diào)節(jié)，比如急性感染期濃度更高(即人 工腦膜表面)，慢性感染期(即人工腦膜里)濃度低，這不僅減輕了藥物的用量，更重要的 是，在顱腦敏感區(qū)降低藥物用量之后，減少了隨之而來的藥物不良反應(yīng)。


圖1實(shí)施例1制得的人工腦膜結(jié)構(gòu)示意圖，1為細(xì)胞支架層，2為堿性成纖維細(xì)胞 因子，3為防粘連層，4為抗生素，5為止血和防粘連藥物。
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具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
實(shí)施例1 (1)制備電紡溶液、含有藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液 電紡液選擇疏水性的L-聚乳酸和e-己內(nèi)酯，兩者比值為50 : 50，作為共聚高分 子材料，數(shù)均分子量是260000，溶于六氟異丙醇。
交聯(lián)劑溶液選用0. 1M氯化鈣溶液。 含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用止血因子藻酸鹽溶液，所述細(xì)胞因子藻酸鹽溶液 中止血因子的質(zhì)量百分比濃度為10卯m。 將配置好的0. 1M氯化鈣溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于靜電紡絲裝置 及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專利報(bào)道進(jìn)行改裝，參照 美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作止血因子 定位打??；將配好的細(xì)胞因子藻酸鹽溶液裝入噴墨打印墨盒中；本實(shí)施例采用的墨盒型號(hào) 為HP51626A。 (2)用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架 將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)， 調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為30KV，調(diào)節(jié)接收裝置的接收距離為20厘米，用并將纖維接收為膜 狀結(jié)構(gòu)。靜電紡絲20分鐘，關(guān)閉靜電紡絲。 (3)用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架上，水 溶膠固化后即得。 紡絲和打印重復(fù)5次，制得防粘連層厚度約0. 2mm。
此處通過靜電紡制備得到纖維直徑平均300nm。
2、制備細(xì)胞支架層 制備電紡溶液、含有藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； 采用親水性材料，聚乙二醇與硫酸軟骨素質(zhì)量比為70 : 30，紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 9%，交聯(lián)劑溶液選用0. 1M氯化鈣溶液。 含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用堿性成纖維細(xì)胞因子的藻酸鹽溶液，所述細(xì)胞因 子藻酸鹽溶液中堿性成纖維因子的質(zhì)量百分比濃度為100ppm。 (1)將配置好的0. 1M氯化鈣溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于靜電紡絲 裝置及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專利報(bào)道進(jìn)行改裝， 例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用 作止血因子定位打印。將配好的細(xì)胞因子藻酸鹽溶液裝入噴墨打印墨盒中。本實(shí)施例采用 的墨盒型號(hào)為HP51626A。 (2)用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架； 將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為0. 8毫升/小 時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為20KV，調(diào)節(jié)接收裝置的接收距離為11厘米，用并將纖維接收 為膜狀結(jié)構(gòu)。靜電紡絲20分鐘，關(guān)閉靜電紡絲。 (3)用噴墨打印機(jī)將含有堿性成纖維細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生 支架上，水溶膠固化后即得。制得的人工腦膜見圖1所示，1為細(xì)胞支架層，2為堿性成纖維細(xì)胞因子，3為防粘連層，4為抗生素，5為止血和防粘連藥物。 紡絲和打印重復(fù)10次，制得防粘連層厚度約0. 4mm 纖維平均直徑在10 ii m 3、清洗，滅菌，包裝。 實(shí)施例2 1、制備防粘連層 (1)制備電紡溶液、含有藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液 電紡液選擇疏水性的L-聚乳酸和e-己內(nèi)酯，兩者比值為50 : 50，作為共聚高分 子材料，數(shù)均分子量是260000，溶于六氟異丙醇。
交聯(lián)劑溶液選用0. 1M氯化鈣溶液。 含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用止血因子藻酸鹽溶液，所述細(xì)胞因子藻酸鹽溶液 中止血因子的質(zhì)量百分比濃度為10卯m。 將配置好的0. 1M氯化鈣溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于靜電紡絲裝置 及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專利報(bào)道進(jìn)行改裝，參照 美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作止血因子 定位打??；將配好的細(xì)胞因子藻酸鹽溶液裝入噴墨打印墨盒中；本實(shí)施例采用的墨盒型號(hào) 為HP51626A。 (2)用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架 將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為5毫升/小時(shí)， 調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為30KV，調(diào)節(jié)接收裝置的接收距離為20厘米，用并將纖維接收為膜 狀結(jié)構(gòu)。靜電紡絲20分鐘，關(guān)閉靜電紡絲。 (3)用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架上，水 溶膠固化后即得。 紡絲和打印重復(fù)5次，制得防粘連層厚度約0. 2mm。
此處通過靜電紡制備得到纖維直徑平均300nm。
2、制備過渡層 (1)制備電紡溶液、含有藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液 電紡液選擇以下方案聚氨酯與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為70 : 30，紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%?；旌习逼S西林，濃度為3%。得到均一溶液。。
交聯(lián)劑溶液選用0. 1M氯化鈣溶液。 含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用止血因子藻酸鹽溶液，所述細(xì)胞因子藻酸鹽溶液 中止血因子的質(zhì)量百分比濃度為10卯m。 將配置好的O. 1M氯化鈣溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于靜電紡絲裝置 及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專利報(bào)道進(jìn)行改裝，參照 美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作止血因子 定位打?。粚⑴浜玫募?xì)胞因子藻酸鹽溶液裝入噴墨打印墨盒中；本實(shí)施例采用的墨盒型號(hào) 為HP51626A。 (2)用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架 將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為4毫升/小時(shí)，
11調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為20KV，調(diào)節(jié)接收裝置的接收距離為11厘米，用并將纖維接收為膜 狀結(jié)構(gòu)。靜電紡絲20分鐘，關(guān)閉靜電紡絲。 (3)用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架上，水 溶膠固化后即得。 紡絲和打印重復(fù)3次，制得防粘連層厚度約0. lmm。.
纖維平均直徑在5iim。
3、制備細(xì)胞支架層 制備電紡溶液、含有藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； 采用親水性材料，聚乙二醇與硫酸軟骨素質(zhì)量比為70 : 30，紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 9%，交聯(lián)劑溶液選用0. 1M氯化鈣溶液。 含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用堿性成纖維細(xì)胞因子的藻酸鹽溶液，所述細(xì)胞因 子藻酸鹽溶液中堿性成纖維因子的質(zhì)量百分比濃度為100ppm。 (1)將配置好的0. 1M氯化鈣溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于靜電紡絲 裝置及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專利報(bào)道進(jìn)行改裝， 例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用 作止血因子定位打印。將配好的細(xì)胞因子藻酸鹽溶液裝入噴墨打印墨盒中。本實(shí)施例采用 的墨盒型號(hào)為HP51626A。 (2)用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架； 將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量注射泵的速率為0. 8毫升/小 時(shí)，調(diào)節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為20KV，調(diào)節(jié)接收裝置的接收距離為11厘米，用并將纖維接收 為膜狀結(jié)構(gòu)。靜電紡絲20分鐘，關(guān)閉靜電紡絲。 (3)用噴墨打印機(jī)將含有堿性成纖維細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生 支架上，水溶膠固化后即得。 紡絲和打印重復(fù)15次，制得防粘連層厚度約0.3mm。.
纖維平均直徑在10 ii m。
3、清洗，滅菌，包裝。
實(shí)施例3 用實(shí)施例1制得的硬腦膜進(jìn)行犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)犬體重15 20KG，年齡1.5 2歲，雌雄不拘，共5只。以氯胺酮肌肉注射全 麻，麻醉剃毛后，將動(dòng)物置于專用手術(shù)臺(tái)上，腹臥位。用2%碘酒和75%酒精消毒。動(dòng)物頭 頂正中，縱向切開。用剝離器分離骨膜，暴露雙頂部顱骨板，用高速磨鉆磨開顱骨，雙頂部形 成骨窗。用小剪刀剪掉雙側(cè)頂部3cmX3cm大小的矩形硬腦膜，制造出頂部的硬腦膜缺損。 在暴露的腦表面電灼，造成6個(gè)lmmXlmm大小的損傷點(diǎn)。將用本發(fā)明實(shí)施例1所制備的人 工腦膜修剪成相應(yīng)形狀及尺寸的修補(bǔ)材料，防粘連層向腦表面，用4/0無損傷絲線間斷縫 合，針距4mm，修補(bǔ)于犬頂部的缺損。用圓針4號(hào)絲線縫合肌肉。術(shù)后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)的喂 養(yǎng)及觀察。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)良好，切口愈合良好，無腦脊液漏，無癲癇發(fā)生。術(shù)后進(jìn)食進(jìn)水正 常，動(dòng)物的戶外活動(dòng)正常，沒有發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，存活至預(yù)定期限。 術(shù)后12個(gè)月，動(dòng)物以手術(shù)部位為中心，在大于手術(shù)部位lcm范圍切取標(biāo)本，使其包 括人工腦膜及周邊硬腦膜及內(nèi)面的腦組織。切取出標(biāo)本后，可見人工腦膜與硬腦膜的連接處對(duì)合平整，無分界，已完全愈合，僅見縫合的絲線。原生硬腦膜之間未見明顯充血，出血等
排異反應(yīng)。 實(shí)施例4 用實(shí)施例2制得的硬腦膜進(jìn)行新西蘭兔動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物施行頂部開顱，人為制造部分硬腦膜缺損及腦組織損傷，然后以人工 腦膜分別實(shí)施硬腦膜修補(bǔ)術(shù)。術(shù)后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)的喂養(yǎng)及觀察。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)良好。術(shù) 后12個(gè)月，動(dòng)物以手術(shù)部位為中心，在大于手術(shù)部位lcm范圍切取標(biāo)本，使其包括人工腦膜 及周邊硬腦膜及內(nèi)面的腦組織。切取出標(biāo)本后，可見內(nèi)側(cè)表面可見上皮細(xì)胞覆蓋，上皮下可 見纖維組織增生，纖維母細(xì)胞增生，膠原纖維增多，致使材料內(nèi)帶血運(yùn)的新生組織增生，宿 主新生組織侵入，材料降解，總量明顯減少，內(nèi)部可見毛細(xì)血管。新老組織界面無中性粒細(xì) 胞，淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞反應(yīng)，界面處無囊壁形成。蛛網(wǎng)膜及腦組織正常。
1權(quán)利要求
一種具有生物活性的人工硬腦膜，其特征是由納米仿生支架及附著于其上的水溶膠構(gòu)成，所述水溶膠內(nèi)包覆有細(xì)胞因子和/或藥物；所述納米仿生支架至少包含相連的兩層結(jié)構(gòu)，面向大腦的結(jié)構(gòu)層為疏水性的防粘連電紡層，背向大腦的結(jié)構(gòu)層為親水性的納米細(xì)胞支架層。
2. 如權(quán)利要求1所述的人工硬腦膜，其特征在于所述防粘連電紡層和納米細(xì)胞支架層 之間還有過渡層。
3. 如權(quán)利要求2所述的人工硬腦膜，其特征在于納米細(xì)胞支架層孔徑為20 200 M ; 防粘連電紡層孔徑在3yM以下；所述過渡層孔徑在納米細(xì)胞支架層孔徑和防粘連電紡層 孔徑之間。
4. 如權(quán)利要求1或2或3所述的人工硬腦膜，其特征在于所述細(xì)胞因子是對(duì)硬膜化過 程有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子；所述藥物是止血藥物、防粘連藥物、抗感染藥物或抗腫瘤藥物的 一種或藥學(xué)常規(guī)可混合使用的幾種藥物的混合物。
5. 如權(quán)利要求4所述的納米仿生人工硬腦膜，其特征在于所述對(duì)硬膜化過程有促進(jìn)作 用的細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素、集落剌激因子、腫瘤壞死因子、血小板源生長(zhǎng)因子或堿性成 纖維細(xì)胞因子的一種或幾種。
6. 如權(quán)利要求1或2或3所述的人工硬腦膜，其特征在于所述電紡層或支架層均是采 用支架材料通過靜電紡絲技術(shù)制備得到，所述支架材料為聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯、聚 氨酯、聚乙二醇、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸 己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L 乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、 聚對(duì)二惡酮、丙交酯、乙交酯、丁內(nèi)酯、戊內(nèi)酯、己內(nèi)酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、聚氨酯類、聚碳 酸酯、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲 蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、海藻酸、硫酸軟骨素、肝素、瓊脂、葡聚糖或褐藻酸的任意 一種或兩種以上材料的混合物。
7. —種權(quán)利要求1或2或3所述人工硬腦膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1) 制備電紡溶液、含有細(xì)胞因子和/或藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液；(2) 用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架；所述納米紡生支架紡成至少 兩層結(jié)構(gòu)，面向大腦的一層紡成疏水性的防粘連層，背向大腦的一層紡成親水性的細(xì)胞支 架層；(3) 用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子和/或藥物的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架 上，水溶膠固化后即得。
8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述含有細(xì)胞因子和/或藥 物的水溶膠溶液的制備在步驟(2)和步驟(3)之間進(jìn)行。
9. 如權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于步驟(2)和(3)重復(fù)若干次。
10. 如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述水溶膠是以多糖類聚合物、多肽類 聚合物或合成的親水高分子聚合物制成的水溶膠；所述多糖類聚合物為淀粉、纖維素、海藻 酸、透明質(zhì)酸或殼聚糖；所述多肽類聚合物為膠原、聚L 賴氨酸或聚L 谷胺酸；所述合 成的親水高分子聚合物為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N 聚代丙烯酰胺；所述電紡溶液的溶劑為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋 喃、二甲基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸或水的任意一種或者它們?nèi)我獗壤幕旌衔铩?br> 全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有生物活性的人工硬腦膜，是由納米仿生支架及附著于其上的水溶膠構(gòu)成，所述水溶膠內(nèi)包覆有細(xì)胞因子和/或藥物；所述納米仿生支架至少包含相連的兩層結(jié)構(gòu)，面向大腦的結(jié)構(gòu)層為疏水性的防粘連電紡層，背向大腦的結(jié)構(gòu)層為親水性的納米細(xì)胞支架層。本發(fā)明還提供了所述人工硬腦膜的制備方法，包括如下步驟制備電紡溶液、含有細(xì)胞因子和/或藥物的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液；用靜電紡和生物打印制備人工硬腦膜。本發(fā)明同時(shí)利用生物打印技術(shù)和靜電紡絲技術(shù)制作的人工腦膜，細(xì)胞因子可以做到有效按濃度和位置要求分布，腦膜化過程是最快最適當(dāng)?shù)?，同時(shí)，由于用生物打印技術(shù)可以精確定位和定量，減少了隨之而來的藥物不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61L27/14GK101692986SQ20091013948
公開日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者徐弢, 袁玉宇 申請(qǐng)人:廣州邁普再生醫(yī)學(xué)科技有限公司;