本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種可促真皮再生的凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

皮膚作為人體覆蓋面積最大的器官，起到保護(hù)人體不受外界和微生物的侵害、維持體內(nèi)水分、電解質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)的作用，其重要性不言而喻。皮膚分為三層：表皮層、真皮層及皮下組織，其作為人體最外層組織極易因物理、機(jī)械或熱力等外界因素所造成人體皮膚、粘膜、組織的缺損或破環(huán)。創(chuàng)傷按照創(chuàng)面的愈合時(shí)間分為急性創(chuàng)面和慢性難愈合創(chuàng)面。

針對慢性難愈合創(chuàng)面，目前大多敷料對創(chuàng)面僅起到物理遮擋保護(hù)、吸收滲液、營造濕潤微環(huán)境乃至殺菌的作用。雖然這類敷料作為臨時(shí)性皮膚保護(hù)物已經(jīng)在臨床上得到良好效果，但是這類產(chǎn)品一般為不可吸收材料構(gòu)成，需要更換，并進(jìn)行進(jìn)一步的植皮手術(shù)才能完成皮膚的再生修復(fù)。此外，目前國內(nèi)外的永久性真皮代用品主要包括異體真皮替代物、合成基質(zhì)真皮替代物及脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。這些產(chǎn)品雖具有較佳皮膚再生修復(fù)效果，但是仍存在免疫反應(yīng)、潛伏感染、缺乏皮膚組織功能性等不足。因此具有皮膚組織再生誘導(dǎo)功能，完整構(gòu)建皮膚組織的結(jié)構(gòu)和功能性的生物可吸收皮膚組織再生材料是今后皮膚再生修復(fù)的主要技術(shù)發(fā)展方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供的一種可促真皮再生的凝膠及其制備方法，更好的克服了上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和缺陷，該可促真皮再生的凝膠作為創(chuàng)面缺損的永久性真皮替代物，除具有一定力學(xué)強(qiáng)度、呈半透明狀、可降解外，還同時(shí)具備納米纖維多孔結(jié)構(gòu)、去細(xì)胞生物活性成分，不僅利于后期組織再生情況觀察，還能營造有利于皮膚再生的微環(huán)境，提供必要的營養(yǎng)成分，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移爬行，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為具有積極效應(yīng)。

一種可促真皮再生的凝膠，所述凝膠為互穿的納米纖維多孔結(jié)構(gòu)；用于形成所述凝膠的原料以重量份數(shù)計(jì)包括：脫細(xì)胞基質(zhì)0.1～10份和消化液90～99.9份，所述消化液為含有胃蛋白酶的鹽酸溶液。

進(jìn)一步地，所述原料以重量份計(jì)還包括：交聯(lián)劑0.15～300份。

進(jìn)一步地，所述交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺與n-羥基琥珀酰亞胺的混合物。

本發(fā)明還提供了一種可促真皮再生的凝膠的制備方法，所述可促真皮再生的凝膠為如上述的可促真皮再生的凝膠，所述制備方法包括以下步驟：

(1)將所述脫細(xì)胞基質(zhì)冷凍干燥，打碎成粉末，所述脫細(xì)胞基質(zhì)采用人源或非人源性去細(xì)胞組織器官基質(zhì)經(jīng)脫細(xì)胞處理工藝除去會造成免疫反應(yīng)的殘余細(xì)胞、dna物質(zhì)得到；

(2)用所述消化液室溫下消化脫細(xì)胞基質(zhì)粉末，然后將消化后溶液進(jìn)行離心，離心得到作為脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液的的上清液；

(3)用0.1mnaoh溶液調(diào)節(jié)所述脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液中消化液的ph，使ph＞8，再用0.1mhcl溶液調(diào)節(jié)至中性，加入10×pbs，混勻后靜置培養(yǎng)，生成凝膠pdsm-gel；其中，所述10×pbs的用量為所述脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液體積的1/8～1/10。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述脫細(xì)胞處理工藝具體包括將人源或非人源的器官或組織基質(zhì)經(jīng)除去多余脂肪和肌肉組織后，剪成小塊，然后在4～8℃下加入水溶液經(jīng)振蕩、漂洗、萃取，脫去組織中的細(xì)胞，洗去會造成免疫反應(yīng)的dna物質(zhì)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，還包括將所述脫細(xì)胞基質(zhì)粉末過50～80目篩。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述消化時(shí)間為6～48h。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述離心的速度為20000～40000rpm，所述離心的時(shí)間為30～60min，所述離心在溫度為4～8℃下進(jìn)行。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述靜置培養(yǎng)過程中的溫度為37℃，所述靜置培養(yǎng)時(shí)間為4～10min。

進(jìn)一步地，在步驟(3)之后還包括將所述凝膠pdsm-gel在25～37℃下浸泡于交聯(lián)劑中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固定3～24h得到交聯(lián)后的凝膠pdsm-gel。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一種可促真皮再生的凝膠及其制備方法的有益效果是：

1、本發(fā)明的可促真皮再生的凝膠成分與皮膚組織活性成分接近，可以為組織再生提供良好的生物功能。

2、本發(fā)明的可促真皮再生的凝膠初步成型條件為正常的人體生理?xiàng)l件，適宜體內(nèi)應(yīng)用，可直接注射使用，也可體外成型加交聯(lián)劑固定后植入創(chuàng)面。

3、本發(fā)明的可促真皮再生的凝膠的力學(xué)性能和降解時(shí)間具有可控性，可以通過調(diào)節(jié)脫細(xì)胞基質(zhì)的含量、消化時(shí)間、引入交聯(lián)劑的方式增大凝膠模量，延長降解時(shí)間，來適用不同的類型創(chuàng)面修復(fù)需求。

4、本發(fā)明的可促真皮再生的凝膠有類似于真皮組織層的可吸收降解納米纖維多孔結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞遷移、粘附、增殖，能為創(chuàng)面營造一個(gè)可再生微環(huán)境。

5、本發(fā)明的可促真皮再生的凝膠成半透明狀，利于在使用過程中觀察創(chuàng)面血管化及肉芽再生的情況。

6、本發(fā)明的可促真皮再生的凝膠成膠機(jī)理可以用來負(fù)載一些含氨基、羧基的營養(yǎng)因子、藥物等促進(jìn)創(chuàng)面再生和修復(fù)的成分，起到不同的功能化及緩釋作用。

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合所附附圖，作詳細(xì)說明如下。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel的sem圖(放大500倍)；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel的sem圖(放大15000倍)；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)的sem圖(放大500倍)；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)的sem圖(放大15000倍)；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel和本發(fā)明實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)的力學(xué)強(qiáng)度測試圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)1天的活細(xì)胞圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)1天的死細(xì)胞圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)5天的活細(xì)胞圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)5天的死細(xì)胞圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例的方式對本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)說明，在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。

但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。

除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)以及科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。當(dāng)存在矛盾時(shí)，以本說明書中的定義為準(zhǔn)。

如本文所用之術(shù)語：

“由……制備”與“包含”同義。本文中所用的術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它變形，意在覆蓋非排它性的包括。例如，包含所列要素的組合物、步驟、方法、制品或裝置不必僅限于那些要素，而是可以包括未明確列出的其它要素或此種組合物、步驟、方法、制品或裝置所固有的要素。

連接詞“由……組成”排除任何未指出的要素、步驟或組分。如果用于權(quán)利要求中，此短語將使權(quán)利要求為封閉式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但與其相關(guān)的常規(guī)雜質(zhì)除外。當(dāng)短語“由……組成”出現(xiàn)在權(quán)利要求主體的子句中而不是緊接在主題之后時(shí)，其僅限定在該子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作為整體的所述權(quán)利要求之外。

當(dāng)量、濃度、或者其它值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍、或一系列上限優(yōu)選值和下限優(yōu)選值限定的范圍表示時(shí)，這應(yīng)當(dāng)被理解為具體公開了由任何范圍上限或優(yōu)選值與任何范圍下限或優(yōu)選值的任一配對所形成的所有范圍，而不論該范圍是否單獨(dú)公開了。例如，當(dāng)公開了范圍“1～5”時(shí)，所描述的范圍應(yīng)被解釋為包括范圍“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。當(dāng)數(shù)值范圍在本文中被描述時(shí)，除非另外說明，否則該范圍意圖包括其端值和在該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。

“和/或”用于表示所說明的情況的一者或兩者均可能發(fā)生，例如，a和/或b包括(a和b)和(a或b)；

本發(fā)明提供了一種可促真皮再生的凝膠，所述凝膠為互穿的納米纖維多孔結(jié)構(gòu)；用于形成所述凝膠的原料以重量份數(shù)計(jì)包括：脫細(xì)胞基質(zhì)0.1～10份如0.1份、0.5份、1份、2份、5份、8份或10份等，和消化液90～99.9份如90份、92份、95份、97份、98份、99份或99.9份等。所述脫細(xì)胞基質(zhì)采用人源或非人源組織器官基質(zhì)經(jīng)脫細(xì)胞處理工藝除去會造成免疫反應(yīng)的殘余細(xì)胞、dna等物質(zhì)得到，所述消化液為含有胃蛋白酶的鹽酸溶液。優(yōu)先地，所述含有胃蛋白酶的鹽酸溶液的濃度為0.01m。

需要說明的是，上述脫細(xì)胞基質(zhì)為取自真皮、脂肪、小腸粘膜的脫細(xì)胞基質(zhì)，其脫細(xì)胞基質(zhì)成分及含量與人體的皮膚組織相似或利于創(chuàng)面再生。所述脫細(xì)胞基質(zhì)的主要成分為膠原、彈性蛋白、非膠原糖蛋白、氨基聚糖和蛋白聚糖，其中脫細(xì)胞基質(zhì)中的膠原、多糖等組分會在物理成膠的過程中通過蛋白折疊自組裝的方式形成互穿的納米纖維多孔結(jié)構(gòu)

可以理解的是，上述互穿的納米纖維多孔結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞遷移、粘附、增殖，能為創(chuàng)面營造一個(gè)可再生微環(huán)境，達(dá)到了雙重仿生誘導(dǎo)目的。其中，所述納米纖維直徑為40～130nm如40nm、60nm、80nm、100nm、1200nm或130nm等。

優(yōu)選地，所述原料以重量份數(shù)計(jì)還包括：交聯(lián)劑0.15～300份。

優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的混合。

本發(fā)明還提供了一種可促真皮再生的凝膠的制備方法，所述可促真皮再生的凝膠為如上述的可促真皮再生的凝膠，所述制備方法包括以下步驟：

(1)將所述脫細(xì)胞基質(zhì)冷凍干燥，打碎成粉末，所述脫細(xì)胞基質(zhì)采用人源或非人源性去細(xì)胞組織器官基質(zhì)經(jīng)脫細(xì)胞處理工藝除去會造成免疫反應(yīng)的殘余細(xì)胞、dna物質(zhì)得到；

(2)用所述消化液室溫下消化脫細(xì)胞基質(zhì)粉末，然后將消化后溶液進(jìn)行離心，離心得到作為脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液的上清液；

(3)用0.1mnaoh溶液調(diào)節(jié)所述脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液中消化液的ph，使ph＞8，再用0.1mhcl溶液調(diào)節(jié)至中性，加入10×pbs，混勻后靜置培養(yǎng)，生成凝膠pdsm-gel；其中，所述10×pbs的用量為所述脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液體積的1/8～1/10如1/8、1/9或1/10等。

需要說明的是，上述pbs一般使用濃度與生理鹽水滲透壓相近，10×一般是指原pbs鹽濃度的十倍，可在4℃下用ph值為7.4的pbs緩沖溶液調(diào)整至溶液所需的體積和濃度。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述脫細(xì)胞處理工藝包括將人源或非人源的器官或組織基質(zhì)經(jīng)除去多余脂肪和肌肉組織后，剪成小塊，然后在4～8℃如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃下加入水溶液經(jīng)振蕩、漂洗、萃取，脫去組織中的細(xì)胞，洗去會造成免疫反應(yīng)的dna物質(zhì)。

優(yōu)選地，步驟(1)中，還包括將所述脫細(xì)胞基質(zhì)粉末過50～80目如50目、60目、70目或80目篩。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述消化時(shí)間為6～48h如6h、10h、15h、20h、24h、28h、30h、35h、40h、45h或48h等；所述離心的速度為20000～40000rpm如20000rpm、25000rpm、30000rpm、35000rpm或40000rpm等，所述離心的時(shí)間為30～60min如30min、40min、50min或60min等，所述離心在溫度為4～8℃如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃下進(jìn)行。

需要說明的是，上述消化時(shí)間與脫細(xì)胞基質(zhì)濃度和脫細(xì)胞基質(zhì)粉末直徑有關(guān)，脫細(xì)胞基質(zhì)濃度越高，脫細(xì)胞基質(zhì)粉末直徑越大消化時(shí)間越長，相反地，脫細(xì)胞基質(zhì)濃度越低，脫細(xì)胞基質(zhì)粉末直徑越小消化時(shí)間越短。

步驟(2)中，所述離心之后還包括將所述上清液在-40～6℃如-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、2℃或6℃下儲存。

優(yōu)選地，步驟(3)中，所述靜置培養(yǎng)過程中的溫度為37℃，所述靜置培養(yǎng)時(shí)間為4～10min如4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等。

優(yōu)選地，在步驟(3)之后還包括將所述凝膠pdsm-gel在25～37℃如25℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃下浸泡于交聯(lián)劑中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固定3～24h如3h、5h、8h、10h、15h、18h、20h、22h或24h等，得到交聯(lián)后的凝膠pdsm-gel。

優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺/n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的混合物。

需要理解的是，采用edc或edc與nhs的混合物作為交聯(lián)劑可以將納米纖維成分再次交聯(lián)固定，以增加凝膠的力學(xué)支撐強(qiáng)度、延長降解時(shí)間，使納米纖維結(jié)構(gòu)得以長時(shí)間維持不受溫度濕度等環(huán)境影響。

需要說明的是，由上述制備方法得到的凝膠不僅具有一定的力學(xué)強(qiáng)度有支撐作用外，宏觀上具有一定的透明度，利于創(chuàng)面修復(fù)中排除顏色干擾觀察創(chuàng)面血管化和肉芽組織再生情況；而且該凝膠可降解且降解時(shí)間可控，降解產(chǎn)物可以為細(xì)胞增殖、分化等提供營養(yǎng)，同時(shí)該凝膠具備納米纖維多孔結(jié)構(gòu)、去細(xì)胞生物活性成分，不僅利于后期組織再生情況觀察，還能營造有利于皮膚再生的微環(huán)境，提供必要的營養(yǎng)成分，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移爬行，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為具有積極效應(yīng)。

需要說明的是，本發(fā)明利用脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠經(jīng)物理自組裝成膠機(jī)理或交聯(lián)劑交聯(lián)機(jī)理，將利于皮膚組織再生的營養(yǎng)因子(如egf、vegf、tgf等)或促進(jìn)修復(fù)的藥物通過物理纏結(jié)包裹或交聯(lián)的作用很好的固定在凝膠內(nèi)部，隨該凝膠的緩慢降解達(dá)到一種持續(xù)緩釋的效果。

為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。申請人聲明，本發(fā)明通過以下實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于這些具體的工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明應(yīng)依賴下述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

一種可促真皮再生的凝膠的制備方法如下：

(1)取新鮮豬小腸粘膜下層，用刀刮去表面的多余脂肪和肌肉組織，剪成小塊，于低溫下4℃加入水溶液經(jīng)振蕩、漂洗、萃取，脫去組織中的細(xì)胞，洗去可能造成免疫反應(yīng)的dna等物質(zhì)，獲得脫細(xì)胞基質(zhì)；

(2)將步驟(1)獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)冷凍干燥，再用粉碎機(jī)把脫細(xì)胞基質(zhì)磨成粉末，并分別用60目、80目的濾篩除去較大、較小顆粒，得到脫細(xì)胞基質(zhì)粉末直徑約為200μm。

(3)把1份上述脫細(xì)胞基質(zhì)粉末加入99份濃度為0.01m的含胃蛋白酶的鹽酸溶液中，在室溫(25℃)下消化12h，以30000rpm離心速度進(jìn)行離心除去未消化大顆粒物或雜質(zhì)，取上清液在4℃下儲存待用，獲得的上清液即為脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液。

(4)首先用0.1mnaoh溶液調(diào)節(jié)上述脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液中消化液的ph大于8讓胃蛋白酶失活，再用0.1mhcl溶液調(diào)節(jié)至中性(ph約為7.4)，低溫下加入大約1/9脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液體積的10×pbs，混勻后于37℃下靜置4分鐘后即可形成凝膠pdsm-gel。

實(shí)施例2

實(shí)施例2在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，將得到的凝膠pdsm-gel在25℃下浸泡于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)溶液中固定24小時(shí)得到凝膠pdsm-gel(edc/nhs)。其中2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)的濃度為0.05m；1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)在mes溶液中濃度為4.82wt％，其含量約為上述脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量10.5倍；n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)在mes溶液中濃度為0.72wt％，其含量約為上述脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量的1.6倍；且edc與nhs的摩爾比為4:1。

實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel在電子掃描顯微鏡下觀察得到的結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示，實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)在電子掃描顯微鏡下觀察得到的結(jié)構(gòu)如圖3和圖4所示。

由圖2和圖4中均可以看出清晰的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)較實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel的結(jié)構(gòu)更為松散。兩種凝膠的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均主要由脫細(xì)胞基質(zhì)中的膠原組分等物理纏結(jié)自組裝形成，由圖1、圖2和圖3、圖4對比可知，化學(xué)交聯(lián)劑edc/nhs的mes溶液的加入未對形成的納米纖維結(jié)構(gòu)造成影響。

分別經(jīng)實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel和實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)用高級旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行力學(xué)性能測試，結(jié)果如圖5所示。經(jīng)測試得出，實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel的儲存模量為237±9pa，實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)的儲存模量為3902±55pa。實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)的力學(xué)強(qiáng)度大于實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel的化學(xué)強(qiáng)度，因此可以得出化學(xué)交聯(lián)劑edc/nhs的mes溶液的加入能進(jìn)一步提高凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。

分別將實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel和實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)進(jìn)行降解測試，14天后，實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel降解45％，實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)降解18％，因此可以得出化學(xué)交聯(lián)劑edc/nhs的mes溶液的加入能延長凝膠的降解時(shí)間。

將實(shí)施例1制備得到的凝膠pdsm-gel與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，圖6和圖7分別為共培養(yǎng)1天后的活細(xì)胞和死細(xì)胞圖示，圖8和圖9分別為共培養(yǎng)5天后的活細(xì)胞和死細(xì)胞圖示，由圖8和圖9可知，共培養(yǎng)5天后的成纖維細(xì)胞形態(tài)成正常梭形，幾乎無死細(xì)胞存在，且細(xì)胞數(shù)量相較于第1天時(shí)明顯增多。實(shí)施例2制備得到的凝膠pdsm-gel(edc/nhs)同上，證明凝膠pdsm-gel與凝膠pdsm-gel(edc/nhs)均具有良好的生物相容性和促細(xì)胞增殖的作用。

實(shí)施例3

一種可促真皮再生的凝膠的制備方法如下：

(1)取新鮮豬小腸粘膜下層，用刀刮去表面的多余脂肪和肌肉組織，剪成小塊，于低溫下7℃加入水溶液經(jīng)振蕩、漂洗、萃取，脫去組織中的細(xì)胞，洗去可能造成免疫反應(yīng)的dna等物質(zhì)，獲得脫細(xì)胞基質(zhì)；

(2)將步驟(1)獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)冷凍干燥，再用粉碎機(jī)把脫細(xì)胞基質(zhì)磨成粉末，并分別用50目的濾篩除去較大顆粒，得到脫細(xì)胞基質(zhì)粉末直徑約為300μm。

(3)把0.1份上述脫細(xì)胞基質(zhì)粉末加入99.9份濃度為0.01m的含胃蛋白酶的鹽酸溶液中，在室溫(25℃)下消化6h，以20000rpm離心速度進(jìn)行離心除去未消化大顆粒物或雜質(zhì)，取上清液在4℃下儲存待用，獲得的上清液即為脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液。

(4)首先用0.1mnaoh溶液調(diào)節(jié)上述脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液中消化液的ph大于8讓胃蛋白酶失活，再用0.1mhcl溶液調(diào)節(jié)至中性(ph約為7.4)，低溫下加入大約1/8脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液體積的10×pbs，混勻后于37℃下靜置7分鐘后即可形成凝膠pdsm-gel。

實(shí)施例4

實(shí)施例4在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，將得到的凝膠pdsm-gel在30℃下浸泡于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)溶液中固定8小時(shí)得到凝膠pdsm-gel(edc/nhs)。其中2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)的濃度為0.05m；1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)在mes溶液中濃度為4.82wt％，其含量約為上述脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量10.5倍；n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)在mes溶液中濃度為0.72wt％，其含量約為上述脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量的1.6倍；且edc與nhs的摩爾比為4:1。

實(shí)施例5

一種可促真皮再生的凝膠的制備方法如下：

(1)取新鮮豬小腸粘膜下層，用刀刮去表面的多余脂肪和肌肉組織，剪成小塊，于低溫下8℃加入水溶液經(jīng)振蕩、漂洗、萃取，脫去組織中的細(xì)胞，洗去可能造成免疫反應(yīng)的dna等物質(zhì)，獲得脫細(xì)胞基質(zhì)；

(2)將步驟(1)獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)冷凍干燥，再用粉碎機(jī)把脫細(xì)胞基質(zhì)磨成粉末，并分別用80目的濾篩除去較大顆粒，得到脫細(xì)胞基質(zhì)粉末直徑約為250μm。

(3)把10份上述脫細(xì)胞基質(zhì)粉末加入90份濃度為0.01m的含胃蛋白酶的鹽酸溶液中，在室溫(25℃)下消化48h，以40000rpm離心速度進(jìn)行離心除去未消化大顆粒物或雜質(zhì)，取上清液在4℃下儲存待用，獲得的上清液即為脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液。

(4)首先用0.1mnaoh溶液調(diào)節(jié)上述脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液中消化液的ph大于8讓胃蛋白酶失活，再用0.1mhcl溶液調(diào)節(jié)至中性(ph約為7.4)，低溫下加入大約1/8脫細(xì)胞基質(zhì)預(yù)凝膠溶液體積的10×pbs，混勻后于37℃下靜置8分鐘后即可形成凝膠pdsm-gel。

實(shí)施例6

實(shí)施例6在實(shí)施例5的基礎(chǔ)上，將得到的凝膠pdsm-gel在37℃下浸泡于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)溶液中固定3小時(shí)得到凝膠pdsm-gel(edc/nhs)。其中2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)的濃度為0.05m；1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)在mes溶液中濃度為4.82wt％，其含量約為上述脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量10.5倍；n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)在mes溶液中濃度為0.72wt％，其含量約為上述脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量的1.6倍；且edc與nhs的摩爾比為4:1。

上述實(shí)施例3和5制備得到的凝膠在電子掃描顯微鏡下觀察得到的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1類似，且隨原料脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的增加納米纖維結(jié)構(gòu)越密集，隨脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的減少納米纖維之間越松散；上述實(shí)施例3和5制備得到的凝膠的力學(xué)強(qiáng)度實(shí)施例1相比隨原料脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的增加而增強(qiáng)，均可降解，且降解時(shí)間隨原料脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的增加而延長，并具有良好的生物相容性。

實(shí)施例4和6制備得到的凝膠在電子掃描顯微鏡下觀察得到的結(jié)構(gòu)與實(shí)施例2類似，且隨原料脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的增加納米纖維結(jié)構(gòu)越密集，隨脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的減少納米纖維之間越松散；上述實(shí)施例4和6制備得到的凝膠的力學(xué)強(qiáng)度與實(shí)施例2相比隨著原料脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的增加而增強(qiáng)，均可降解，且降解時(shí)間隨著原料脫細(xì)胞基質(zhì)的重量份數(shù)的增加而延長，并具有良好的生物相容性。

本發(fā)明的可促真皮再生的凝膠制備技術(shù)，成型條件溫和，保留了脫細(xì)胞基質(zhì)的生物活性成分，根據(jù)創(chuàng)面需求可不同選擇不同的成膠方式，如選擇人體正常生理?xiàng)l件，直接注射體內(nèi)原位成型使用，也可以體外成型制備特定形狀后再植入體內(nèi)使用。由凝膠pdsm-gel與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)1天、5天的活細(xì)胞和死細(xì)胞結(jié)果顯示，該凝膠具有良好的生物相容性；經(jīng)掃描電鏡觀察顯示，凝膠成型后，具有良好的互穿型微觀納米纖維結(jié)構(gòu)，對于后續(xù)的創(chuàng)面修復(fù)具有良好的促進(jìn)作用；經(jīng)高級旋轉(zhuǎn)流變儀測試，該凝膠有一定的力學(xué)支撐作用，且經(jīng)后續(xù)化學(xué)交聯(lián)后，這種力學(xué)支撐作用得以加強(qiáng)。經(jīng)化學(xué)降解實(shí)驗(yàn)測試，該凝膠具有可降解性，且經(jīng)化學(xué)交聯(lián)固定后，其降解時(shí)間得以延長。

上述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明配方及制備工藝可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。