一種細菌纖維素生物補片及其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細菌纖維素生物補片及其制造方法，該生物補片由細菌纖維素膜即BC膜構成，而所述細菌纖維素的聚合度在2000～20000范圍，該纖維素結晶的晶型為I型，結晶指數(shù)為50～95%，晶胞參數(shù)中a=0.815nm，b=1.025nm，c=0.832nm，β=85度。本發(fā)明細菌纖維素生物補片能夠在腹腔環(huán)境中具有良好的力學性能、更好的生物適應性、更好的防粘連性和抗微生物性，且能夠便利地制得合適的面積。
【專利說明】一種細菌纖維素生物補片及其制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細菌纖維素產品，更具體地說，本發(fā)明涉及一種醫(yī)用細菌纖維素及其制造方法。
【背景技術】
[0002]腹內腔某些外科手術需要采用生理和機械特性均衡優(yōu)良的補片來修補筋膜或肌腱，典型而常見的如腹壁疝這種外科疾病，各國人群的發(fā)病率一直較高，約為12%。特別是切口疝，由于會引起局部慢性疼痛、腹脹不適，以及絞窄性腸梗阻、腸穿孔等嚴重的并發(fā)癥，往往會長期影響著患者的生活質量，甚至會威脅到患者的生命，臨床上采用補片來修補疝。我國較大規(guī)模的使用補片也已經有十多年，而且，補片的需求量也在逐漸增加。
[0003]目前，國內上市的補片由包括歐美等12家公司提供，共20余種。這些補片主要是人工合成材料，會不同程度的引起一些并發(fā)癥:
[0004]聚丙烯補片會與腹腔內組織產生嚴重的粘連、消化道梗阻甚至腸瘺。膨化聚四氟乙烯補片修補后的牢固性和抗感染能力較差，一旦發(fā)生感染必須去除修補材料才能控制感染。聚羥基乙酸網、聚乳酸羥基乙酸網等可吸收材料具有較好的抗感染能力，可促進膠原的增殖。聚丙烯與膨化聚四氟乙烯以及與可吸收材料相結合的復合型疝修補材料既能使組織很好的長入，又能防止與內臟的粘連。但是，這些高分子補片置入腹內后僅僅起到阻擋作用，不能機體組織有機結合，同時，作為異物，置入后會引起局部組織炎癥以及感染。
[0005]因此，進一步研發(fā)能夠實現(xiàn)內源性組織再生的生物活性材料，提高國內疝修補的醫(yī)療水平，改善治療效果，降低國內的醫(yī)療費用，乃至發(fā)明一種如同筋膜或肌腱樣的人工材料，完全治愈疝，已經成為疝修補材料領域的一個重要方向。
[0006]作為理想的生物活`性補片，疝修補材料必須滿足的條件:
[0007](I)抗張強度大于人體承受的最大腹內壓16N/cm，相應的彈性變形大于14%。
[0008](2)與腹壁組織和內臟的局部炎癥范圍和持續(xù)性異物反應的程度越小越好；與高分子補片組織修補過程相比，能夠通過內源性組織再生對缺損組織進行修復。這種內源性組織再生過程更接近于生命組織的自然修復過程，修復后的組織沒有過量的瘢痕組織，沒有聚合體異物存留在體內而發(fā)生的長期慢性炎癥過程。
[0009](3)抗微生物性:補片材料性能和結構應更符合生理需求，質量更輕，并發(fā)癥應更少，適用于腹腔內的移植，可優(yōu)化疤痕形成過程，適應被污染或有被污染風險的傷口。
[0010](4)較好的防粘連性。
[0011]( 5)補片的大小要足夠適應缺損區(qū)域面積。

【發(fā)明內容】

[0012]針對傳統(tǒng)技術的上述問題，本發(fā)明提供一種細菌纖維素生物補片及其制造方法，其具有如下優(yōu)點:能夠在腹腔環(huán)境中具有良好的力學性能、更好的生物適應性、更好的防粘連性和抗微生物性，且能夠便利地制得合適的面積。[0013]為此，本發(fā)明的技術解決方案之一是一種細菌纖維素生物補片，該生物補片由細菌纖維素膜即BC膜構成，而所述細菌纖維素的聚合度在2000~20000范圍，該纖維素結晶的晶型為I型，結晶指數(shù)為50~95%,晶胞參數(shù)中a=0.815nm,b=l.025nm, c=0.832nm, β =85度。
[0014]本發(fā)明的細菌纖維素(Bacterial cellulose, BC)由醋酸桿菌屬中的木醋桿菌(Acetobacter xylinum)代謝產物制得,這種菌屬具有最高的纖維素生產能力，因此能夠輕易獲得合適面積的補片制品。
[0015]本發(fā)明細菌纖維素與其它來源纖維素在化學組成上相同，都是有吡喃型葡萄糖單體(β — D 一葡萄糖)通過β — 1,4 一糖苷鍵連接而形成的一種無分支、大分子支鏈聚合物，但是在微觀結構上有著明顯的區(qū)別。由于本發(fā)明細菌纖維素BC特殊的微觀結構獲得如下很多優(yōu)異的性能:
[0016]本發(fā)明細菌纖維素由獨特的絲狀纖維組成，纖維直徑在3~4nm之間，每一絲狀纖維帶寬度可達30~lOOnm，厚度可達3~8nm，結構非常致密；本發(fā)明細菌纖維素非常純凈(達到99%)，不含半纖維素、木質素、果膠和其他細胞壁成份；同時細菌纖維素還具有高結晶度和聚合度。這種特殊的結構使得細菌纖維素具有極其優(yōu)異的機械性能，其彈性模量高達1.5 X IO10Pa,與金屬鋁相當，遠大于目前已知的有機聚合物。并且單根細菌纖維素纖維絲的抗拉強度與鋼以及克維拉纖維(Kevlar，杜邦公司的產品，用于防彈衣的制備)相當。因此它具有極佳的抗撕拉能力和形狀維持能力，便于制成各種形狀，適用于人體不同部位肌腱的修補例如:用于包括各種原發(fā)性及復發(fā)性腹股溝斜疝、直疝及股疝的疝病修補、食道癌切除后修補、胸膜修復、顱骨修復、隆胸手術后以及女性盆腔臟器脫垂的修復，以及用作心臟血管補片、內腦膜補片。
[0017]同時本發(fā)明細菌纖維素的纖維網狀結構使其具有非凡的持水性，能結合比自身干重大60~700倍的水份。而且，同是細胞外基質的細菌纖維素與膠原具有相似的結構，都具有IOOnm的直徑，在很多情況下細菌纖維素可以代替膠原使用在生物組織工程材料中。它的納米纖維結構可以刺激細胞的接觸誘導機制，使得細胞可以沿著材料表面的突起部分或是纖維進行取向和遷移。從遠景來看，本發(fā)明這種由自然生物合成的神奇纖維素將會對生物組織工程材料的發(fā)展做出長遠的貢獻。
[0018]如后面實測數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明細菌纖維素BC，具有如下優(yōu)點:
[0019](I)BC具有利于新生腹壁組織的再生的三維網絡納米纖維結構。
[0020](2) BC的含水率不低于94%。
[0021 ] (3 ) BC材料在拉伸速度為80mm/min時的抗張強度為27.87N/cm,彈性應變?yōu)?4.8%，大于體內環(huán)境需要的臨界值，符合補片所應具有的力學性能和要求。
[0022]BC和傳統(tǒng)PP的防粘連性體外研究表明:本發(fā)明BC補片材料在防止腹膜和腹腔臟器的粘連方面即具有以下優(yōu)點:
[0023](5)具有促進腹膜間皮細胞生長的生物學特性，有利于形成生物屏障；
[0024](6)具有抑制成纖維細胞增殖與分化的作用；
[0025](7)抑制血小板的聚集，防止凝血；
[0026](8)抑制纖維蛋白原的沉積。
[0027]由上可見，本發(fā)明細菌纖維素非常適合代替?zhèn)鹘y(tǒng)補片、用于腹腔內外科手術修補。[0028]為了進一步優(yōu)化微觀結構、提高細菌纖維素力學和生理性能和效果，本發(fā)明纖維素產品還包括如下結構性能改進:
[0029]I晶型中I α型態(tài)的比率為50 - 85%。
[0030]所述細菌纖維素膜干膜密度為1.08 - 2.35g cm_3 ;而其持水水份潤濕后，細菌纖維素的重量比率為0.14-15%，水份比率為85 - 99.86% (wt)。
[0031]水份潤濕后所述纖維素膜的厚度為:0.1~1.0mm，單根纖維素的直徑為5~20nm，纖維素束的直徑在10~80nm范圍。
[0032]水份潤濕后所述細菌纖維素膜的最大應變ε m: 45.7~54.8%,最大斷裂強度σ m:
8.24 ~11.940Mpa，最大抗拉強度 Sm:20.73 ~27.865N/cm。
[0033]水份潤濕后，所述BC膜對白蛋白的吸附量與其對纖維蛋白原的吸附量之比為0.86~1.72 ;所述BC膜吸附白蛋白和纖維蛋白原的吸附平衡時間為1-2小時。
[0034]相應地，本發(fā)明的另一技術解決方案是一種如上所述細菌纖維素生物補片的制造方法，其是選擇變形菌門(Proteobacteria)下屬的α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)下屬的紅螺菌目即Rhodospirillales下屬的醋桿菌科即Acetobacteraceae下屬的醋桿菌屬即Acetobacter下屬的木醋桿菌Acetobacter xylinum作為菌株,所述制造方法包括如下步驟:
[0035]A)振蕩培養(yǎng):將正?；罨杲尤霚缇鋮s后的培養(yǎng)基中，在30°C ±2°C下振蕩培養(yǎng)24 - 36小時；
[0036]B)分散菌株:振蕩培養(yǎng)之后，培養(yǎng)基置于搖床以轉速為150~200rpm，，充分分散菌株；
[0037]C)靜置培養(yǎng):分散操作之后，培養(yǎng)基在30°C ±2°C下恒溫靜置培養(yǎng)3~4周；
[0038]D)過濾取膜:靜置培養(yǎng)后，再從培養(yǎng)基中取出BC生成膜，通過不銹鋼絲網膜過濾得BC濾后膜；
[0039]E)清洗制膜:BC濾后膜浸泡在1- 4% (wt)NaOH溶液中，在90 - 100°C沸水中加熱1- 3小時，去除菌體蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基，用稀鹽酸中和，繼而用去離子水反復沖洗至中性，制得所述BC膜成品。
[0040]本發(fā)明細菌纖維素的制造方法優(yōu)選具有很高的纖維素生產能力、在纖維素合成、結晶過程和結構性質方面優(yōu)異的菌株，采用針對誘導性的培養(yǎng)方法步驟，促使菌株代謝生產出力學和生物性能均衡優(yōu)良的纖維素。
[0041]為了更充分發(fā)揮和優(yōu)化本發(fā)明方法在纖維素微觀結構上的生產優(yōu)點，進一步提高本發(fā)明方法的適應性和效益，本發(fā)明制造方法還包括如下改進:
[0042]所述步驟A之前還包括如下步驟AO)菌株活化:將冷凍保藏菌株，在盛有活化營養(yǎng)液培養(yǎng)基中進行活化，然后進行后續(xù)培養(yǎng)；所述步驟E中清洗操作后，還包括干燥操作。
[0043]所述步驟A的培養(yǎng)基營養(yǎng)液包括如下組份:(NH2) 2S04:2~4g/L，MgSO4:0.1~0.6g/L, KH2PO4:1 ~3g/L, NaAc:1 ~2g/L,鹿糖:10 ~40g/L,椰子水:400 ~600g/L ;上述培養(yǎng)基營養(yǎng)液控制pH=4.2、100°C下滅菌15min。
[0044]所述步驟AO的活化營養(yǎng)液包括如下組份:蔗糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鈉0.27%，檸檬酸0.115% ;上述活化營養(yǎng)液控制pH = 6.0、115°C下滅菌15min。
[0045]以下結合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步說明?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0046]圖1為本發(fā)明BC實施例的透射電鏡照片示意圖。
[0047]圖2為傳統(tǒng)PP的透射電鏡照片示意圖。
[0048]圖3為本發(fā)明BC實施例的力學測試性能曲線示意圖。
[0049]圖4為傳統(tǒng)PP的力學測試性能曲線示意圖。
[0050]圖5為本發(fā)明BC實施例與傳統(tǒng)PP上間皮細胞相對增殖率RGR值對比圖。
[0051]圖6為本發(fā)明BC實施例與傳統(tǒng)PP上L929細胞相對增殖率RGR值對比圖。
[0052]圖7為本發(fā)明BC實施例與傳統(tǒng)PP上白蛋白/纖維蛋白吸附量比值對比圖。
[0053]圖8為本發(fā)明BC實施例與傳統(tǒng)PP體外動態(tài)凝血時間對比圖。
[0054]圖9為本發(fā)明BC實施例修補手術8周粘連狀況照相圖。
[0055]圖10為傳統(tǒng)PP修補手術8周粘連狀況照相圖。
[0056]圖11為本發(fā)明BC實施例修補手術8周組織病理學顯微照相圖。
[0057]圖12為傳統(tǒng)PP修補手術8周組織病理學顯微照相圖。
[0058]圖13為本發(fā)明BC實施例修補手術8周間皮細胞顯微照相圖。
[0059]圖14為傳統(tǒng)PP修補`手術8周間皮細胞顯微照相圖。
[0060]圖15為本發(fā)明BC實施例修補手術8周細胞內部顯微照相圖。
[0061]圖16為傳統(tǒng)PP修補手術8周細胞內部顯微照相圖。
【具體實施方式】
[0062]選擇變形菌門(Proteobacteria)下屬的ct-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的紅螺菌目Rhodospirillales下屬的醋桿菌科Acetobacteraceae下屬的醋桿菌屬Acetobacter下屬的木醋桿菌Acetobacter xylinum作為菌株,所述制造方法包括如下步驟:
[0063]AO)菌株活化:將冷凍保藏菌株，在盛有活化營養(yǎng)液培養(yǎng)基中進行活化，活化營養(yǎng)液包括如下組份:蔗糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鈉0.27%，檸檬酸0.115% ;上述活化營養(yǎng)液控制pH = 6.0、115°C下滅菌15min。然后進行后續(xù)培養(yǎng)；
[0064]A)振蕩培養(yǎng):將正?；罨杲尤霚缇鋮s后的培養(yǎng)基中，在30°C ±2°C下振蕩培養(yǎng)24 - 36小時；培養(yǎng)基營養(yǎng)液包括如下組份:(NH2)2SO4:2~4g/L, MgSO4:0.1~0.6g/L, KH2PO4:1 ~3g/L, NaAc:1 ~2g/L,蔗糖:10 ~40g/L,椰子水:400 ~600g/L ;上述培養(yǎng)基營養(yǎng)液控制PH=4.2、100°C下滅菌15min。
[0065]B)分散菌株:振蕩培養(yǎng)之后，培養(yǎng)基置于搖床以轉速為150~200rpm，，充分分散菌株；
[0066]C)靜置培養(yǎng):分散操作之后，培養(yǎng)基在30°C ±2°C下恒溫靜置培養(yǎng)3~4
[0067]D)過濾取膜:靜置培養(yǎng)后，再從培養(yǎng)基中取出BC生成膜，通過不銹鋼絲網膜過濾得BC濾后膜；
[0068]E)清洗制膜:BC濾后膜浸泡在1- 4% (wt)NaOH溶液中，在90 - 100°C沸水中加熱1- 3小時，去除菌體蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基，用稀鹽酸中和，繼而用去離子水反復沖洗至中性，再進行干燥操作，制得所述BC膜成品。[0069]經過上述操作步驟制得的細菌纖維素即BC膜構成的生物補片，經過理化測試測得:所述細菌纖維素的聚合度在2000~20000范圍，結晶指數(shù)為50~95% (XRD分析)，纖維素結晶的晶型為I型，晶胞參數(shù)中a=0.815nm, b=l.025nm, c=0.832nm, β =85度。I晶型中I α型態(tài)的比率為50 - 85% (NMR分析)。
[0070]所述細菌纖維素膜干膜密度為1.08 - 2.35g cm_3 ;而其持水潤濕后，細菌纖維素的重量比率為0.14-15%，水份比率為85 - 99.86% (wt)。
[0071]水份潤濕后所述纖維素膜的厚度為:0.1~1.0mm，單根纖維素的直徑為5~20nm,纖維素束的直徑在10~80nm范圍(電鏡測試)。
[0072]水份潤濕后所述細菌纖維素膜的最大應變ε m: 45.7~54.8%,最大斷裂強度σ m:
8.24~11.940Mpa，最大抗拉強度Sm:20.73~27.865N/cm (力學測試)。
[0073]水份潤濕后，所述BC膜對白蛋白的吸附量與其對纖維蛋白原的吸附量之比為
0.86~1.72 ;所述BC膜吸附白蛋白和纖維蛋白原的吸附平衡時間為1-2小時(體外培養(yǎng)測試)。
[0074]為了比較本發(fā)明BC作為生物補片的效果，我們采用PP (聚丙烯)材料的補片來作為比較。以下是本發(fā)明實施例BC補片與傳統(tǒng)聚丙烯PP補片的系列對比測試:
[0075]如圖1、2，所示分別為本發(fā)明BC實施例與傳統(tǒng)PP的透射電鏡照片示意圖。傳統(tǒng)PP聚丙烯補片由聚丙烯單絲纖維編織而成，有很好的強度和剛性。其空隙率達85%，密度為18.9g/m2。
[0076](一)吸水量實驗:`
[0077]因為PP的濕性小，是基本不吸水的材料，因此未對它的含水率進行測定。本實驗只對BC做了吸水實驗:
[0078]在預先恒重的表面皿中稱取細菌纖維素，在100°C烘箱中烘至恒重；
[0079]含水率(%) =(烘干前樣品質量(g)_烘干后樣品質量(g) X 100%/烘干前樣品質量(g)
[0080]表1
[0081]
【權利要求】
1.一種細菌纖維素生物補片，該生物補片由細菌纖維素膜即BC膜構成，其特征在于:所述細菌纖維素的聚合度在2000~20000范圍，該纖維素結晶的晶型為I型，結晶指數(shù)為50 ~95%,晶胞參數(shù)中 a=0.815nm, b=l.025nm, c=0.832nm, β =85 度。
2.如權利要求1所述細菌纖維素生物補片，其特征在于:I晶型中Ia型態(tài)的比率為50 - 85%。
3.如權利要求1或2所述細菌纖維素生物補片，其特征在于:所述細菌纖維素膜干膜密度為1.08 - 2.35g cm_3 ;而其持水潤濕后，細菌纖維素的重量比率為0.14_15%，水份比率為 85 - 99.86% (Wt).
4.如權利要求1或2所述細菌纖維素生物補片，其特征在于:水份潤濕后所述纖維素膜的厚度為:0. 1~1.0mm,單根纖維素的直徑為5~20nm,纖維素束的直徑在10~80nm范圍。
5.如權利要求1或2所述細菌纖維素生物補片，其特征在于:水份潤濕后所述細菌纖維素膜的最大應變ε m:45.7~54.8%,最大斷裂強度σ m:8.24~11.940Mpa,最大抗拉強度 Sm:20.73 ~27.865N/cm。
6.如權利要求1或2所述細菌纖維素生物補片，其特征在于:水份潤濕后，所述BC膜對白蛋白的吸附量與其對纖維蛋白原的吸附量之比為0.86~1.72 ;所述BC膜吸附白蛋白和纖維蛋白原的吸附平衡時間為1-2小時。
7.—種如權利要求1-6之一所述細菌纖維素生物補片的制造方法，是選擇紅螺菌目即Rhodospirillales下屬的醋桿菌科即Acetobacteraceae下屬的醋桿菌屬即Acetobacter下屬的木醋桿菌Acetobacter` xylinum作為菌株,所述制造方法包括如下步驟: A)振蕩培養(yǎng):將正常活化菌株接入滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中，在30°C±2°C下振蕩培養(yǎng)24 - 36小時； B)分散菌株:振蕩培養(yǎng)之后，培養(yǎng)基置于搖床以轉速為150~200rpm，，充分分散菌株; C)靜置培養(yǎng):分散操作之后，培養(yǎng)基在30°C±2°C下恒溫靜置培養(yǎng)3~4周； D)過濾取膜:靜置培養(yǎng)后，再從培養(yǎng)基中取出BC生成膜，通過不銹鋼絲網膜過濾得BC濾后月吳; E)清洗制膜:BC濾后膜浸泡在1- 4% (Wt)NaOH溶液中，在90 - 100°C沸水中加熱1- 3小時，去除菌體蛋白和粘附在纖維素膜上的殘余培養(yǎng)基，用稀鹽酸中和，繼而用去離子水反復沖洗至中性，制得所述BC膜成品。
8.如權利要求7所述細菌纖維素生物補片的制造方法，其特征在于:所述步驟A之前還包括如下步驟AO)菌株活化:將冷凍保藏菌株，在盛有活化營養(yǎng)液培養(yǎng)基中進行活化，然后進行后續(xù)培養(yǎng)；所述步驟E中清洗操作后，還包括干燥操作。
9.如權利要求7所述細菌纖維素生物補片的制造方法，其特征在于:所述步驟A的培養(yǎng)基營養(yǎng)液包括如下組份=(NH2)2SO4:2~4g/L, MgSO4:0.I~0.6g/L, KH2PO4:1~3g/L, NaAc:1~2g/L,蔗糖:10~40g/L,椰子水:400~600g/L ;上述培養(yǎng)基營養(yǎng)液控制pH=4.2、100°C下滅菌 15min。
10.如權利要求8所述細菌纖維素生物補片的制造方法，其特征在于:所述步驟AO的活化營養(yǎng)液包括如下組份:蔗糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鈉0.27%，檸檬酸.0.115% ;上述活化`營養(yǎng)液控制pH = 6.0、115°C下滅菌15min。
【文檔編號】C12R1/02GK103861146SQ201410089918
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權日:2014年3月13日
【發(fā)明者】奚廷斐, 賴琛, 張志雄, 盛立遠, 鐘春燕 申請人:海南光宇生物科技有限公司