本發(fā)明屬于光熱治療的應用領域，特別涉及一種皺褶石墨烯微球在光熱治療中的應用。

背景技術：

長期食用有毒物質(zhì)易導致癌癥發(fā)病率提高。目前治療手段主要有化學治療、手術治療和放射治療?；熓抢没瘜W藥物阻止癌細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移，直至最終殺滅癌細胞的一種治療方式，但其選擇性不強，在殺滅癌細胞的同時也會不可避免地損傷人體正常細胞，使患者出現(xiàn)不良反應；手術治療只能針對早期癌細胞尚未擴散的患者，對于腫瘤細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)移的病人手術治療通常無法根治，且對病人造成二次傷害；放射治療利用x射線、電子線等對發(fā)病部位照射，但對于已經(jīng)轉(zhuǎn)移的癌細胞作用有限。光熱治療(ptt)作為較安全的新型腫瘤治療方法受到了廣泛關注。其中，納米材料的性能決定了光熱治療的效果。

石墨烯（graphene，rgo），是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成的六角型呈蜂巢晶格的新型二維平面材料，特殊的單原子層結(jié)構(gòu)決定了其豐富和新奇的物理性質(zhì)。導熱系數(shù)高達5300w/m?k，常溫下其電子遷移率超過15000cm2/v?s，零載流子濃度極限下具有最小量子電導率，具有分數(shù)量子霍爾效應和鐵磁性，石墨烯還是目前世界上已知材料中最薄的，厚度只有0.335nm。石墨烯與金納米粒子和碳納米管等碳材料相比，具有體積小、光熱效率良好和成本低的優(yōu)勢。但是常規(guī)的片層石墨烯易團聚、使其不易進入細胞內(nèi)部，并且氧化石墨烯是片層結(jié)構(gòu)，其鋒利的邊緣部位可以刺破細胞，對正常細胞具有一定的副作用。另外，其光熱轉(zhuǎn)換效率也非常有限。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種皺褶石墨烯微球在光熱治療中的應用，本發(fā)明中載體材料具有很好的生物相容性和良好的光熱轉(zhuǎn)換能力，可以很好的結(jié)合光熱治療和化療，在增大對腫瘤細胞殺傷力的同時，也可以較好的減少對正常細胞的毒副作用。

本發(fā)明的一種皺褶石墨烯微球在光熱治療中的應用，包括：

（1）不同濃度的材料光熱轉(zhuǎn)換能力：配制不同濃度的皺褶石墨烯微球的水溶液，用近紅外激光照射一定時間，溶液的溫度變化利用紅外熱成像儀進行溫度記錄，得到溶液在不同時間激光照射下的升溫曲線；

（2）不同光照強度的材料光熱轉(zhuǎn)化能力：使用不同強度的激光進行照射一定濃度的皺褶石墨烯微球水溶液，得到溶液在不同時間激光照射下的升溫曲線；

（3）材料的光熱穩(wěn)定性：測試一定濃度的皺褶石墨烯微球的水溶液在一定激光強度的照射下，照射一定時間，連續(xù)多次開關照射條件下的升溫降溫循環(huán)曲線；

（4）材料的生物毒性：通過mtt實驗來檢測培養(yǎng)不同濃度的皺褶石墨烯微球的細胞毒性；

（5）材料對腫瘤細胞的光熱治療效果：通過檢測空白對照磷酸緩沖液、抗癌藥物阿霉素、皺褶石墨烯球微球、激光照射的皺褶石墨烯微球?qū)θ藢m頸癌細胞的存活率來評價材料的抗腫瘤治療的光熱效果。

所述步驟（1）中，配置的系列濃度為0~250μg/ml，激光近紅外波長在800~900nm，激光強度為0~3瓦/平方厘米，照射時間0~8分鐘。

所述步驟（2）中，材料的濃度為100~250μg/ml，激光近紅外波長在800~900nm，激光強度為0~3瓦/平方厘米，照射時間0~8分鐘。

所述步驟（3）中，材料的濃度為100~250μg/ml，激光近紅外波長在800~900nm，激光強度為0~3瓦/平方厘米，照射時間0~8分鐘。

所述步驟（3）中，連續(xù)開關次數(shù)為3-10次。

所述步驟（4）中，測試不同濃度的3-8個樣品的生物毒性，濃度范圍為0~40μg/ml。

所述步驟（5）中，磷酸緩沖溶液的ph酯為7.4，抗癌藥物阿霉素的濃度為0~5um，皺褶石墨烯球的濃度為0~5um。

所述步驟（5）中，激光照射的激光近紅外波長在800~900nm，激光強度為0~3瓦/平方厘米，照射時間0~8分鐘。

有益效果

（1）本發(fā)明提供了皺褶石墨烯球的一種新用途，可應用于光熱治療制劑，克服了片層石墨烯的缺點，分散性好；

（2）本發(fā)明的皺褶石墨烯微球應用光熱治療，具有較低的生物毒性、光熱穩(wěn)定性和高的光熱轉(zhuǎn)換效率。

附圖說明

圖1為不同濃度的皺褶石墨烯微球的光熱曲線；

圖2為不同光照強度的皺褶石墨烯微球的光熱曲線；

圖3為皺褶石墨烯球材料的光熱穩(wěn)定性分析；

圖4為皺褶石墨烯球材料的細胞毒性測試；

圖5為皺褶石墨烯球材料對腫瘤細胞的光熱治療效果測試。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1

皺褶石墨烯微球的制備，包括如下步驟：

首先配制質(zhì)量濃度為6wt%的氧化石墨烯（go）溶液，在室溫下攪拌10h，轉(zhuǎn)速為1100r/min，使固態(tài)go充分分散；將所得溶液放入超聲清洗機中，超聲波振蕩8小時后，得到棕色透明的go分散液。將上述溶液置于連接有石英管的超聲霧化器內(nèi)，所述石英管的一端連接超聲霧化器，另一端連接真空抽濾裝置的過濾器，所述的真空抽濾裝置包括過濾器，過濾器中設有ptfe濾膜，過濾器連接抽濾真空泵。在超聲波頻率為2.0mhz的條件下使其超聲霧化成氣溶膠液滴，在霧化器氣流和抽濾真空泵驅(qū)動下通過加熱到400℃的石英管后，用孔徑為0.22μmptfe濾膜收集，室溫下干燥3h，然后放入真空干燥器中60℃干燥24h后，即得皺褶石墨烯微球，制備的微球粒徑在750±20nm。

實施例2

不同濃度的材料的光熱轉(zhuǎn)換性能測試，包括如下步驟：

配制不同濃度的皺褶石墨烯球（crumpled-rgo）水溶液3ml，溶液的濃度分別為：200、100、50、25μg/ml，并以200μg/ml氧化石墨烯水溶液（go）和超純水作為對照。將不同濃度的材料水溶液裝入1.5ml離心管中，用功率密度為1瓦/平方厘米、波長為808nm的激光照射5min，溶液的溫度變化利用紅外熱成像儀進行溫度記錄，最終可以得到溶液在激光照射下的升溫曲線，見圖1。從圖1可以看出：溶液的升溫程度與溶液濃度成正比，濃度越高，溫度升的越高，濃度為200μg/ml的crumpled-rgo溶液溫度達到了65℃以上；同樣的照射條件下，25μg/ml的crumpled-rgo溶液溫度高于對比溶液：200μg/ml的go溶液，主要原因是高溫還原使得石墨烯結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其在近紅外區(qū)的吸光能力有所增強；同時，我們還發(fā)現(xiàn)超純水在激光照射下溫度變化不明顯，主要原因是水中缺少光熱試劑，水很難將激光能量轉(zhuǎn)化成熱能。以上數(shù)據(jù)顯示了crumpled-rgo可以用作為一個新型的光熱轉(zhuǎn)換效率極高的光熱材料。

實施例3

不同光照強度對材料的光熱轉(zhuǎn)換性能測試，包括如下步驟：

配制了200μg/ml濃度的皺褶石墨烯球（crumpled-rgo）水溶液10ml，使用不同強度的激光進行照射，激光強度分別為：0.5、1、1.5、2瓦/平方厘米。利用波長為808nm的激光照射5min，溶液的溫度變化利用紅外熱成像儀進行溫度記錄，最終可以得到溶液在激光照射下的升溫曲線，見圖2。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)升溫程度與激光強度成正比，所照射的激光強度越高，溫度升的越高；對于200μg/ml的crumpled-rgo溶液，當光照強度為0.5瓦/平方厘米時，溫度只達到40℃左右，當光照強度為2.0瓦/平方厘米時，溫度立馬升到80℃以上，暗示了該材料具有優(yōu)越的光熱效能。

實施例4

材料的光熱穩(wěn)定性測試，包括如下步驟：

配制濃度為200μg/ml的材料水溶液10ml，利用波長為808nm的激光照射5min，激光強度為1瓦/平方厘米，測得連續(xù)5次開關照射條件下的升溫降溫循環(huán)曲線，材料的光熱穩(wěn)定性曲線見圖3。從圖3可以看出，每次升溫降溫程度都基本相同，暗示了材料具有良好的光熱穩(wěn)定性。

實施例5

材料的生物毒性測試，包括如下步驟：

小心地從液氮罐中取出凍存的l929細胞，迅速放入37℃水浴鍋快速溶解后移入離心管，加入1ml新鮮dmem（含1%雙抗和10%胎牛血清）培養(yǎng)基，吹打均勻，1000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min。每個培養(yǎng)瓶添加1ml細胞液，并添加4ml新鮮培養(yǎng)液，酒精擦拭后放入培養(yǎng)箱（含5%二氧化碳，溫度在37℃）培養(yǎng)。當在顯微鏡下觀察到貼壁細胞長滿培養(yǎng)瓶底部面積90%左右就應該對細胞進行分瓶，用移液管小心吸去上部發(fā)黃的培養(yǎng)液，注意不要碰到底部，用2-3mlpbs輕輕沖洗細胞瓶2次并倒掉，去掉殘余血清和死細胞，吸取1.0ml胰酶加入培養(yǎng)瓶，對細胞靜置消化1min，快速吸取2ml新鮮培養(yǎng)液加入細胞培養(yǎng)瓶終止消化，使用移液槍進行吹打，是貼附在瓶壁上的細胞全部脫離。在每個新的培養(yǎng)瓶添加1ml細胞液，并添加4ml新鮮培養(yǎng)液，新培養(yǎng)瓶做好標記，酒精擦拭后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到細胞量夠下步實驗所用。

為了檢測皺褶石墨烯球（crumpled-rgo）材料本身的細胞毒性，進行mtt實驗。當細胞生長到對數(shù)期時，利用血球計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，將細胞添加到96孔細胞培養(yǎng)板，使每孔體積200μl，細胞個數(shù)為10000個，于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。當細胞貼壁完全后吸除培養(yǎng)液，加入含有不同濃度的crumpled-rgo的20μl的無菌pbs溶液（分別為5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml），對照組添加20μlpbs溶液作對照，并補足180μl新鮮培養(yǎng)基，使每孔培養(yǎng)液的總體積仍為200μl，放入培養(yǎng)箱中孵育。分別在培養(yǎng)24h、48h和72h時，移去孔板中的培養(yǎng)液，每孔添加20μlw=0.5%的mtt溶液，在培養(yǎng)箱中避光中培養(yǎng)4h后吸去溶液，每孔添加200μldmso溶液，在轉(zhuǎn)速90rpm搖床上避光振蕩30min，使結(jié)晶物充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm處測定各孔溶液的紫外吸收值。對照試驗用同體積培養(yǎng)基作為參比。細胞毒性實驗結(jié)果見圖4。

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)細胞24h培養(yǎng)液時，添加材料的細胞相對數(shù)略高于以pbs緩沖液對照處理的細胞數(shù)，主要原因是材料基質(zhì)為碳，補充了細胞生長所需要的碳元素，有利于細胞生長。隨著培養(yǎng)時間的延長和材料濃度的增加，細胞數(shù)量逐漸減少，但與對照組的細胞數(shù)目基本相同，沒有顯示出對細胞的殺傷作用，細胞數(shù)目的減少可能與培養(yǎng)液中營養(yǎng)的消耗有關。以上實驗結(jié)果表明，制備的crumpled-rgo對細胞無明顯毒性。

實施例6

材料對腫瘤細胞的光熱治療效果，包括如下步驟：

為了檢測crumpled-rgo材料的光熱效能，使用生長到對數(shù)期的人宮頸癌細胞（hela）細胞，利用血球計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，將細胞添加到96孔細胞培養(yǎng)板，使每孔體積200μl，細胞個數(shù)為10000個，于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。當細胞貼壁完全后吸除培養(yǎng)液，每孔分別加入200μl含不同濃度的dox（分別為0.5μm，1μm，2μm，4μm）和crumpled-rgo（0.5μm，1μm，2μm，4μm）的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)24h后，每孔用功率密度為1w/cm2、波長為808nm的激光照射5min，并設置添加crumpled-rgo而不經(jīng)光照的對照組。照射完畢后移去孔板中的培養(yǎng)液，每孔添加20μlw=0.5%的mtt溶液，在培養(yǎng)箱中避光中培養(yǎng)4h后吸去溶液，每孔添加200μldmso溶液，在轉(zhuǎn)速90rpm搖床上避光振蕩30min，使結(jié)晶物充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm處測定各孔溶液的紫外吸收值。實驗均以pbs處理的細胞作對照組，每組設置3個平行樣。通過檢測hela細胞的存活率，來進行判斷crumpled-rgo材料光熱治療效果，結(jié)果見圖5。

從圖5可以發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，crumpled-rgo材料對細胞有一定的殺傷作用，并且隨著crumpled-rgo濃度的增大而增大。在未進行近紅外光nir照射時，crumpled-rgo材料幾乎對癌細胞增殖沒有任何影響。當進行光照近紅外光(nir)照5分鐘后，含crumpled-rgo材料的細胞數(shù)目迅速減少，并且隨著材料濃度的增大而增大，當材料添加量為4μm時，細胞的存活率只有60%，與純的抗癌藥物阿霉素(dox)幾乎具有相同的治療效果，以上實驗結(jié)果表明，皺褶石墨烯球?qū)δ[瘤細胞具有良好的殺傷作用，是一種良好的光熱治療試劑。