本發(fā)明涉及動物基因技術領域，具體是一種clfa-a靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法。

背景技術：

奶牛乳房炎(bovinemastitis)是奶牛的常見疾病，是奶牛乳腺組織的炎癥，主要為乳腺組織感染病原微生物所致，是奶牛的常見病、多發(fā)病。幾十年來，國內(nèi)外針對奶牛乳房炎的防治作了很多努力，但該病一直是困擾我國奶牛業(yè)養(yǎng)殖發(fā)展最為嚴重的疾病之一。它使奶牛泌乳和生殖機能受到損傷，不僅降低奶牛的產(chǎn)奶量，使奶牛淘汰，影響乳的品質(zhì)造成嚴重的經(jīng)濟損失，嚴重時甚至影響到人類健康。

s.aμreus感染的第一步就是在宿主體內(nèi)定植，而實現(xiàn)定植的前提是細菌在宿主的組織和細胞表面的黏附，細菌有可以黏附到組織表面的組分成為黏附素，s.aureus黏附素有纖維蛋白原凝集素a、b(fibronectin-bindingproteinsclumpingfactoraandb，clfa，clfb)，纖維蛋白a、b(fibronectin-bindingproteinaandb，fnbpa，fnbpb)，膠原結合蛋白(collagen-bindingproteincan)和a蛋白(proteina)，clfa是金黃色葡萄球菌主要的黏附素之一，能夠介導金黃色葡萄球菌結合于細胞表面的纖維素連接蛋白原，使細菌黏附于宿主細胞表面，促進細胞對寄主組織的入侵。clfa是將細菌黏附到纖維蛋白和可溶及不溶性纖維蛋白原上的決定性因子。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種clfa-a靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種clfa-a靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，由以下步驟組成：

1)重組質(zhì)粒pet-clfa-a的構建

提取金黃色葡萄球菌dna，根據(jù)genbank上已提交的clfa基因序列，分別設計上游引 物與下游引物，且向上游引物與下游引物中分別引入bamhi和hindiii酶切位點，制得重組質(zhì)粒pet-clfa-a；

上游引物p1序列如seqidno：1所示，

下游引物p2序列如seqidno：2所示，

然后對重組質(zhì)粒pet-clfa-a進行pcr擴增，pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測；經(jīng)藍白斑篩選及雙酶切鑒定得到的陽性克隆進行序列測定分析；

2)誘導的表達產(chǎn)物

將上述重組質(zhì)粒pet-clfa-a轉入感受態(tài)細胞bl21(de3)中，用終濃度為0.8-1.2mm的iptg(異丙基硫代半乳糖苷)進行誘導，取不同時間段的表達產(chǎn)物進行sds-page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測；

3)目的蛋白的大量表達及純化

根據(jù)sds-page檢測確定的最佳誘導時間和iptg的濃度，對目的蛋白進行大量表達和純化；

4)免疫動物的篩選

選取體重2～2.5kg家兔，免疫后采血獲取血清，進行檢測；

5)免疫程序：

首次免疫：目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，每只家兔注射650-750μg上述目的蛋白，背部皮下多點注射；

首次免疫后每隔15d加強免疫一次，以弗氏不完全佐劑為佐劑，每只家兔250-350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血獲取血清，測定抗體效價后，制得金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

作為本發(fā)明進一步的方案：pcr擴增條件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min30s，35個循環(huán)；72℃10min。

作為本發(fā)明進一步的方案：步驟2)中iptg的終濃度為1.0mm。

作為本發(fā)明進一步的方案：首次免疫：目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，每 只家兔注射700μg目的蛋白。

作為本發(fā)明進一步的方案：首次免疫后每隔15d加強免疫一次，以弗氏不完全佐劑為佐劑，每只家兔300μg目的蛋白。

根據(jù)上述方法制得金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明建立的有效的金黃色葡萄球菌凝集因子蛋白(clfa-a)的制備，為以clfa-a為靶位的疫苗研究，對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供試驗依據(jù)。

附圖說明

圖1是clfa-a區(qū)基因的擴增圖，m：dna分子質(zhì)量標準，1：pcr產(chǎn)物；

圖2是目的蛋白的sds-page分析圖，m：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準，1：iptg誘導下pet-32a-clfa-a在bl21中的表達，2：無iptg誘導時pet-32a-clfa-a在bl21中的表達，3：iptg誘導下的空載體。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

本發(fā)明實施例中，一種clfa-a靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，具體操作步驟：

1、重組質(zhì)粒pet-clfa-a的構建

根據(jù)參考文獻提取金黃色葡萄球菌dna，genbank登錄的clfa基因序列(z18852)，用primer5.0設計上下游引物，

上游引物p1序列：5’-cgcggatccgtagctgcagatgcacc-3’；

下游引物p2序列：5’-cccaagcttctcatcaggttgttcagg-3’。

為了方便其定向克隆，于上下游分別引入bamhi和hindiii酶切位點(下劃線部分)，pcr擴增條件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min30s，35個循環(huán)；72℃10min，pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)藍白斑篩選及雙酶切鑒定得到的陽性克隆進行序列測定分析。

經(jīng)測序正確后進行表達。(見圖1)

2、誘導的表達產(chǎn)物

將上述構建的重組質(zhì)粒轉入感受態(tài)細胞bl21(de3)中，用終濃度為1.0mm的iptg進行誘導，取不同時間段的表達產(chǎn)物進行sds-page檢測。

3、蛋白的大量表達及純化

經(jīng)鑒定，目的蛋白以可溶性形式存在，擴大培養(yǎng)后，根據(jù)預實驗確定的最佳誘導時間和iptg的濃度，進行大量表達和純化。(見圖2)

4、免疫動物的篩選

選取體重2～2.5kg家兔，免疫后采血獲取血清，進行檢測。

5、免疫程序：

首次免疫：目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，每只700μg上述重組蛋白，背部皮下多點注射。

首次免疫后每隔15d加強免疫一次，以弗氏不完全佐劑為佐劑，每只家兔300μg蛋白，第3次免疫后第10d采血獲取血清，測定抗體效價，

6、表達產(chǎn)物elisa檢測

100μl牛纖維蛋白原(4μg/ml)包被96孔酶標板，4℃過夜；200μl明膠(1g/l)封閉，37℃孵育2h；加入100μl的目的蛋白(5μg/ml)，以不加目的蛋白的孔為對照，37℃孵育2h；加入自制的一抗(1∶4000稀釋的家兔血清)100μl，37℃孵育2h；加入羊抗兔的酶標二抗(1∶1000稀釋)100μl，37℃孵育2h；加入顯色液100μl，37℃孵育10～30min；加入終止液100μl；測定490nm處od值。

7、抗體抗粘附能力檢測

4μg/ml牛纖維蛋白原100μl包被96孔酶標板，4℃過夜，tbst緩沖液洗滌2次后，輕柔拍干；加入100μl明膠(1g/l)封閉，37℃孵育2h；對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌，加入等體積的自制一抗，37℃孵育30min；包被好的酶標孔選孔數(shù)的1/2加入經(jīng)自制血清孵育的金黃色葡萄球菌100μl，剩下的1/2加入不經(jīng)血清孵育的對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌，37℃孵育2h；tbst緩沖液洗滌3次后，輕柔拍干；加入250ml/l甲醛，室溫放置10～30min；tbst緩沖液洗滌3次后，輕柔拍干；加入結晶紫染色30min，tbst緩沖液洗滌3次后，輕柔拍干；加入乙醇脫色20min，盡量使結晶紫全部脫出；測定583nm處od值。

8、結果

抗體黏附能力的檢測表明，加入未經(jīng)血清孵育的金黃色葡萄球菌的酶標孔的od583(1.031±0.23，n＝13)明顯高于加入經(jīng)血清孵育的金黃色葡萄球菌的酶標孔的od583(0.693±0.23，n＝13)，即未經(jīng)血清孵育的金黃色葡萄球菌黏附至牛纖維蛋白原上的能力較強，經(jīng)血清孵育后的金黃色葡萄球菌黏附至牛纖維蛋白原的能力明顯下降。

因此，通過上述方法，可以制備clfa-a靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗，為今后奶牛乳房炎的防治提供了基礎。

對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。