本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，涉及疫苗佐劑，具體涉及乙型肝炎dna疫苗的免疫佐劑。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一種影響傳染病。接種乙肝疫苗是目前控制乙型肝炎感染的最有效的措施，但是傳統(tǒng)的乙型肝炎亞單位疫苗是由乙型肝炎病毒的表面抗原和鋁佐劑組成，鋁佐劑疫苗僅能引起很好的體液免疫反應(yīng)而不能引起有效的細胞免疫反應(yīng)。dna疫苗又稱為基因疫苗或核酸疫苗，其原理是編碼基因插入到帶有啟動子的質(zhì)粒載體，后用物理的方法將其導(dǎo)入到體內(nèi)細胞，也即將裸露的dna注入機體后，目的基因在體內(nèi)表達出目的蛋白，從而誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)。表達的蛋白經(jīng)apc加工后，通過mhcⅰ與mhcⅱ兩條通道提呈給免疫系統(tǒng)，刺激機體產(chǎn)生特異性體液和細胞免疫反應(yīng)。dna疫苗具有以下優(yōu)點：可以同時誘導(dǎo)細胞及體液免疫；不同免疫途徑均可誘發(fā)免疫反應(yīng)；具有適當(dāng)結(jié)構(gòu)及組成的外源性基因可以在人體內(nèi)表達，并誘生中和性抗體；易保存、運輸、生產(chǎn)。但它在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的效率相對較低，尤其是在大型動物和人類中，影響了它的實際應(yīng)用。佐劑是指與抗原同時或預(yù)先應(yīng)用，能增強機體針對抗原的免疫應(yīng)答能力，或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)。免疫佐劑可以增強抗體應(yīng)答；增強疫苗的粘膜傳遞，增進免疫接觸；增強細胞免疫；增強弱免疫原的免疫原性，如高度純化的抗原或重組抗原；減少抗原接種劑量和接種次數(shù)；促進疫苗在免疫應(yīng)答能力弱的人群中的免疫效果；加快免疫應(yīng)答的速度和延長持續(xù)時間；改變抗原的構(gòu)型；改變體液抗體的種類、igg亞類和抗體的親和性。佐劑的應(yīng)用對于提高dna疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的效率至關(guān)重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種乙型肝炎dna疫苗的免疫佐劑，該免疫佐劑為一種酶解多肽，以增強乙型肝炎dna疫苗的免疫應(yīng)答效率。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：一種酶解多肽，通過如下方法制備而成：將青蛤肉臟經(jīng)堿性蛋白酶酶解，用超濾膜截留分子量5000-3000u的組分，冷凍干燥即得所述酶解多肽。優(yōu)選地，所述的酶解多肽通過如下方法制備而成：取青蛤肉臟勻漿破碎，置于蒸餾水中，加入堿性蛋白酶酶解，酶解條件為ph值9.4-9.8，酶解溫度42-48℃，酶解時間6-8小時；酶解結(jié)束后，加熱使堿性蛋白酶滅活，冷卻至常溫，12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-25分鐘，取上清，依次用截留分子量為10000u、5000u、3000u的超濾膜進行分級分離，收集截留分子量5000-3000u的組分，冷凍干燥即得所述酶解多肽。優(yōu)選地，堿性蛋白酶重量為肉臟重量0.2-0.4％。優(yōu)選地，酶解條件為ph值9.6，酶解溫度45℃，酶解時間7小時。優(yōu)選地，加熱使堿性蛋白酶滅活的方法為：在80-90℃條件下水浴8-12分鐘。上述酶解多肽用作乙型肝炎dna疫苗佐劑的用途。本發(fā)明優(yōu)點：本發(fā)明酶解多肽可顯著增強乙型肝炎dna疫苗的免疫應(yīng)答效率，可用作dna疫苗佐劑。附圖說明圖1為各組抗hbsigg濃度；圖2-4為各組細胞因子表達檢測結(jié)果。具體實施方式為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例進一步介紹。實施例中未特別強調(diào)的實驗材料均為常規(guī)實驗材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。實施例1：酶解多肽的制備新鮮青蛤去殼取內(nèi)臟，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?；超濾杯和超濾膜購于上海摩速科學(xué)器材有限公司；堿性蛋白酶37017(1:2.5u/g)購于諾維信公司。取青蛤肉臟勻漿破碎，置于蒸餾水中，加入堿性蛋白酶酶解(堿性蛋白酶添加質(zhì)量為肉臟重量的0.3％)，酶解條件為ph值9.6，酶解溫度45℃，酶解時間7小時；酶解結(jié)束后，85℃條件下水浴10分鐘使堿性蛋白酶滅活，冷卻至常溫，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清，依次用截留分子量為10000u、5000u、3000u的超濾膜進行分級分離，收集截留分子量5000-3000u的組分，冷凍干燥即得所述酶解多肽。實施例2：酶解多肽的免疫增強作用一、實驗材料酶解多肽按照實施例1方法制備。兔igg、小鼠抗兔igg、四甲基偶氮唑(mtt)、刀豆蛋白(cona)、牛血清白蛋白(bsa)、佛波二脂(pma)、莫能菌素、多聚甲醛和皂素均為sigma公司產(chǎn)品；cd3、il-4、ifn-γ、cd4、cd8、igg1熒光單克隆抗體和fcγ抗體購自bd公司；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(cfse)為molecularprobes產(chǎn)品；胎牛血清和rpmi1640為gibco公司產(chǎn)品；hbsag華北制藥集團提供；hbsag特異性ctl多肽s208-215ilspflpl由上海吉爾生化有限公司合成；抗hbselisa檢測試劑盒購自北京金豪生物技術(shù)有限公司。二、實驗方法1、乙肝質(zhì)粒dna的制備將hbv前s2區(qū)和s區(qū)基因構(gòu)建到真核表達載體pcdna3.0中得乙肝質(zhì)粒，該質(zhì)粒委托廣州銳博生物科技有限公司構(gòu)建，已證實可高效表達。將乙肝質(zhì)粒和pcdna3.0空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化e.colidh5a，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切測序鑒定為陽性克隆，陽性克隆分別接種于含氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)15h，次日按1:80擴大培養(yǎng)5h制備發(fā)酵培養(yǎng)的種子，最后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，采用大規(guī)模堿裂解法提取質(zhì)粒，并用生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至1mg/ml于-20℃保存。2、動物分組和免疫方法c57bl/6小鼠隨機分為3組，每組10只，分組及處理方法如下：空白質(zhì)粒組：僅免疫pcdna3.0空白質(zhì)粒，100μl/次/只；乙肝質(zhì)粒組：僅免疫乙肝質(zhì)粒，100μl/次/只；佐劑輔助組：免疫乙肝質(zhì)粒+酶解多肽，乙肝質(zhì)粒100μl/次/只，酶解多肽2mg/kg/次/只。免疫時，肌肉多點注射于小鼠兩后股四頭肌。分別在第0、2、4周免疫小鼠，第6周處死小鼠檢測各項免疫學(xué)指標(biāo)。3、免疫學(xué)指標(biāo)檢測3.1抗hbsigg濃度檢測：抗hbs特異性igg含量按北京金豪生物技術(shù)有限公司抗hbselisa試劑盒說明書完成。3.2t淋巴細胞增殖：在最后一次免疫后第2周，無菌條件下分離脾細胞，通過尼龍柱除去b細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度到1×106個/ml，活細胞數(shù)在90％，每孔加入100μl細胞懸液到96孔細胞培養(yǎng)板上，加100μlhbsag抗原至終濃度為5μg/ml為實驗組，加100μlcona至終濃度為5μg/ml為陽性對照，加100μlbsa至終濃度為2μg/ml為無關(guān)對照，100μlrpmi1640為空白對照物，實驗組和對照孔各設(shè)3個重復(fù)孔，37℃、5％co2培養(yǎng)48h，每孔加入20μl5μg/mlmtt，37℃、5％co2培養(yǎng)4h，離心棄上清，每孔加入100μldmso，37℃培養(yǎng)15min，用酶標(biāo)儀測定a570吸光值，計算刺激指數(shù)(si)。3.3細胞因子表達水平：在最后一次免疫后第2周，無菌條件下分離脾細胞，通過尼龍柱除去b細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度到5×106個/ml，每孔加入100μl細胞懸液到96孔細胞培養(yǎng)板上，加hbsag抗原和抗cd28抗體每孔各50μl至終濃度為5μg/ml為實驗組；加100μlpma至終濃度為5μg/ml為陽性對照組，加100μlrpmi1640為空白對照組，實驗組和對照孔各設(shè)3個重復(fù)孔。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，離心收集細胞，抗fcγ抗體封閉，4％多聚甲醛固定8min，0.1％皂素破膜5min，pbs洗2次，用10μl熒光單克隆抗體cd4-fitc、cd4-pe、cd8-pe、il-4-pe和ifn-γ-fitc4℃暗處染色30min，并設(shè)抗相應(yīng)的同型對照，取300μl流式細胞儀檢測，比較各組細胞因子表達水平。3.4體內(nèi)ctl活性：在最后一次免疫后第2周，處死未經(jīng)免疫的空白小鼠，分離得到脾細胞，制成單個脾細胞懸液，分成二等份作為為靶細胞，一份加1×10-6mol/lhbsag特異性ctl表位多肽s208-215刺激，一份不刺激，37℃、5％co2培養(yǎng)4h，離心棄上清，pbs洗1次，未刺激的靶細胞用0.5μmol/lcfse暗處染色10min，刺激的靶細胞用5μmol/lcfse暗處染色10min，加入等體積小牛血清終止染色2min，離心棄上清，pbs洗1次，最后將兩種靶細胞等體積的混合，將2×107個靶細胞尾靜脈注射到免疫小鼠體內(nèi)，進行體內(nèi)細胞毒殺傷反應(yīng)，殺傷4h后處死小鼠，暗處分離得到脾細胞，取300μl流式細胞儀檢測分析，計算體內(nèi)ctl殺傷率(％)。4、統(tǒng)計學(xué)分析使用spss20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行t檢驗，p<0.05認為差異顯著。三、實驗結(jié)果1、抗hbsigg濃度檢測結(jié)果在最后一次免疫后2周，elisa法檢測小鼠血清抗hbsigg。如圖1所示，抗hbsigg檢測結(jié)果顯示，佐劑輔助組抗hbsigg濃度為458miu/ml，乙肝質(zhì)粒組抗hbsigg濃度為264miu/ml，空白質(zhì)粒組抗hbsigg濃度為62miu/ml。由此可見，佐劑輔助組抗hbsigg濃度顯著高于乙肝質(zhì)粒組抗hbsigg濃度和空白質(zhì)粒組抗hbsigg濃度(p＜0.05)。2、t淋巴細胞增殖實驗結(jié)果在最后一次免疫后2周，小鼠t淋巴細胞經(jīng)hbsag刺激后，佐劑輔助組和乙肝質(zhì)粒組t淋巴細胞均產(chǎn)生特異性增殖，明顯高于空白質(zhì)粒組(p＜0.05)，且佐劑輔助組又明顯高于乙肝質(zhì)粒組(p＜005)，各組刺激指數(shù)(si)如下表所示?？瞻踪|(zhì)粒組乙肝質(zhì)粒組佐劑輔助組刺激指數(shù)(si)1.4±0.32.2±0.24.5±0.33、細胞因子表達檢測結(jié)果如圖2-4所示，在最后一次免疫后2周，小鼠t淋巴細胞經(jīng)hbsag刺激后，與乙肝質(zhì)粒組相比，佐劑輔助組能夠顯著上調(diào)cd4+t淋巴細胞il-4和ifn-γ的表達，同時佐劑輔助組也顯著增強cd8+t淋巴細胞ifn-γ的表達。4、體內(nèi)ctl活性在最后一次免疫后2周，體內(nèi)ctl殺傷反應(yīng)經(jīng)過流式細胞儀進行檢測，各組體內(nèi)殺傷率如下表所示，佐劑輔助組顯著優(yōu)于乙肝質(zhì)粒組和空白質(zhì)粒組：空白質(zhì)粒組乙肝質(zhì)粒組佐劑輔助組體內(nèi)殺傷率(％)7.9±1.432.5±2.373.4±2.9綜合上述實驗可以看出，本發(fā)明酶解多肽可顯著增強乙型肝炎dna疫苗的免疫應(yīng)答效率，既可以提高體液免疫應(yīng)答，又可以提高細胞免疫應(yīng)答，可用作dna疫苗佐劑。上述實施例僅用于進一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，任何簡單替換或修改均不脫離本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。當(dāng)前第1頁12