本發(fā)明涉及腫瘤生物治療領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤藥物、疫苗及制備方法。

背景技術(shù)：

包括膽管癌在內(nèi)的消化道腫瘤（包括胃癌、結(jié)直腸癌、肝膽胰癌等）是我國的多發(fā)性癌癥，嚴(yán)重威脅人民健康。膽管癌是一種起源于膽道上皮的高度惡性的腫瘤，膽管癌的發(fā)病率占消化道惡性腫瘤的3%，其發(fā)病率和死亡率，近年來在全球范圍內(nèi)持續(xù)增加，在我國膽管癌的發(fā)病率也在快速上升。膽管癌的增生性特點(diǎn)是腫瘤微血管極為豐富并且腫瘤基因異質(zhì)性強(qiáng)，這使得諸如化療放療等輔助療法治療困難。目前，腫瘤的根治性切除和肝臟移植是已知的根治性治療膽管癌方法，但由于膽管癌起病隱匿，易早期出現(xiàn)淋巴浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者住院時(shí)可能已經(jīng)失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，導(dǎo)致根治性切除率低且不穩(wěn)定，術(shù)后年生存率極低。因此，迫切需要尋找新的膽管癌治療方法。

腫瘤免疫治療是目前國內(nèi)外腫瘤研究的熱點(diǎn)，腫瘤免疫治療通過提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性和對效應(yīng)細(xì)胞殺傷的敏感性，激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答；目前腫瘤免疫治療方法主要包括：單克隆抗體類免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如ctla-4單抗、pd-1/pd-l1單抗等）、car-t細(xì)胞療法、小分子抑制劑（如ido）、腫瘤疫苗（如腫瘤抗原肽段疫苗、樹突狀細(xì)胞（dc）疫苗、溶瘤病毒疫苗等），以及生物治療（如病原體瘧原蟲疫苗）等。雖然這些治療方法在其他腫瘤的治療中取得了一定的效果，但是對于膽管癌效果并不理想。

生物治療涉及一切應(yīng)用生物大分子進(jìn)行治療的方法，生物治療通過調(diào)動(dòng)宿主的天然防御機(jī)制或給予天然產(chǎn)生的針對性、靶向性很強(qiáng)的物質(zhì)，來提高患者自身免疫能力，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的治療；目前生物治療已成為繼傳統(tǒng)手術(shù)、放療和化療后最有發(fā)展前途的腫瘤治療手段之一。生物治療的一個(gè)重要特征是增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。大量的研究已表明，機(jī)體免疫系統(tǒng)對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用，作為腫瘤免疫防御系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)可通過清除或抑制病毒感染來保護(hù)機(jī)體免受病毒誘發(fā)腫瘤；及時(shí)清除病原體和控制炎癥防止建立有利于腫瘤發(fā)生的炎癥環(huán)境；通過腫瘤免疫監(jiān)視，特異性識別和消滅癌細(xì)胞或癌前細(xì)胞。目前研究表明，t淋巴細(xì)胞，尤其是cd8+t細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視和抑制腫瘤的最主要效應(yīng)細(xì)胞。

雖然t細(xì)胞在許多腫瘤中存在并激活，但通常它們活性比較低，這可能主要?dú)w咎于抑制腫瘤微環(huán)境中t細(xì)胞的功能失調(diào)，腫瘤細(xì)胞為逃逸免疫監(jiān)視發(fā)展了多種策略逃避或抑制t細(xì)胞應(yīng)答：通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞抗原或i類mhc分子，使t細(xì)胞發(fā)現(xiàn)不了腫瘤細(xì)胞；通過表達(dá)細(xì)胞毒性t細(xì)胞的抑制分子(pd-l1，ctla-4)抑制腫瘤抗原特異性t細(xì)胞的活化；通過募集調(diào)節(jié)性t細(xì)胞或髓源性抑制細(xì)胞等抑制t細(xì)胞增殖和活化。腫瘤抗原特異性t細(xì)胞不但是機(jī)體免疫監(jiān)視腫瘤的主要效應(yīng)機(jī)制，同時(shí)也是腫瘤的免疫逃避的核心環(huán)節(jié)。如何有效激活機(jī)體t細(xì)胞免疫應(yīng)答是目前腫瘤免疫治療研究的重點(diǎn)。

弓形體（細(xì)胞內(nèi)寄生病原體）是具有很強(qiáng)感染宿主細(xì)胞能力的單細(xì)胞真核微生物，感染后在宿主細(xì)胞內(nèi)生存和復(fù)制，造成弓形體病，由于免疫正常宿主通?？赏ㄟ^免疫力清除弓形體感染，弓形體病相對危害小，目前多作為細(xì)胞內(nèi)模式病原生物來研究。研究發(fā)現(xiàn)，弓形體感染宿主產(chǎn)生的細(xì)胞因子、化學(xué)因子，以及t細(xì)胞免疫反應(yīng)具有良好的抗腫瘤效果。例如，50年前弓形體感染已被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤效果，來自于死的弓形體的蛋白提取物被證明可抑制多種腫瘤的生長，包括纖維肉瘤、肺癌、黑色素瘤、肉瘤及化學(xué)方法誘導(dǎo)的腫瘤等。應(yīng)用活的弓形體感染小鼠也被發(fā)現(xiàn)可抑制小鼠膀胱癌、腦腫瘤、白血病、lewis肺癌、黑色素瘤等多種癌癥的生長。然而，由于野生型弓形體的感染對宿主的危害問題，活的弓形體不太適合應(yīng)用于腫瘤患者的治療，另外癌癥患者常伴有免疫力低下，更易于受到弓形體的感染傷害。

無毒株弓形體是一種通過同源重組特異敲除弓形體cps基因的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型蟲株，因其感染后不能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而基本無毒。體外培養(yǎng)時(shí)可通過在培養(yǎng)基中添加一定濃度的尿嘧啶維持重組弓形體的正常侵襲和存活，但其不能在宿主細(xì)胞或小鼠體內(nèi)復(fù)制，因此對宿主基本無毒，從而保證了疫苗的安全性。香菇多糖是從優(yōu)質(zhì)香菇子實(shí)體中提取的有效活性成分，是香菇的主要有效成分，主要為甘露糖甘肽，其余為多種糖分和各種氨基酸等，是一種宿主免疫增強(qiáng)劑，具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等作用，目前已廣泛應(yīng)用于胃癌、結(jié)直腸癌等的臨床輔助治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，一種無毒株弓形體和中藥多糖佐劑組合物的用途、疫苗及制備方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種無毒株弓形體和中藥多糖佐劑組合物的用途，該組合物應(yīng)用于治療腫瘤及制備治療腫瘤的藥物。

進(jìn)一步，該組合物應(yīng)用于治療消化道腫瘤及制備治療消化道腫瘤的藥物。

進(jìn)一步，組合物應(yīng)用于治療膽管癌及制備治療膽管癌的藥物。

一種無毒株弓形體和中藥多糖佐劑組合物制成的疫苗，用于治療腫瘤。

進(jìn)一步，無毒株弓形體和中藥多糖佐劑組合物制成的疫苗用于治療消化道腫瘤。

進(jìn)一步，無毒株弓形體和中藥多糖佐劑組合物制成的疫苗用于治療膽管癌。

上述疫苗的制備方法為：用無毒株弓形體感染hff細(xì)胞，用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從hff細(xì)胞離心收集新鮮破壁的無毒株弓形體，用pbs振蕩溶解中藥多糖，然后將收集的無毒株弓形體重懸于中藥多糖佐劑中制成疫苗。

進(jìn)一步，中藥多糖佐劑選自香菇多糖、黃芪多糖、人參多糖或靈芝多糖中的一種或多種，優(yōu)選香菇多糖佐劑。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的無毒株弓形體和中藥多糖佐劑組合物疫苗可用于治療腫瘤及制備治療腫瘤的藥物，尤其用于治療消化道腫瘤，特別是對膽管癌具有顯著的治療作用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

圖1是弓形體cpsⅱ6.6kb基因片段的pcr結(jié)果示意圖；

圖2是重組質(zhì)粒pbluescript/cpsⅱ結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是重組質(zhì)粒pbluescript/cps/hxg結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是重組質(zhì)粒pbluescript/cpsⅱ/hxg的hindiii酶切結(jié)果圖；

圖5是pcr鑒定cps基因敲除的無毒株弓形體的結(jié)果圖；

圖6是膽管瘤（ca）的發(fā)生率比較圖；

圖7是膽管瘤（ca）的腫瘤個(gè)數(shù)比較圖；

圖8是膽管癌（cca）的發(fā)生率比較圖；

圖9是膽管癌（cca）的腫瘤個(gè)數(shù)比較圖。

具體實(shí)施方式

一種無毒株弓形體和中藥多糖佐劑組合物的用途，該組合物應(yīng)用于治療腫瘤及制備治療腫瘤的藥物，目前的藥物研究表明，香菇多糖、黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖對腫瘤具有治療效果，本發(fā)明的中藥多糖分別采用自香菇多糖、黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖中的一種、任一兩種及兩種以上的混合物。

中藥多糖佐劑可通過免疫協(xié)同作用，與弓形體的免疫激活作用配合，多靶點(diǎn)高效激活抗腫瘤的某些特異免疫調(diào)控通路，特別是與殺傷性t細(xì)胞免疫激活有關(guān)的抗腫瘤免疫通路，通過腹腔注射小鼠實(shí)驗(yàn)證明，對膀胱癌、腦腫瘤、白血病、lewis肺癌、黑色素瘤等多種癌癥具有一定治療作用，對治療消化道腫瘤具有明顯的治療效果，對膽管癌的治療效果尤為顯著，因此，這里的中藥多糖是指從植物藥、菌類中提取，對腫瘤具有治療效果的多糖，在本發(fā)明的研發(fā)及實(shí)驗(yàn)過程中，中藥多糖一般采用香菇多糖。

無毒株弓形體和中藥多糖佐劑的組合物可以制成用于治療腫瘤的疫苗，該疫苗的制備方法為：無毒株弓形體感染hff細(xì)胞（人包皮成纖維細(xì)胞）（atcc），用選擇培養(yǎng)基（dmem+3%fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素+25μg/ml霉酚酸+50μg/ml黃嘌呤+250μm尿嘧啶）進(jìn)行培養(yǎng)，從hff細(xì)胞離心收集新鮮破壁的無毒弓形體，用pbs振蕩溶解香菇多糖（山西泰盛制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字h20064611），然后將收集的無毒弓形體重懸于香菇多糖佐劑中。

疫苗需要冷凍保存，保存時(shí)無毒株弓形體的濃度要大于2×10⁷個(gè)/ml，冷凍液是：選擇培養(yǎng)基+20%fbs+10%dmso或選擇培養(yǎng)基+15%乙二醇，疫苗在-80℃可保存1年以上，在液氮條件下可保存5年。使用時(shí)配在選擇培養(yǎng)基+15%乙二醇的細(xì)胞保護(hù)液里，在4℃下可保存2-3天。

無毒株弓形體的制備方法如下（參見參考文獻(xiàn)：1：nature2002,415(6874):926-9；2：infectimmun2010,78(9):3744-5；3：jvisexp2013(77)：e50598）：

1、pbluescript/cpsⅱ質(zhì)粒的構(gòu)建

利用pcr技術(shù)，從弓形體基因組擴(kuò)增兩端含有限制性內(nèi)切酶hindш識別位點(diǎn)的cpsⅱ6.6kb基因片段。利用easypuregelextractionkit膠回收試劑盒（北京全式金（transgenbiotech），貨號是#eg101）回收pcr產(chǎn)物。用hindiii（newenglandbiolabs公司，貨號是#r0104）酶切6.6kbdna片段，并用dnaclean-upkit試劑盒（康為生物（cwbiotech,beijing），貨號是#cw2301m）回收酶切的產(chǎn)物，結(jié)果參照圖1，命名為cpsⅱ6.6kb。利用pcr技術(shù)使線性化pbluescriptvector帶cpsⅱ基因序列接頭，產(chǎn)物命名為pbluescriptvector（stratagene）。利用無縫連接試劑盒trelief?sosoocloningkit（北京擎科，貨號是tsv-v1），連接pbluescriptvector和cpsⅱ6.6kb。利用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（天根生化科技有限公司，貨號#cb104）。利用easypureplasmidminiprepkit（北京全式金（transgenbiotech），貨號是#em101）抽提質(zhì)粒，由北京擎科測序鑒定，結(jié)果參照圖2，獲得pbluescript/cpsⅱ質(zhì)粒。

2、pbluescript/cpsⅱ/hxg質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)含有接頭的引物，利用pcr技術(shù)，從pmini-hxg質(zhì)粒擴(kuò)增篩選標(biāo)記hxgprt，利用easypuregelextractionkit膠回收試劑盒（北京全式金（transgenbiotech），貨號是#eg101）純化dna，命名為hxg（bamhi）。用bamh?酶（newenglandbiolabs公司，貨號是#r0136）切重組質(zhì)粒pbluescript/cpsⅱ。利用easypuregelextractionkit膠回收試劑盒（北京全式金（transgenbiotech），貨號是#eg101）回收大片段的線性載體，命名為pbluescript/cpsⅱ（bamh?）。利用公司的無縫連接試劑盒trelief?sosoocloningkit（北京擎科，貨號是tsv-v1），連接pbluescript/cpsⅱ（bamh?）和hxg（bamh?）。利用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。利用easypureplasmidminiprepkit（北京全式金（transgenbiotech），貨號是#em101）抽提質(zhì)粒，由北京擎科測序鑒定，結(jié)果參照圖3，獲得重組質(zhì)粒pbluescript/cpsⅱ/hxg。利用無內(nèi)毒素中提試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號#dp117）抽提重組質(zhì)粒pbluescript/cpsⅱ/hxg。用neb公司的hindiii（newenglandbiolabs公司，貨號是#r0104）酶切質(zhì)粒，結(jié)果參照圖4。利用easypuregelextractionkit膠回收試劑盒（北京全式金（transgenbiotech），貨號是#eg101）回收并乙醇沉淀純化大片段dna，獲得cpsⅱ/hxg（hindiii）片段。

3、無毒株弓形體cps的構(gòu)建

將cpsⅱ/hxg（hindiii）片段利用電穿孔系統(tǒng)(美國btxecm830電穿孔儀)轉(zhuǎn)至弓形體（rhδku80δhxgprt），將電轉(zhuǎn)的弓形體接種到hff細(xì)胞，利用含mycophenolicacid25μg/ml、xanthine50μg/ml、uracil250μm的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選目的弓形體并進(jìn)行pcr驗(yàn)證，結(jié)果參照圖5。

4、無毒株弓形體和香菇多糖佐劑組合物疫苗用于治療膽管癌實(shí)驗(yàn)

膽管癌小鼠模型參照參考文獻(xiàn)（gastroenterology2011，141(1):378-88）進(jìn)行。簡而言之，balb/c小鼠每周腹腔注射二乙基亞硝胺（den）2次，連續(xù)2周，2周后行左和中膽管結(jié)扎，1周后進(jìn)行den口服給藥。同時(shí)在小鼠膽管癌建模過程，用香菇多糖和無毒株弓形體聯(lián)合疫苗進(jìn)行治療。從hff細(xì)胞離心收集新鮮破壁的無毒弓形體，用pbs振蕩溶解香菇多糖（山西泰盛制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字h20064611），然后將收集的無毒弓形體重懸于香菇多糖佐劑中制備聯(lián)合疫苗。分別在小鼠膽管癌建模的第2、5、9、12、17、18、20、22周，腹腔注射疫苗，無毒弓形體的劑量是1×10⁶個(gè)/小鼠，香菇多糖佐劑的劑量是40mg/kg。分四組：無治療組，pbs；香菇多糖治療組，lentinan；無毒株弓形體治療組，cps；香菇多糖和無毒株弓形體聯(lián)合治療組，cps+lentinan。28周觀察小鼠膽管腫瘤形成情況，參照圖6至圖9，結(jié)果顯示，與無治療組相比較，無毒株弓形體治療可顯著降低膽管瘤和膽管癌的發(fā)生率及腫瘤數(shù)目，而無毒株弓形體和香菇多糖佐劑組合物聯(lián)合治療的效果更為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。