本發(fā)明涉及一種用于免疫檢測(cè)技術(shù)的表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳的制備方法。

背景技術(shù)：

在免疫檢測(cè)領(lǐng)域的一般情況下，首先將抗原抗體反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，然后用濁度法定量測(cè)定，但形成抗原-抗體復(fù)合物需要較長(zhǎng)時(shí)間。膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定法(簡(jiǎn)稱LETIA)是近年來免疫檢測(cè)領(lǐng)域出現(xiàn)的一種新的免疫檢測(cè)技術(shù)，LETIA不需要特殊儀器，自動(dòng)、半自動(dòng)生化分析儀即可測(cè)定，適宜在廣大基礎(chǔ)醫(yī)療單位推廣應(yīng)用。目前已被應(yīng)用于許多分析物定量測(cè)定有數(shù)十種之多，如ASO、RF、CRP、轉(zhuǎn)鐵蛋白、弓形體、風(fēng)疹、β₂-微球蛋白及藥物監(jiān)測(cè)等。

LETIA其原理是包被了抗原或抗體的膠乳微粒(免疫膠乳)，與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成凝集顆粒，凝集物的形成使反應(yīng)混合系統(tǒng)形成一定濁度，濁度增加的程度與標(biāo)本中被檢物濃度成正比關(guān)系，在一定波長(zhǎng)下進(jìn)行濁度測(cè)定，即可測(cè)出標(biāo)本中被檢物的含量。因此，如何制備出適合的膠乳(免疫膠乳)是膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定的關(guān)鍵。

目前，常規(guī)膠乳制備過程，多要使用乳化劑作為輔助原料，但是膠乳制備完成后，其中往往會(huì)殘留一定量的乳化劑，而乳化劑的存在會(huì)影響膠乳最終的使用性能。

另，膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定用的波長(zhǎng)與所用膠乳粒徑大小有關(guān)，而現(xiàn)有技術(shù)制備的膠乳顆粒的粒徑均一性不是很理想，因此會(huì)影響測(cè)定的精度。

據(jù)研究表明，表面有羧基修飾的聚苯乙烯膠乳是以聚苯乙烯為內(nèi)核，其表面的羧基能夠通過化學(xué)法偶聯(lián)抗原或偶聯(lián)抗體，該膠乳適于用于膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定法，但是，關(guān)于制備表面具有較高羧基含量且粒徑均一的聚苯乙烯膠乳卻鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種無乳化劑殘留，膠乳顆粒粒徑均一，測(cè)定精度高、且表面帶有羧基能夠通過化學(xué)法偶聯(lián)抗原或偶聯(lián)抗體的用于免疫檢測(cè)技術(shù)的表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明的一種用于免疫檢測(cè)技術(shù)的表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳的制備方法，制備步驟包括：

(1)將苯乙烯(St)、甲基丙烯酸(MAA)、水加入到反應(yīng)容器后攪拌10～30min；上述甲基丙烯酸與苯乙烯的摩爾比是0.1～0.2∶1；

(2)步驟(1)所得的反應(yīng)混合物攪拌結(jié)束后，向該反應(yīng)混合物中通入30min的氮?dú)?N₂)，用以除去反應(yīng)混合物中的氧氣，然后再向該反應(yīng)混合物中加入過硫酸鉀(KPS)水溶液和氯化鈉(NaCl)水溶液，使得加完后所得的反應(yīng)混合物中氯化鈉的濃度為0.064mol/L、過硫酸鉀的濃度范圍為7.00×10^-4～25.0×10^-3mol/L，然后再向此時(shí)的反應(yīng)混合物中繼續(xù)通入20min的N₂；

(3)步驟(2)所得的反應(yīng)混合物在氮?dú)馔ㄈ?0min后，停止通入氮?dú)猓賹⒎磻?yīng)混合物升溫至60～80℃，反應(yīng)12～24h；

(4)反應(yīng)完成后冷卻到室溫，得到本發(fā)明表面經(jīng)過羧基改性的聚苯乙烯膠乳即表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳。

本發(fā)明一種用于免疫檢測(cè)技術(shù)的表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳的制備方法，制備步驟還包括：將步驟(4)所得的表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳用去離子水多次離心沉降清洗，直至離心出的上清液的電導(dǎo)率與去離子水的相似為止。

本發(fā)明制備的表面帶羧基的聚苯乙烯膠乳的顆粒粒徑為100～500nm。

上述步驟(1)中加入的水和步驟(2)配制過硫酸鉀水溶液和氯化鈉水溶液所用的水，兩部分所用水的總量要使得步驟(1)所加的甲基丙烯酸在該總用水量中的濃度為0.0819～0.174mol/L。

氯化鈉電解質(zhì)：

本發(fā)明的反應(yīng)體系為無皂聚合體系，對(duì)于無皂聚合體系來說，由于所用的引發(fā)劑為過硫酸鉀，引發(fā)劑分裂后的硫酸根吸附在高聚物周圍，由于靜電排斥作用保持體系的穩(wěn)定。當(dāng)加入氯化鈉電解質(zhì)時(shí)，隨著離子強(qiáng)度增大，乳膠粒雙層變薄，靜電排斥力逐漸下降，體系變得越來越不穩(wěn)定，使得初始離子失去穩(wěn)定性而彼此凝結(jié)，因而膠乳顆粒的粒徑變大，形成粒徑較大的聚合物膠乳。由于離子強(qiáng)度增大導(dǎo)致體系失穩(wěn)，膠乳粒子因此也分布不均，從而分散系數(shù)增大。當(dāng)離子強(qiáng)度增大到一定程度，其對(duì)粒徑影響較小，而對(duì)分散性影響較大。

甲基丙烯酸共聚單體：

親水性共聚單體(甲基丙烯酸)的加入，使得聚苯乙烯膠乳顆粒的粒徑明顯減小。這是因?yàn)橛H水性共聚單體所起到的穩(wěn)定作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于引發(fā)劑的親水基團(tuán)，使得生成的膠乳顆粒比較穩(wěn)定，顆粒之間不會(huì)發(fā)生聚集。

溶劑：

極性或非極性溶劑的加入，由于對(duì)單體和聚合物的溶解度不同，因此對(duì)膠乳粒徑和分散性有著一定的影響。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1.本發(fā)明制備的聚苯乙烯膠乳其表面具有較高的羧基含量，表面有羧基修飾的聚苯乙烯膠乳以聚苯乙烯為內(nèi)核，其表面的羧基通過化學(xué)法偶聯(lián)抗原或抗體，因此，適于利用膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定法，測(cè)定效果好。

2.本發(fā)明是通過無皂乳液聚合制備的聚苯乙烯膠乳，制備過程沒有使用乳化劑，因此，消除了常規(guī)乳液聚合產(chǎn)物中由于殘留乳化劑而影響其最終使用性能這一不利因素。

3.本發(fā)明制備的聚苯乙烯膠乳是采用無皂乳液聚合制備的，制備的膠乳微球比表面積大，粒徑分布均勻，表面潔凈，并且表面的一些性質(zhì)如親水性、功能基團(tuán)的數(shù)目和分布在一定程度上可以控制，因此利用本發(fā)明制備得到的聚苯乙烯膠乳在均一性和羧基含量方面滿足LETIA中對(duì)膠乳的要求。

附圖說明

圖1本發(fā)明實(shí)施例1所得的聚苯乙烯膠乳顆粒粒度納米分析。

圖2本發(fā)明實(shí)施例1所得的聚苯乙烯膠乳顆粒透射電子顯微鏡圖(TEM)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于下述實(shí)施例。

實(shí)施例1

(1)將苯乙烯、甲基丙烯酸、水加入到三口燒瓶后攪拌10min；上述苯乙烯為0.041mol、甲基丙烯酸為8.7mmol，水10ml；

(2)步驟(1)所得的反應(yīng)體系攪拌結(jié)束后，向反應(yīng)體系中通入30min的N₂，然后將約0.066g的過硫酸鉀和約0.207g的氯化鈉加入到40ml的水中配置成水溶液，將上述配置的水溶液加入到反應(yīng)體系中，加完后反應(yīng)體系中NaCl的濃度為0.064mol/L、KPS的濃度為4.38×10^-3mol/L(總用水量即步驟(1)所加的水和步驟(2)配置氯化鈉和過硫酸鉀所用的水為50ml，配置NaCl和KPS水溶液所用的水只是確保能將NaCl和KPS完全溶解在水中，因?yàn)槿粢怨虘B(tài)的形式將NaCl和KPS加入到反應(yīng)體系中的話，有苯乙烯存在，不一定能確保NaCl和KPS的溶解性；只要確定加入NaCl和KPS水溶液之后，整個(gè)反應(yīng)體系中NaCl和KPS的濃度為上述濃度即可，實(shí)施例2～5亦同)，然后再繼續(xù)通入20min的N₂，在整個(gè)反應(yīng)體系中，所加入的水的總量為50ml，此時(shí)步驟(1)所加的甲基丙烯酸在總用水量中的濃度為0.174mol/L；

步驟(1)加入的水的量小于總用水量50ml，剩余的水只要保證能夠完全溶解步驟(2)需要加入的NaCl和KPS即可，因此，每次步驟(1)加入的水的量和溶解步驟(2)的NaCl和KPS所用的水量均可以是不固定的或者是固定的，總用水量為50ml，實(shí)施例2～5亦同。

(3)氮?dú)馔ㄈ胪瓿珊?，將步驟(2)所得的反應(yīng)體系升溫至70℃，反應(yīng)17.5小時(shí)；

(4)反應(yīng)完成后冷卻到室溫后得到表面經(jīng)過羧基改性的聚苯乙烯膠乳。制得的膠乳用去離子水多次離心沉降清洗，直至離心出的上清液的電導(dǎo)率與去離子水的相似為止，然后用水稀釋，以乳液形式保存。

利用粒度納米分析儀和透射電子顯微鏡(TEM)，對(duì)制得的膠乳粒徑進(jìn)行了檢測(cè)。利用反向電導(dǎo)滴定法對(duì)膠乳表面的羧基含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)得的羧基含量為2.60mmol/g。

由圖1和圖2可以看出該膠乳粒徑在120nm左右，單分散指數(shù)是0.017，表面光滑，形態(tài)規(guī)整，粒徑均一，具有較好的單分散性。

實(shí)施例2

(1)將苯乙烯、甲基丙烯酸、水加入到三口燒瓶后攪拌10min；上述苯乙烯為0.041mol、甲基丙烯酸為8.7mmol，水10ml；

(2)步驟(1)所得的反應(yīng)體系攪拌結(jié)束后，向反應(yīng)體系中通入30min的N₂，然后將約0.117g的過硫酸鉀和約0.207g的氯化鈉加入到40ml的水中配置成水溶液，將上述配置的水溶液加入到反應(yīng)體系中，加完后反應(yīng)體系中NaCl的濃度為0.064mol/L、KPS的濃度為7.88×10^-3mol/L，然后再繼續(xù)通入20min的N₂，在整個(gè)反應(yīng)體系中，所加入的水的總量為50ml，此時(shí)步驟(1)所加的甲基丙烯酸在總用水量中的濃度為0.174mol/L；

(3)氮?dú)馔ㄈ胪瓿珊?，將步驟(2)所得的反應(yīng)體系升溫至70℃，反應(yīng)17.5小時(shí)；

(4)反應(yīng)完成后冷卻到室溫后得到表面經(jīng)過羧基改性的聚苯乙烯膠乳。制得的膠乳用去離子水多次離心沉降清洗，直至離心出的上清液的電導(dǎo)率與去離子水的相似為止，然后用水稀釋，以乳液形式保存。

由粒度納米分析測(cè)得該膠乳粒徑為163.9nm，單分散指數(shù)為0.021，具有較好的單分散性。

實(shí)施例3

(1)將苯乙烯、甲基丙烯酸、水加入到三口燒瓶后攪拌10min；上述苯乙烯為0.041mol、甲基丙烯酸8.7mmol，水10ml；

(2)步驟(1)所得的反應(yīng)體系攪拌結(jié)束后，向反應(yīng)體系中通入30min的N₂，然后將約0.12g的過硫酸鉀和約0.207g的氯化鈉加入到40ml的水中配置成水溶液，將上述配置的水溶液加入到反應(yīng)體系中，加完后反應(yīng)體系中NaCl的濃度為0.064mol/L、KPS的濃度為8.14×10^-3mol/L，然后再繼續(xù)通入20min的N₂，在整個(gè)反應(yīng)體系中，加入的水的量為50mL，此時(shí)步驟(1)所加的甲基丙烯酸在總用水量中的濃度為0.174mol/L；

(3)氮?dú)馔ㄈ胪瓿珊?，將步驟(2)所得的反應(yīng)體系升溫至70℃，反應(yīng)17.5小時(shí)；

(4)反應(yīng)完成后冷卻到室溫后得到表面經(jīng)過羧基改性的聚苯乙烯膠乳。制得的膠乳用去離子水多次離心沉降清洗，直至離心出的上清液的電導(dǎo)率與去離子水的相似為止，然后用水稀釋，以乳液形式保存。

由粒度納米分析測(cè)得該膠乳粒徑為176.9nm，單分散指數(shù)為0.054，具有較好的單分散性。

實(shí)施例4

(1)將苯乙烯、甲基丙烯酸、水加入到三口燒瓶后攪拌10min；上述苯乙烯為0.041mol、甲基丙烯酸為7.6mmol，水10ml；

(2)步驟(1)所得的反應(yīng)體系攪拌結(jié)束后，向反應(yīng)體系中通入30min的N₂，然后將約0.118g的過硫酸鉀和約0.207g的氯化鈉加入到40ml的水中配置成水溶液，將上述配置的水溶液加入到反應(yīng)體系中，加完后反應(yīng)體系中NaCl的濃度為0.064mol/L、KPS的濃度為7.88×10^-3mol/L，然后再繼續(xù)通入20min的N₂，在整個(gè)反應(yīng)體系中，加入的水的量為50mL，此時(shí)步驟(1)所加的甲基丙烯酸在總用水量中的濃度為0.152mol/L；

(3)氮?dú)馔ㄈ胪瓿珊螅瑢⒉襟E(2)所得的反應(yīng)體系升溫至70℃，反應(yīng)17.5小時(shí)；

(4)反應(yīng)完成后冷卻到室溫后得到表面經(jīng)過羧基改性的聚苯乙烯膠乳。制得的膠乳用去離子水多次離心沉降清洗，直至離心出的上清液的電導(dǎo)率與去離子水的相似為止，然后用水稀釋，以乳液形式保存。

由粒度納米分析測(cè)得該膠乳粒徑為204.0nm，單分散指數(shù)為0.025，具有較好的單分散性。

實(shí)施例5

(1)將苯乙烯、甲基丙烯酸、水加入到三口燒瓶后攪拌10min；上述苯乙烯為0.041mol、甲基丙烯酸為7mmol，水12ml；

(2)步驟(1)所得的反應(yīng)體系攪拌結(jié)束后，向反應(yīng)體系中通入30min的N₂，然后將約0.118g的過硫酸鉀和約0.207g的氯化鈉加入到38ml的水中配置成水溶液，將上述配置的水溶液加入到反應(yīng)體系中，加完后反應(yīng)體系中NaCl的濃度為0.064mol/L、KPS的濃度范圍為7.88×10^-3mol/L，然后再繼續(xù)通入20min的N₂，在整個(gè)反應(yīng)體系中，加入的水的量為50mL，此時(shí)步驟(1)所加的甲基丙烯酸在總用水量中的濃度為0.14mol/L；

(3)氮?dú)馔ㄈ胪瓿珊?，將步驟(2)所得的反應(yīng)體系升溫至70℃，反應(yīng)17.5小時(shí)；

(4)反應(yīng)完成后冷卻到室溫后得到表面經(jīng)過羧基改性的聚苯乙烯膠乳。制得的膠乳用去離子水多次離心沉降清洗，直至離心出的上清液的電導(dǎo)率與去離子水的相似為止，然后用水稀釋，以乳液形式保存。

由粒度納米分析測(cè)得該膠乳粒徑為251.0nm，單分散指數(shù)為0.051，具有較好的單分散性。