本發(fā)明涉及高分子化合物領(lǐng)域，具體涉及一種載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：乳腺癌(breastcancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％，為腫瘤相關(guān)性死亡的第二大原因，僅次于肺癌，嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命。因此，乳腺癌的診斷顯得尤為重要，而乳腺癌的診斷依賴于影像技術(shù)的發(fā)展，并進(jìn)一步影響乳腺癌的治療和預(yù)后。乳腺鉬靶x線攝影檢查為近年來最有效的乳腺癌診斷手段之一，但是仍有輻射的風(fēng)險。超聲和磁共振(mri)在乳腺癌的診斷、分期和隨訪中也有著重要的作用，且沒有輻射的風(fēng)險；然而，限制的空間分辨率和對比度不佳影響了超聲在乳腺癌早期診斷中的作用。磁共振(mri)具有空間分辨率高并且無組織穿透性限制的優(yōu)點(diǎn)，但存在靈敏度相對較低的缺點(diǎn)，且價格昂貴。光聲成像(photoacoustic(pa)imaging，pai)是一種新興的非侵入性的成像方式，和超聲成像相比具有高分辨率的優(yōu)點(diǎn)；然而，由于組織深部固有生色團(tuán)(如氧化血紅蛋白和脫氧血紅蛋白)對光吸收不佳，pai在探測深部組織的時候有相對限制。所以，將近紅外吸收物質(zhì)作為造影劑可用于光聲成像探測深層組織引起了廣泛的興趣。綜上所述，通過結(jié)合光聲成像和磁共振成像的多模態(tài)顯像，可以達(dá)到高分辨率和高敏感性，以期探測深部組織來達(dá)到安全無輻射的早期診斷乳腺癌，實(shí)時治療監(jiān)控和改善預(yù)后的目的。但是，要實(shí)現(xiàn)高效多模態(tài)顯像，多功能多模態(tài)分子探針造影劑尤為重要。以納米材料為基礎(chǔ)的分子探針，可以使多種不同成像方法相結(jié)合，克服各自局限性，更直觀形象地為組織或疾病提供更深層次的信息。所以，新穎的光聲/磁共振成像的多模態(tài)造影劑是近年來學(xué)者研究的熱點(diǎn)。光熱療法(photothermaltherapy，ptt)是一種非侵入性的微創(chuàng)的腫瘤治療方法，近年來多有研究，它利用光熱物質(zhì)把近紅外光轉(zhuǎn)變?yōu)闊醽怼盁馈蹦[瘤細(xì)胞。然而，光熱療法中，產(chǎn)生的熱分布不均一可能導(dǎo)致腫瘤消融不徹底導(dǎo)致復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。如果將光熱療法和化療結(jié)合可以顯著的增加綜合治療腫瘤的效率。然而傳統(tǒng)的化療藥物對癌細(xì)胞無特異性，在殺死癌細(xì)胞的同時也會對正常細(xì)胞和組織造成損傷，由此導(dǎo)致了全身嚴(yán)重的毒副作用，降低了療效，并且有可能導(dǎo)致藥物耐受。從規(guī)避這些缺點(diǎn)的角度出發(fā)，近年來開發(fā)的納米技術(shù)可以結(jié)合化療藥物，使抗腫瘤藥物選擇性的作用于腫瘤細(xì)胞，控制藥物釋放，延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，減少全身毒副作用；并且，高靶向性藥物、控釋藥物治療可以定位于原始腫瘤和轉(zhuǎn)移灶，在腫瘤部位高度聚集，有選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤治療效果，降低全身毒副作用。其中，靶向分為被動靶向和主動靶向，都可以使藥物遞送至腫瘤區(qū)域。而主動靶向是基于抗原抗體結(jié)合主動靶向腫瘤細(xì)胞，可以增加藥物在腫瘤部位的濃度，減少在全身健康組織器官的累積，從而增加治療效果。由此，結(jié)合光熱治療和主動靶向的納米化療技術(shù)將極大的改善腫瘤治療效果。納米診斷治療進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展納米藥物進(jìn)行先進(jìn)的診斷治療，可以控釋診斷治療物質(zhì)，提高診斷治療的療效，減少毒副作用。診斷治療納米粒子種類繁多，但是有很多的局限性，包括非特異性積累，循環(huán)時間不足，體內(nèi)分布不佳，較差的生物降解作用，毒性等等。理想的診斷治療納米粒子不僅能夠在病變組織選擇性地快速累積，實(shí)現(xiàn)多模態(tài)顯像，提高有效的治療，并且安全無毒，無免疫原性，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。普魯士藍(lán)納米粒子(prussianbluenanoparticles，pbnps)是美國食品藥品監(jiān)督管理局承認(rèn)的一種經(jīng)典的用于臨床放射線暴露治療的藥物。近年來pbnps因?yàn)槠渚哂懈邔?dǎo)電性，杰出的穩(wěn)定性，良好的生物相容性，粒徑大小可控，表面易活化等優(yōu)點(diǎn)，引起了很多研究者的關(guān)注。并且，pbnps由于其良好的光熱轉(zhuǎn)化效率，可作為光熱物質(zhì)應(yīng)用于光熱治療。然而，pbnps仍和理想的診斷治療納米粒子有一定差距，因?yàn)槟壳把芯康幕谄蒸斒克{(lán)的納米物質(zhì)都是裸露的，沒有包裹或表面修飾的，隨時間延長易于被身體清除。并且，這些大多數(shù)基于普魯士藍(lán)的納米復(fù)合物因?yàn)闆]有攜帶藥物而無法實(shí)現(xiàn)結(jié)合光熱治療和化療的綜合治療作用。盡管個別研究設(shè)計普魯士藍(lán)納米物質(zhì)可以裝載藥物，但是如何使普魯士藍(lán)的納米物質(zhì)具有主動靶向功能，使得普魯士藍(lán)和藥物準(zhǔn)確地到達(dá)腫瘤區(qū)域，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，仍是研究的熱點(diǎn)?；谝陨系哪康模绻梢栽O(shè)計一種可以實(shí)現(xiàn)光聲/磁共振多模態(tài)顯像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)影像介導(dǎo)的治療，合成的靶向納米復(fù)合物可以吸收近紅外光能量，轉(zhuǎn)化為熱量，提高腫瘤局部的溫度，結(jié)合化療藥物，即可以實(shí)現(xiàn)綜合治療腫瘤，提高腫瘤治療療效。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可實(shí)現(xiàn)光聲/磁共振多模態(tài)顯像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)影像介導(dǎo)的治療，綜合治療腫瘤，提高腫瘤治療療效的載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物及其制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物，包括其內(nèi)部包裹有普魯士藍(lán)納米粒子的peg化葉酸靶向乳酸/羥基乙酸共聚物外殼，peg化葉酸靶向乳酸/羥基乙酸共聚物外殼上鑲嵌有紫杉醇。多功能納米復(fù)合物由多種納米物質(zhì)組成，已被應(yīng)用于疾病的診斷和治療。這些納米復(fù)合物的構(gòu)成成分中首先有可用于成像的生物醫(yī)學(xué)材料，如有機(jī)染料、量子點(diǎn)、磁共振造影劑、ct造影劑等等，其次包括診斷物質(zhì)，如抗腫瘤藥物，dna、sirna等等，同時還有載體和一些表面修飾一起構(gòu)成。其中，生物醫(yī)學(xué)材料如果要安全的遞送至靶向組織，必須和生理環(huán)境兼容，很多生物醫(yī)學(xué)材料是疏水性的，在體內(nèi)易被免疫系統(tǒng)清除，不能很好的發(fā)揮作用。因此，選擇一種合適的載體以便其可以和生理環(huán)境兼容是非常重要的。本發(fā)明技術(shù)方案的載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物，peg為聚乙二醇的縮寫，peg化葉酸靶向乳酸/羥基乙酸共聚物縮寫為plga-peg-fa，將plga-peg-fa內(nèi)部包裹普魯士藍(lán)納米粒子，簡稱pbnps，plga-peg-fa的外殼上鑲嵌紫杉醇，即ptx，形成載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物，簡稱plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物，可以實(shí)現(xiàn)光聲/磁共振多模態(tài)顯像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)影像介導(dǎo)的治療。合成的靶向納米復(fù)合物可以吸收近紅外光能量，轉(zhuǎn)化為熱量，提高腫瘤局部的溫度，結(jié)合化療藥物，實(shí)現(xiàn)綜合治療腫瘤，提高腫瘤治療療效。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的納米復(fù)合物可以通過血管內(nèi)皮間隙，成功地到達(dá)靶向腫瘤區(qū)域，具有良好的光熱轉(zhuǎn)化能力，隨著載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的濃度增加或激光能量的增加，納米復(fù)合物的光熱轉(zhuǎn)化效能增高，在激光開關(guān)四個周期的情況下，溫度上升和下降穩(wěn)定，展示了良好的光熱轉(zhuǎn)化特性和光熱穩(wěn)定性，可以作為良好的光熱物質(zhì)；可實(shí)現(xiàn)藥物控緩釋的高載藥量多功能藥物遞送系統(tǒng)。進(jìn)一步，所述的peg化葉酸靶向乳酸/羥基乙酸共聚物外殼為聚乳酸羥基乙酸plga上通過聚乙二醇peg連接有葉酸fa。進(jìn)一步，其外形呈球形；所述的粒徑236.6±55.04nm；電位為-24.44±1.7mv。進(jìn)一步，所述的紫杉醇的包封率為77.82％，載藥量為7.22％。進(jìn)一步，在500～900nm波長范圍存在一個吸收波峰。進(jìn)一步，在1756.23cm-1、2086cm-1均存在吸收峰，在2927cm-1存在特征峰。進(jìn)一步，其激光輻照的半衰期為12h。以上均為本發(fā)明載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的性質(zhì)及確認(rèn)。本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的制備方法，包括普魯士藍(lán)納米粒子的制備和納米復(fù)合物的制備步驟，其中，納米復(fù)合物的制備步驟如下：(1)稱取5mg紫杉醇和50mgpeg化葉酸靶向乳酸/羥基乙酸共聚物放入燒杯中；(2)向燒杯中加入2ml二氯甲烷，密封杯口，振蕩器振蕩使其溶解，得a溶液；(3)將200μl、100mg/ml的普魯士藍(lán)納米粒子和100μl4％的聚乙烯醇混合，將混合液逐滴加入至a溶液中，冰浴下聲振2分鐘，呈現(xiàn)藍(lán)色初乳液；(4)倒入5ml4％聚乙烯醇溶液中，冰浴條件下再次聲振2分鐘，得到淡藍(lán)色復(fù)乳液；(5)機(jī)械攪拌2小時至二氯甲烷揮發(fā)；(6)以去離子水多次洗滌、離心后收集，得微球；(7)將微球樣品放入4℃冰箱中保存，得載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物。本發(fā)明載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的制備方法，以peg化連接了葉酸(folicacid，fa)的plga作為成膜材料，采用雙乳化法，制備裝載普魯士藍(lán)納米粒子(prussianbluenanoparticles，pbnps)和紫杉醇(paclitaxel，ptx)的plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物。對其復(fù)合物的粒徑、電位、表面形態(tài)等進(jìn)行檢測；用紫外-可見分光光度法、傅里葉紅外光譜儀、激光共聚焦顯微鏡檢測其紫外吸收光譜、紅外光譜和各組分結(jié)構(gòu)特征；采用0.647w/cm2,808nm的激光輻照檢測其體外光熱特性；納米復(fù)合物中紫杉醇的包封率及載藥量用高效液相色譜法檢測。成功制備出球形、形態(tài)規(guī)則，大小均勻，性質(zhì)穩(wěn)定的plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物。該納米復(fù)合物具有良好的光學(xué)吸收性能和光熱轉(zhuǎn)化特性，載藥量較高，在體外對mba-md-231乳腺癌細(xì)胞有良好的靶向能力，聯(lián)合激光輻照，在體外具有良好的聯(lián)合化療和光熱治療腫瘤細(xì)胞的能力。進(jìn)一步，所述的普魯士藍(lán)納米粒子的制備方法為：a、將0.5mmol98mg檸檬酸加入到20ml1.0mmol/lfecl3水溶液中，60℃攪拌，得溶液a；b、然后，將20ml包含0.5mmol檸檬酸的1.0mm亞鐵氰化鉀水溶液逐滴加入a溶液中呈現(xiàn)為清澈的藍(lán)色溶液，60℃攪拌1min；c、冷卻至室溫，室溫下再攪拌30min，得分散液；d、將40ml的丙酮加入至分散液，28000rpm離心1h，形成普魯士藍(lán)納米粒子沉淀；e、純化：普魯士藍(lán)納米粒子沉淀用20ml蒸餾水聲波降解法溶解，用20ml丙酮分離和離心；f、重復(fù)多次純化過程；g、最后，將純化后的普魯士藍(lán)納米粒子沉淀溶于雙蒸水中，置于14000mwco透析袋中，再將透析袋置于雙蒸水中透析24h，得普魯士藍(lán)納米粒子；h、將得到的普魯士藍(lán)納米粒子放入4℃冰箱中保存。本發(fā)明載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的制備方法，以peg化連接了葉酸(folicacid，fa)的plga作為成膜材料，采用雙乳化法，制備裝載普魯士藍(lán)納米粒子(prussianbluenanoparticles，pbnps)和紫杉醇(paclitaxel，ptx)的plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物。對其復(fù)合物的粒徑、電位、表面形態(tài)等進(jìn)行檢測；用紫外-可見分光光度法、傅里葉紅外光譜儀、激光共聚焦顯微鏡檢測其紫外吸收光譜、紅外光譜和各組分結(jié)構(gòu)特征；采用0.647w/cm2,808nm的激光輻照檢測其體外光熱特性；納米復(fù)合物中紫杉醇的包封率及載藥量用高效液相色譜法檢測。成功制備出球形、形態(tài)規(guī)則，大小均勻，性質(zhì)穩(wěn)定的plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物。該納米復(fù)合物具有良好的光學(xué)吸收性能和光熱轉(zhuǎn)化特性，載藥量較高，在體外對mba-md-231乳腺癌細(xì)胞有良好的靶向能力，聯(lián)合激光輻照，在體外具有良好的聯(lián)合化療和光熱治療腫瘤細(xì)胞的能力。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例中普魯士藍(lán)納米粒子的透射電鏡圖；圖2為普魯士藍(lán)納米粒子掃描電鏡圖；圖3是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的透射電鏡圖；圖4是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的掃描電鏡圖；圖5是malvern激光粒徑儀檢測plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物粒徑圖；圖6是malvern激光粒徑儀檢測plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的電位分布圖；圖7是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物和pbnps的紫外分光光度圖；圖8是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物、pbnps和plga-ptx-peg-fa的傅里葉紅外光譜圖；圖9是plga-peg-fa的核磁共振氫譜；圖10是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物在有無激光輻照下的紫杉醇體外緩釋曲線；圖11是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物體外靶向mda-mb-231細(xì)胞放大×600倍；圖12是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物對mda-mb-231移植瘤的體內(nèi)靶向效果，向組和非靶向組(腫瘤用圓圈圈出)；圖13是各組織離體熒光成像圖；圖14是plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物+激光輻照組和對照組荷瘤裸鼠腫瘤部位的熱紅外成像圖；圖15是各處理組裸鼠的相對腫瘤體積趨勢圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的制備方法，具體步驟如下：一、載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的制備1、普魯士藍(lán)納米粒子的制備a、將0.5mmol檸檬酸(98mg)加入到20mlfecl3(1.0mmol/l)水溶液中，60℃攪拌，得溶液a；b、然后，將20ml包含等量0.5mmol檸檬酸的亞鐵氰化鉀k4[fe(cn)6](1.0mm)水溶液逐滴加入上述溶液a溶液，清澈的藍(lán)色溶液呈現(xiàn)，60℃攪拌1分鐘；c、溶液冷卻至室溫，室溫下再攪拌30分鐘，得分散液；d、同等體積40ml的丙酮加入分散液，28000rpm離心1小時，形成普魯士藍(lán)納米粒子沉淀；e、普魯士藍(lán)納米粒子沉淀再用20ml蒸餾水聲波降解法溶解，用同等體積20ml丙酮分離和離心；f、純化過程重復(fù)多次，五次～10次；g、最后，普魯士藍(lán)納米粒子沉淀溶于雙蒸水，置于14000mwco透析袋中，將透氣袋置于雙蒸水中透析24h，以便去除多余的檸檬酸鹽和其他小粒子，然后將透析后的普魯士藍(lán)納米粒子(pbnps)放入4℃冰箱中保存。2、載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg-fa)的制備利用雙乳化法，制備載紫杉醇靶向納米復(fù)合物。具體步驟如下：(1)稱取5mg紫杉醇和50mgpeg化葉酸靶向乳酸/羥基乙酸共聚物(plga-peg-fa,50：50)的plga-peg-fa放入燒杯中；(2)向燒杯中加入2ml二氯甲烷(ch2cl2)，用保鮮膜封住杯口，振蕩器振蕩使高分子材料和紫杉醇完全溶解；(3)將200μl普魯士藍(lán)納米粒子pbnps(100mg/ml)和100μl4％聚乙烯醇pva的混合液逐滴加入上述溶液中，冰浴條件下聲振2分鐘，功率130w*80％，呈現(xiàn)藍(lán)色初乳液；(4)迅速倒入聚乙烯醇5mlpva溶液(4％)中，冰浴條件下再次充分聲振2分鐘，功率130w*40％，得到淡藍(lán)色復(fù)乳液；(5)機(jī)械攪拌2小時至ch2cl2充分揮發(fā)；(6)以去離子水多次洗滌、離心后收集微球，得載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物；(7)以上所制備樣品放入4℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)對照組1：采用相同的方法制備，區(qū)別在于：不加普魯士藍(lán)(步驟(3)中不加普魯士藍(lán)納米粒子)的plga-ptx-peg-fa納米粒；實(shí)驗(yàn)對照組2：采用相同的方法制備，區(qū)別在于：不加紫杉醇(步驟(1)不加紫杉醇)的plga-pb-peg-fa納米粒；非靶向組：采用相同的方法制備，區(qū)別在于：步驟1中用不連葉酸的plga-peg。進(jìn)行細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)及活體熒光實(shí)驗(yàn)時，還需在步驟1中加入熒光染料，細(xì)胞膜紅色熒光探針dii或細(xì)胞膜綠色熒光探針dir制備載dii或dir的plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物，制備和儲存過程中注意避光。二、載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg-fa)的一般性質(zhì)檢測、光熱特性、紫杉醇的包封率及載藥量、體外緩釋實(shí)驗(yàn)。1、普魯士藍(lán)納米粒子及載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物)基本性質(zhì)：(1)采用透射電鏡和掃描電鏡觀察普魯士藍(lán)納米粒子pbnps和plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；(2)malvern激光測徑儀及表面電位儀測量plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物粒徑大小、分布及表面電位；(3)采用紫外-可見分光光度法檢測plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物和普魯士藍(lán)納米粒子的吸收光譜；(4)采用傅里葉紅外光譜儀檢測plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物、普魯士藍(lán)納米粒子和plga-ptx-peg-fa的紅外光譜；(5)采用激光共聚焦顯微鏡檢測plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的各個組分。5.0ml1.12mg/ml檸檬酸鹽保護(hù)的普魯士藍(lán)納米粒子加入到0.55mg(0.8μmoles)5-(aminoacetamido)fluorescein和23μg(120nmols)n-(3-dimethylaminopropyl)-n-ethylcarbodiimidehydrochloride。反應(yīng)混合物攪拌過夜，然后用3000mwco膜透析一周，去除未反應(yīng)的染料。用連接染料的pbnps和連接dii的plga-ptx-peg-fa制作plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物。共聚焦顯微鏡以不同的發(fā)射波長檢測plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的各個組分的熒光。(6)采用1h-nmr確認(rèn)plga-peg-fa的結(jié)構(gòu)。檢測的結(jié)果為：(1)如圖1、圖2所示，制得的普魯士藍(lán)納米粒子，透射電鏡和掃描電鏡顯示為立方體形狀，粒徑約為40-50nm。如圖3、圖4所示，光鏡及掃描電鏡下觀察，plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物呈球形，表面光滑，大小均一，分散性好。(2)如圖5、圖6所示，malvern激光粒徑儀檢測出plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物粒徑為(236.6±55.04)nm，表面電位為(-24.44±1.7)mv。(3)如圖7所示，紫外-可見分光光度計檢測出在plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物和pbnps在500～900nm波長范圍都出現(xiàn)一個吸收波峰，大約位于702nm附近。(4)如圖8所示，傅里葉紅外光譜圖結(jié)果顯示，plga-ptx-peg-fa和pbnps的吸收峰位于1756.23cm-1and2086cm-1，而plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物同時具有上述兩個特征峰。并且，plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物出現(xiàn)了ch2的位于2927cm-1的特征峰。(5)激光共聚焦顯微鏡顯示，pbnps激發(fā)后為綠色熒光，plga-ptx-peg-fa為紅色熒光，而plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物為橙黃色熒光。(6)如圖9所示，采用1h-nmr確認(rèn)plga-peg-fa的結(jié)構(gòu)，化學(xué)位移值為1.0和4.9ppm峰分別屬于plga上-ch3和-ch-的氫質(zhì)子，即峰1和峰4；化學(xué)位移值為的3.4ppm峰屬于peg上的-ch2-氫質(zhì)子，即峰2；化學(xué)位移值為4.1ppm的峰屬于葉酸上的芳香胺氫質(zhì)子，即峰3?；瘜W(xué)位移值為6.5和6.8ppm的小峰歸屬為葉酸的芳香核質(zhì)子，即峰5和峰6。2、plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物體外光熱特性制備各種濃度的plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物(0.625mg/ml、1.25mg/m、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)、plga-ptx-peg-fa(20mg/ml)。(1)將20mg/mlplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物、plga-ptx-peg-fa和雙蒸水各200ul置于24孔板中，用808nm，輸出功率0.647w/cm2的激光輻照10分鐘。(2)將上述制得的不同濃度的plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物各200ul置于24孔板中，用808nm，輸出功率0.647w/cm2的激光輻照10分鐘。(3)將20mg/mlplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物各200ul置于24孔板中，分別輸出功率為0.328w/cm2,0.647w/cm2,1.218w/cm2，808nm的激光輻照10分鐘。(4)將5mg/mlplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物用808nm，輸出功率0.647w/cm2的激光輻照50s，關(guān)閉380s為一周期，輻照四周期。上述處理導(dǎo)致的溫度變化，用紅外成像儀檢測，每10s記錄一次溫度。檢測的結(jié)果為：(1)經(jīng)激光輻照后，plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物溫度上升明顯，起始溫度約為27.5℃，約在100s時，溫度上升至70.2℃，后維持于70.2℃-71.5℃之間，從520s之后，溫度繼續(xù)上升至90.4℃。而雙蒸水組和plga-ptx-peg-fa組溫度由于激光輻照上升至41℃左右，沒有繼續(xù)上升；如表1-1-1所示：表1-1-1不同組別試劑0.647w/cm2激光輻照10分鐘的溫度變化(2)不同濃度的plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物經(jīng)激光輻照后，可見各組均有不同程度的溫度上升，呈現(xiàn)上升溫度和納米復(fù)合物的濃度呈正相關(guān)的趨勢，如表1-1-2所示：表1-1-2不同濃度plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物0.647w/cm2激光輻照10分鐘的溫度變化(3)20mg/mlplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物經(jīng)不同功率激光輻照后，溫度均有不同程度上升，呈現(xiàn)上升溫度和激光功率正相關(guān)的趨勢，如表1-1-3所示：表1-1-320mg/mlplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物分別用0.328,0.647and1.218w/cm2激光輻照10分鐘的溫度變化(4)5mg/mlplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物經(jīng)四周期激光開關(guān)輻照后，可見溫度升高趨勢一致，未見明顯溫度峰值下降，如表1-1-4所示：表1-1-45mg/mlplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物用0.647w/cm2激光輻照50s，關(guān)閉激光380s，四周期的溫度變化時間(s)050430480860910129013401720溫度(℃)24.552.126.755.126.756.026.755.826.53、紫杉醇包封率、載藥量及體外緩釋1)plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物紫杉醇的包封率及載藥量采用高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，hplc)檢測紫杉醇的包封率及載藥量，具體步驟如下：(1)用甲醇溶解紫杉醇粉末，分別配成12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，75μg/ml，90μg/ml，100μg/ml，200μg/ml的溶液；(2)高效液相色譜儀對進(jìn)樣進(jìn)行檢測，結(jié)果繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)取50mgplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物(紫杉醇投入量5mg)溶于1mldmso和2ml二氯甲烷的混合物，充分混勻至微球全部溶解，取0.1ml用0.9mldmso稀釋,用0.22μmpvdf膜過濾后上機(jī)檢測，(色譜條件：檢測波長227nm，流動相為乙腈：水(45:55，v/v)，進(jìn)樣10μl)，按以下公式計算紫杉醇的包封率及載藥量：包封率(％)＝納米復(fù)合物中藥物含量/總藥物投放量×100％；載藥量(％)＝納米復(fù)合物中包封藥物的量/納米復(fù)合物總重量×100％。2)plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物體外緩釋實(shí)驗(yàn)利用透析法檢測plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的體外緩釋特性，并分為激光輻照組和對照組，具體步驟如下：(1)取50mgplga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物沉淀溶于0.5ml去離子水中，激光輻照組取0.2ml置于24孔板中，暴露于808nm、輸出功率0.647w/cm2的激光輻照10分鐘，后加入1ml去離子水。對照組取上述納米復(fù)合物溶液0.2ml加入1ml去離子水。(2)將兩組分別裝于透析袋中(截留分子量：8000da)，兩端封口夾密封后，完全浸沒于裝有150ml緩釋介質(zhì)(0.01％tween-80，0.02％疊氮鈉，30％乙醇)的藍(lán)口瓶中。(3)并將藍(lán)口瓶置于恒溫振動器中持續(xù)震蕩(37℃，120rpm)；(4)在上述步驟完成后2h,4h,6h,8h,12h,1d,2d,3d,and4d，分別取出1ml透析液，再補(bǔ)充1ml新鮮的緩釋介質(zhì)；(5)將緩釋樣本存放于-20℃冰箱中，待取樣完成后用hplc法檢測樣本中紫杉醇含量；(6)分別計算不同時間點(diǎn)plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物中紫杉醇的累積釋放百分率(％)，繪制隨時間變化，藥物釋放曲線。檢測的結(jié)果為：plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物中紫杉醇的包封率為77.82％，載藥量為7.22％。如圖10所示，plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物中紫杉醇在體外4d內(nèi)的釋藥時間曲線可以看出，激光輻照組和對照組藥物的半衰期分別為12h和48h，激光的輻照加速了藥物釋放。激光輻照組可見納米復(fù)合物中紫杉醇在第1天發(fā)生突釋，1d后釋藥速度減慢。而對照組藥物緩慢釋放，呈逐漸上升態(tài)勢。第4d時激光輻照組和對照組的藥物累積釋放量分別為79.26％和65.73％。三、載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物的體外尋靶和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)1、細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn)人乳腺癌細(xì)胞株mda-mb-231。將細(xì)胞置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為含10％胎牛血清和0.1mg/ml鏈霉素，100u/ml青霉素的dmem培養(yǎng)液。常規(guī)換液，每隔1天用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期狀態(tài)的細(xì)胞，以1×104/皿的密度接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁呈生長狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為3組：靶向組(plga-pb-ptx-peg-fa)、非靶向組(plga-pb-ptx-peg)、受體封閉組；每組各3個培養(yǎng)皿。每組加入等量的經(jīng)dii標(biāo)記的相應(yīng)試劑，其中受體封閉組預(yù)先加入適量葉酸抗體，共孵育1h后，再加入靶向納米復(fù)合物。混勻后放入co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min后取出培養(yǎng)皿，pbs緩沖液反復(fù)沖洗，將游離納米復(fù)合物沖洗掉后向每個培養(yǎng)皿中加入4％多聚甲醛1.5ml，孵育10分鐘。棄去多聚甲醛，pbs沖洗三遍。加入dio40ul/皿，孵育10分鐘。棄去dio，pbs沖洗三遍。加入dapi40ul/皿，孵育10分鐘。棄去dio，pbs沖洗三遍。滴入少許pbs保持皿內(nèi)干燥，在clsm下觀察各組納米復(fù)合物與細(xì)胞的結(jié)合情況。檢測結(jié)果為：由激光共聚焦顯微鏡觀察到，細(xì)胞膜紅色熒光探針dii標(biāo)記的納米復(fù)合物呈紅色熒光，細(xì)胞膜綠色熒光探針dir可將乳腺癌細(xì)胞膜標(biāo)記為綠色熒光，dapi可將乳腺癌細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色熒光。如圖11所示，可觀察到，mda-mb-231+靶向組中，較多的紅色熒光(b處)納米復(fù)合物緊密結(jié)合在mda-mb-231細(xì)胞膜周圍，說明該靶向納米復(fù)合物具有獨(dú)特主動靶向乳腺癌細(xì)胞的能力。而mda-mb-231+非靶向組、受體封閉組這兩個處理組的細(xì)胞周圍幾乎觀察不到紅色的熒光納米復(fù)合物。2、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)將處于對數(shù)生長期狀態(tài)的mda-mb-231細(xì)胞種于96孔板中，每孔細(xì)胞密度為8×103個，置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)組為有細(xì)胞且加入試劑組、陰性對照組為有細(xì)胞但不加試劑組、空白對照組為沒有細(xì)胞也不加試劑組；每組分別設(shè)置6個平行復(fù)孔。分組如下：plga-pb-ptx-peg-fa組、plga-pb-peg-fa組、游離ptx組、plga-pb-ptx-peg-fa+nir組，plga-pb-peg-fa+nir組，nir組。選擇每孔分別加入上述混合培養(yǎng)基的各種試劑(10mg/ml,100μl/孔，紫杉醇的濃度約為0.7mg/ml)，nir組不加入任何試劑，孵育2h。后取出96孔板，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，pbs沖洗后加入50μl/孔新鮮培養(yǎng)基。其中plga-pb-ptx-peg-fa+nir組，plga-pb-peg-fa+nir組及nir組每孔用輸出功率0.693w/cm2，808nm激光輻照45s。最后，每孔補(bǔ)充足夠的新鮮培養(yǎng)基，放入孵箱中孵育24h。24h后，每孔各加入10μlcck8，孵育1h后，用酶標(biāo)儀于450nm出檢測各孔吸光值(od值)。用以下公式計算實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活性率：細(xì)胞活性率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組od值-空白對照組)/(對照組平均od值-空白對照組od值)×100％。檢測結(jié)果為：cck8法測得各處理組的細(xì)胞活性率(％)如表1-2-1所示。表1-2-1顯示了各組在相同紫杉醇濃度(c[ptx]≈0.7mg/ml)條件下，與mda-mb-231細(xì)胞孵育后對其活性的影響。結(jié)果顯示，靶向納米復(fù)合物聯(lián)合激光輻照組(plga-pb-ptx-peg-fa+nir)對細(xì)胞的毒性作用最強(qiáng)，為22.57±4.47％，與其他各組相比p＜0.05，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。與單純紫杉醇組比較(47.52±3.47％)，靶向納米粒不帶藥物組聯(lián)合激光組(plga-pb-peg-fa+nir)的細(xì)胞活性偏低(32.00±3.73％)，靶向納米復(fù)合物組(plga-pb-ptx-peg-fa)的細(xì)胞活性偏高(60.01±3.85％)。而plga-pb-peg-fa組和nir組的細(xì)胞活性高于90％，這表明pbnps和高分子聚合物本身的毒性非常低，幾乎可以忽略，并且單獨(dú)激光輻照對細(xì)胞活性沒有影響，說明試劑組聯(lián)合激光輻照組導(dǎo)致的細(xì)胞活性降低，是由激光輻照后試劑產(chǎn)生的光熱作用導(dǎo)致的細(xì)胞活性降低。表1-2-1不同處理組對mda-mb-231細(xì)胞活性的影響綜上：plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物具有良好的靶向乳腺癌mda-mb-231細(xì)胞的能力，為后續(xù)體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)和進(jìn)一步靶向腫瘤成像和治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)；plga-pb-ptx-peg-fa靶向載藥納米復(fù)合物輔助激光輻照后，可使化療作用和光熱作用相結(jié)合，使毒性作用發(fā)揮到最大，細(xì)胞存活率最低。形成的納米復(fù)合物具有良好的生物安全性，具有化療作用，可殺傷腫瘤細(xì)胞，可聯(lián)合光熱作用，結(jié)合靶向作用，可靶向腫瘤部位，減少全身化療毒副作用，最大程度的殺傷腫瘤細(xì)胞，為后續(xù)體內(nèi)綜合治療打下了堅實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。四、載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物體內(nèi)尋靶實(shí)驗(yàn)選取呈對數(shù)生長期的mda-mb-231細(xì)胞，以0.25％胰酶消化，然后以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，離心后以無菌pbs液稀釋成1×107/ml數(shù)量級，用計數(shù)板計數(shù)。用碘伏局部消毒裸鼠背部皮膚，然后由助手輕輕提起裸鼠臀背部皮膚，用1ml注射器在皮下注射0.15ml，形成皮丘。接種完后重新放回籠內(nèi)飼養(yǎng)，每1-2天觀察一次。選取10只mda-mb-231乳腺癌移植瘤模型裸鼠進(jìn)行小動物活體熒光成像，隨機(jī)分為兩組：靶向納米復(fù)合物(dir/plga-pb-ptx-peg-fa)組和非靶向納米復(fù)合物(dir/plga-pb-ptx-peg)組，每組5只。顯像前腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。麻醉后行注射前小動物活體熒光成像，后經(jīng)尾靜脈緩慢注射靶向納米復(fù)合物和非靶向納米復(fù)合物，每只注射用量為0.2ml(20mg/ml)，注射成功后分別于1h、2h、4h、6h及24h利用小動物活體熒光成像系統(tǒng)采集圖像。背景熒光被濾除以便更好的觀察效果。對比觀察兩組組腫瘤局部的熒光強(qiáng)度，利用livingimage軟件系統(tǒng)對圖像進(jìn)行定量分析。兩組腫瘤區(qū)體內(nèi)靶向效率用總輻射效率×107(totalradiantefficiency×107)表示。待24h成像完畢后，處死裸鼠，解剖腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、腦，行離體熒光成像，并計算各部位離體熒光強(qiáng)度。檢測結(jié)果為：如圖12所示，小動物活體熒光結(jié)果顯示注射前兩組均未見熒光顯示，在尾靜脈注射靶向納米復(fù)合物后，靶向組可見腫瘤內(nèi)部、脾、腦、脊柱有強(qiáng)烈的紅色熒光(劃圈處)，標(biāo)志著dir標(biāo)記的靶向納米復(fù)合物在此聚集，在注射后1h熒光最強(qiáng)。隨時間延長，腫瘤、脊柱、腦部的熒光強(qiáng)度逐漸減低，而肝區(qū)的熒光強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)。在注射靶向納米復(fù)合物24h時，腫瘤區(qū)域、脾和肝區(qū)仍可見少量熒光顯示。與之相反，尾靜脈注射非靶向納米復(fù)合物后，非靶向組腫瘤內(nèi)部沒有熒光顯示，而肝區(qū)見熒光顯示，在24h后消失。livingimage軟件系統(tǒng)分析靶向組和非靶向組腫瘤區(qū)域熒光強(qiáng)度如表2-1-1，靶向組腫瘤區(qū)域熒光強(qiáng)度明顯高于非靶向組，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。并且，靶向組腫瘤區(qū)域熒光在尾靜脈注射靶向納米復(fù)合物1h后最強(qiáng)，后逐漸降低，但在24h腫瘤區(qū)仍可見熒光顯示，并明顯高于注射前腫瘤區(qū)域熒光強(qiáng)度。如圖13所示，離體活體熒光可見兩組的肝、脾、肺均有熒光顯示，但只有靶向組的腫瘤有熒光顯示，非靶向組的腫瘤沒有熒光聚集(a)。離體各部位熒光強(qiáng)度如表2-1-2，靶向組離體腫瘤和脾組織熒光強(qiáng)度明顯高于非靶向組，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表2-1-1靶向組和非靶向組的在體腫瘤部位熒光強(qiáng)度(×107)時間點(diǎn)靶向組非靶向組pre2.22±0.022.30±0.061h395.95±9.2623.43±12.01*2h264.00±41.1523.86±11.53*4h209.30±48.5124.23±11.14*6h174.60±37.1924.65±11.24*24h147.30±28.2826.43±11.17*注：與靶向組相比，*p<0.05。表2-1-2靶向組和非靶向組各組織離體熒光強(qiáng)度(×107)注：與靶向組相比，*p<0.05。綜上：實(shí)驗(yàn)經(jīng)尾靜脈注射dir標(biāo)記的靶向和非靶向納米復(fù)合物的方法，經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，于注射前和注射后1h、2h、4h、6h及24h利用小動物活體熒光成像系統(tǒng)觀察帶熒光探針的納米復(fù)合物在裸鼠腫瘤內(nèi)及其在體內(nèi)的生物學(xué)分布情況。結(jié)果顯示，尾靜脈注射納米復(fù)合物1h后，靶向納米復(fù)合物在腫瘤組織的分布明顯高于非靶向納米復(fù)合物組，這說明plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物良好的體內(nèi)主動靶向乳腺癌細(xì)胞的特性。在尾靜脈注射納米復(fù)合物24h后，靶向組腫瘤區(qū)仍可見熒光顯示，說明plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物因?yàn)槠浼{米粒徑，具有主動靶向和epr(enhancedpermeabilityandretentioneffect)效應(yīng)導(dǎo)致的被動靶向作用。尾靜脈注射plga-pb-ptx-peg非靶向納米粒后，非靶向納米粒因缺乏葉酸靶向集團(tuán)，未來得及到達(dá)腫瘤區(qū)域，大部分就被肝臟代謝，故腫瘤區(qū)域未見熒光聚集，熒光顯影主要聚集在肝區(qū)。量化熒光強(qiáng)度指標(biāo)顯示，靶向組腫瘤熒光強(qiáng)度明顯高于非靶向組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，證實(shí)了plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物良好的體內(nèi)靶向能力。五、載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物增強(qiáng)光聲/磁共振多模態(tài)顯像實(shí)驗(yàn)1、體外光聲顯像將plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物及plga-ptx-peg-fa配制為不同濃度的溶液(2.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml)，并以雙蒸水作為對照組進(jìn)行光聲顯像。將各組試劑加入2.5％凝膠模型中，使用光聲成像系統(tǒng)，采集未載普魯士藍(lán)的納米粒(plga-ptx-peg-fa)、載普魯士藍(lán)納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg-fa)和雙蒸水的光聲圖像。應(yīng)用光聲系統(tǒng)自帶軟件測量各樣品的光聲值。檢測結(jié)果為：體外光聲顯影結(jié)果顯示，與不含pbnps的納米粒(plga-ptx-peg-fa)及雙蒸水無光聲顯像相比，plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的光聲顯像明顯，且隨著plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物濃度的增加，光聲顯像逐漸增強(qiáng)，光聲值也逐漸增大，如表2-2-1。表2-2-1各濃度plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物、plga-ptx-fa-peg和雙蒸水的體外光聲值(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,n＝3)2、體外磁共振顯像將plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物及plga-ptx-peg-fa配制為不同濃度的溶液(2.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml)，并以雙蒸水作為對照組進(jìn)行磁共振顯像。分別放入直徑1cm的ep管內(nèi)，置入盛水容器中，應(yīng)用荷蘭philipsachieva3.0t磁共振掃描儀采集t1*wi圖像，采用頭部線圈，掃描參數(shù)為：重復(fù)時間(tr)494ms，回波時間(te)10ms，翻轉(zhuǎn)角(flipangle)90°，層厚1.0mm，視野(fov)190mm。每組樣品重復(fù)三次。應(yīng)用系統(tǒng)軟件測定各孔感興趣區(qū)(regionofinterest，roi)信號強(qiáng)度(signalintensity，sinps)，以水的信號強(qiáng)度(siwater)作為對比，利用以下公式計算各樣品的信號增強(qiáng)百分比(percentageofsignalintensityenhancement,psie)。psie＝(sinps–siwater)/siwater×100％。檢測結(jié)果為：t1*wi顯像中，與不含pbnps的納米復(fù)合物(plga-ptx-peg-fa)及雙蒸水無t1增強(qiáng)信號相比，plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物增強(qiáng)mrit1顯像明顯。且隨著plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物濃度的增加，其信號強(qiáng)度增強(qiáng)率(psie)逐漸增加，與plga-ptx-peg-fa組相比，p＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，如表2-2-2。說明本實(shí)驗(yàn)所制備的納米復(fù)合物具有正性強(qiáng)化效果，plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物濃度越高，其正性強(qiáng)化效應(yīng)越明顯。表2-2-2各濃度plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物、plga-ptx-fa-peg和雙蒸水的信號強(qiáng)度增強(qiáng)率(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,n＝3)注：與plga-pb-ptx-peg-fa相比，*p<0.05。3、增強(qiáng)體內(nèi)光聲成像選取15只構(gòu)建成功的mda-mb-231乳腺癌移植瘤裸鼠模型進(jìn)行體內(nèi)光聲成像，隨機(jī)分為三組：靶向納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg-fa)組、非靶向納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg)組和生理鹽水組(nsgroup)，每組5只。顯像前腹腔注射1％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。麻醉后行注射前體內(nèi)光聲成像，后經(jīng)尾靜脈分別緩慢注射靶向納米復(fù)合物、非靶向納米復(fù)合物及生理鹽水，每只注射用量為0.2ml(20mg/ml)，注射成功后分別于1h、2h、4h、6h及24h利用光聲成像儀采集圖像。保持增強(qiáng)前后掃描切面一致，對比觀察三組組腫瘤局部的光聲信號強(qiáng)度，選擇腫瘤roi，利用儀器自帶軟件將注射試劑前后的圖像進(jìn)行光聲信號定量分析。利用以下公式計算各樣品的光聲信號比率(theratioofpavalue,100％)，并繪制出隨時間變化的光聲信號比率曲線圖。theratioofpavalue＝papose/papre×100％。檢測結(jié)果為：利用光聲成像系統(tǒng)，實(shí)時動態(tài)觀察裸鼠腫瘤顯影情況。通過注射對比劑前后各個時間點(diǎn)對比，結(jié)果顯示，靶向組在注射靶向納米復(fù)合物后，腫瘤區(qū)域光聲信號在1h最明顯，然后逐漸下降，但在24h仍有明顯的光聲信號。非靶向組在注射非靶向納米復(fù)合物后1h-6h，光聲信號未見明顯增強(qiáng)，注射后24h后見微弱光聲信號。生理鹽水組于造影前后光聲圖像未見明顯變化。三種處理組注射各組試劑前后光聲信號比率比較，可見非靶向組光聲信號比率略有增強(qiáng)，但與生理鹽水組相比，p>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而靶向組增強(qiáng)非常明顯，且靶向組光聲信號比率與其他兩組比較，p＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，如表2-2-3。表2-2-3各組腫瘤組織的光聲比值(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,n＝5)注：與生理鹽水組相比,#p<0.05；與靶向組相比，▲p<0.05。4、增強(qiáng)體內(nèi)磁共振成像選取15只構(gòu)建成功的mda-mb-231乳腺癌移植瘤裸鼠模型進(jìn)行體內(nèi)光聲成像，隨機(jī)分為三組：靶向納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg-fa)組、非靶向納米復(fù)合物(plga-pb-ptx-peg)組和生理鹽水組(nsgroup)，每組5只。腹腔注射1％戊巴比妥鈉麻醉后，利用philips3.0t超導(dǎo)型磁共振儀和小動物線圈進(jìn)行先行注射前俯臥位平掃，后經(jīng)尾靜脈分別緩慢注射靶向納米復(fù)合物、非靶向納米復(fù)合物及生理鹽水，每只注射用量為0.2ml(20mg/ml)，注射成功后分別于1h、2h、4h、6h及24h進(jìn)行增強(qiáng)掃描。掃描前均常規(guī)進(jìn)行自動勻場，應(yīng)用t1wi序列，掃描參數(shù)如下：tr＝3200ms，te＝80ms，層厚＝2mm，fov＝60mm×60mm，nsa＝10。應(yīng)用系統(tǒng)軟件選擇roi，測量各時間點(diǎn)增強(qiáng)前后同一層面裸鼠腫瘤及大腿肌肉感興趣區(qū)的信號強(qiáng)度值(signalintensity,si)situmor及simuscle，計算相對信號強(qiáng)度(relativesignalintensity，sir)及信號強(qiáng)度增強(qiáng)率(percentageofsignalintensityenhancement,psie)：sir＝situmor/simusclepsie＝(sirpost-sirpre)×100％/sirpre選擇roi時應(yīng)盡量在相同部位、相同層面，避開壞死區(qū)及囊變等結(jié)構(gòu)，roi大小保持一致，不同位置感興趣區(qū)測量3次，取平均值。檢測結(jié)果為：對mda-mb-231乳腺癌移植瘤裸鼠模型進(jìn)行mri成像，平掃腫瘤呈較均勻的稍高信號影，與周圍組織分界清晰。生理鹽水組注射前后，腫瘤信號強(qiáng)度無明顯變化。非靶向組plga-pb-ptx-peg和靶向組plga-pb-ptx-peg-fa經(jīng)尾靜脈注射后，隨掃描時間延長，非靶向組腫瘤組織的信號強(qiáng)度在24h時略微有所升高，但腫瘤區(qū)域信號強(qiáng)度增強(qiáng)率與生理鹽水組無統(tǒng)計學(xué)差異，p>0.05。而靶向組腫瘤組織信號強(qiáng)度在1h增強(qiáng)最明顯，后有所降低，但在24h仍可見明顯腫瘤組織增強(qiáng)信號。且靶向組腫瘤區(qū)域信號強(qiáng)度增強(qiáng)率與其他兩組比較，p＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，如表2-2-4。表2-2-4裸鼠mda-mb-231移植瘤尾靜脈注射對比劑前后磁共振信號強(qiáng)度增強(qiáng)率比較注：與生理鹽水組相比,#p<0.05；與靶向組相比，▲p<0.05。本發(fā)明制備的plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物具有體外良好的光聲和mri顯影能力。本發(fā)明也比較了沒有包裹pbnps的納米粒plga-ptx-peg-fa，無法光聲和mri成像，說明pbnps是主要顯影物質(zhì)，也說明本發(fā)明制備的plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物已成功包裹pbnps，且沒有影響其光聲和mri的成像能力。如結(jié)果所示，20mg/ml的plga-pb-ptx-peg-fa納米復(fù)合物的信號強(qiáng)度增強(qiáng)百分率為153.15±0.76％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于plga-ptx-peg-fa組的22.11±0.17％，證實(shí)該納米復(fù)合物可被用來作為mri的造影增強(qiáng)劑。綜上所述，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所制備的plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物可以通過與mda-mb-231細(xì)胞表面葉酸受體的特異性結(jié)合，靶向乳腺癌腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)乳腺癌移植瘤的光聲及磁共振顯像，有潛力成為光聲/磁共振多模態(tài)成像增強(qiáng)劑。該納米復(fù)合物不僅可實(shí)現(xiàn)腫瘤分子顯像，靶向至腫瘤部位后，聯(lián)合激光，可促進(jìn)攜帶的紫杉醇在靶區(qū)釋放，有望實(shí)現(xiàn)影像技術(shù)實(shí)時監(jiān)控下的靶向綜合治療，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷與可視化靶向治療。六、載普魯士藍(lán)靶向納米復(fù)合物綜合治療裸鼠乳腺癌實(shí)驗(yàn)1、聯(lián)合激光輻照腫瘤表面溫度變化待裸鼠mda-mb-231移植瘤長至1.0cm左右，選取35只荷瘤鼠，隨機(jī)分為7組，每組5只。實(shí)驗(yàn)分組為：pbs對照組(control)、單純紫杉醇藥物組(ptx)、不含藥物納米粒組(plga-pb-peg-fa)、靶向納米復(fù)合物組(plga-pb-ptx-peg-fa)、不含藥物納米粒+激光輻照組(plga-pb-peg-fa+nir)、靶向納米復(fù)合物+激光輻照組(plga-pb-ptx-peg-fa+nir)和單純激光輻照組(nir)。單純紫杉醇注射液濃度為1.4mg/ml(與20mg/ml納米復(fù)合物中藥物濃度相當(dāng))，其他試劑組濃度均為20mg/ml，每只裸鼠分別注射0.2ml相應(yīng)試劑。治療方案為：各組給予尾靜脈注射相對應(yīng)試劑，其中根據(jù)第二部分顯像結(jié)果，plga-pb-peg-fa+nir和plga-pb-ptx-peg-fa+nir組在注射試劑后1h左右，用808nm輸出功率0.647w/cm2的激光輻照腫瘤區(qū)域10min。激光輻照組則僅用上述參數(shù)激光輻照腫瘤區(qū)域10min。用紅外成像儀檢測上述處理導(dǎo)致的溫度變化，每10s記錄一次溫度。繪制溫度隨時間變化柱狀圖。(1)分別在治療前及治療后的第3、6、9、12、15、18、21天觀察裸鼠生存狀況，拍照并利用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑及短徑，代入下面公式進(jìn)行計算腫瘤體積(tumorvolume，tv)：tv＝(l×s2)/2其中l(wèi)為測得腫瘤最長徑，s為腫瘤最短徑。根據(jù)腫瘤體積計算相對腫瘤體積(relativetumorvolume,rtv)：rtv＝tv/tv0其中tv為各個時間點(diǎn)的腫瘤體積，tv0為治療前腫瘤體積。根據(jù)所算得的相對腫瘤體積值繪制相對腫瘤生長曲線圖。治療21天后，斷頸處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤塊并稱重。利用下面的公式計算腫瘤抑瘤率(tumorinhibitionrate，tir)。tir＝(1-處理組腫瘤平均質(zhì)量/對照組腫瘤平均質(zhì)量)×100％(2)處死裸鼠后，各組腫瘤解剖后取壞死邊界組織以4％多聚甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋、切片制作后，部分用于he染色，部分用免疫組化pcna法檢測腫瘤細(xì)胞增殖及用tunel法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。解剖plga-pb-ptx-peg-fa+nir組和對照組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎以4％多聚甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋、切片制作后，用于he染色。he染色用低倍鏡(×100倍)觀察。pcna和tunel法以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)著色強(qiáng)度高于背景的棕黃色或棕褐色顆粒為陽性標(biāo)志。用高倍鏡(×400倍)觀察各切片陽性細(xì)胞數(shù)，每張切片隨機(jī)選取5個視野，利用以下公式進(jìn)行計算：pcna：增殖指數(shù)(proliferatingindex,pi)＝陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％。tunel:凋亡指數(shù)(apoptoticindex,ai)＝陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％。檢測結(jié)果為：如圖14所示，尾靜脈注射plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物后1h，激光輻照腫瘤區(qū)域。60s后紅外攝像儀可見腫瘤區(qū)域由藍(lán)紫色變?yōu)橹行募t色(a)向黃色(b)、綠色(c)、藍(lán)色(d)漸變的顏色，提示腫瘤區(qū)域溫度升高，此后腫瘤區(qū)域中心紅色(a)暈圈不斷擴(kuò)大，提示溫度逐漸升高。而激光輻照組，60s后可以見腫瘤區(qū)域變?yōu)榈{(lán)色，提示溫度有少許升高，約為40℃左右，到10min時，腫瘤區(qū)域一直維持淡藍(lán)色暈圈(e)。主要的溫度變化如表3-1所示，尾靜脈注射靶向納米復(fù)合物后用激光輻照10min，腫瘤表面的溫度迅速上升，從34.88±0.75℃上升至52±3.05℃，而腫瘤周圍組織的溫度經(jīng)紅外攝像儀檢測僅為39℃。而激光輻照組(control)在激光輻照10分鐘后，溫度僅升至41±0.14℃,如表3-1。表3-1靶向納米復(fù)合物+激光輻照組和對照組荷瘤裸鼠腫瘤部位的溫度改變(℃，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n＝5)時間(s)plga-pb-ptx-peg-fa+nircontrol034.88±0.7536.00±0.716044.43±5.0640.20±1.0012047.13±5.5340.65±0.0718048.60±5.3140.75±0.2160052.00±3.0541.00±0.142、腫瘤生長曲線及質(zhì)量抑瘤率單純紫杉醇藥物治療組給藥后裸鼠出現(xiàn)一過性倦怠，活動少，進(jìn)食差等現(xiàn)象。其余各組裸鼠無明顯不良反應(yīng)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)論可以看出，plga-pb-ptx-peg-fa+nir組的荷瘤裸鼠的腫瘤在處理后3天結(jié)痂，處理后12天明顯縮小，到處理后第21天，未見明顯增長。而其他各組腫瘤均有不同程度的增長，其中，nir組，plga-pb-peg-fa組和對照組相對腫瘤增長明顯，plga-pb-ptx-peg-fa組裸鼠腫瘤增長較ptx組緩慢，plga-pb-peg-fa+nir組相對腫瘤增長比上述兩組緩慢，腫瘤體積縮小最明顯的為plga-pb-ptx-peg-fa+nir組。各處理組裸鼠mda-mb-231乳腺癌腫瘤相對腫瘤生長曲線如圖15所示，相對腫瘤體積見表3-2，結(jié)果顯示除了plga-pb-ptx-peg-fa+nir組，各處理組裸鼠相對腫瘤體積隨著時間延長均呈逐漸增加的趨勢。對照組、plga-pb-peg-fa和nir組生長曲線最陡直，ptx組其次，plga-pb-ptx-peg-fa組和plga-pb-peg-fa+nir組生長曲線增加較平緩，相對腫瘤體積增加較慢。而plga-pb-ptx-peg-fa+nir組相對腫瘤生長曲線呈逐漸下降的趨勢，相對腫瘤體積明顯縮小。除了nir組，plga-pb-peg-fa組和對照組，其他各處理組兩兩比較p<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。各處理組腫瘤抑瘤率見表3-3，可見plga-pb-ptx-peg-fa+nir組表現(xiàn)出明顯的抑瘤效果，質(zhì)量抑瘤率為98.86％，其他各組抑瘤率依次下降。plga-pb-peg-fa組和nir組和plga-pb-ptx-peg-fa+nir組相比質(zhì)量抑瘤率非常低，幾乎無法抑制腫瘤生長，腫瘤增長明顯。表3-2各處理組裸鼠的相對腫瘤體積(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)注：與plga-pb-ptx-peg-fa+nir相比，*p<0.05；與對照組比較，#p<0.05。表3-3各處理組裸鼠的腫瘤抑制率(100％)組別腫瘤抑瘤率(100％)plga-pb-ptx-peg-fa+nir98.86％plga-pb-peg-fa+nir86.59％plga-pb-ptx-peg-fa74.39％ptx65.85％plga-pb-peg-fa3.25％nir2.44％control0.00％3、腫瘤細(xì)胞增殖情況免疫組化pcna結(jié)果顯示，各組mda-mb-231腫瘤組織內(nèi)均可見到不同數(shù)量棕黃色或褐色pcna陽性細(xì)胞的表達(dá)，計算各組增值指數(shù)(pi)。結(jié)果顯示如表3-4，plga-pb-ptx-peg-fa+nir組的陽性細(xì)胞數(shù)最少，增殖指數(shù)明顯低于其他各組，對照組細(xì)胞增殖指數(shù)最高。除了nir組，plga-pb-peg-fa組和對照組，其他各處理組兩兩比較p<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。4、腫瘤細(xì)胞凋亡情況tunel檢測以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)，凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)征象為細(xì)胞核成棕黃色，染色質(zhì)凝聚、濃縮。染色結(jié)果顯示如表3-4，各處理組的裸鼠腫瘤內(nèi)均可見到不同數(shù)量的陽性細(xì)胞，其中plga-pb-ptx-peg-fa+nir組的凋亡細(xì)胞最多，凋亡指數(shù)為(87.06±3.01)％，除了nir組，plga-pb-peg-fa組和對照組，其他各處理組兩兩比較p<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表3-4各處理組裸鼠腫瘤組織增殖指數(shù)(pi)和凋亡指數(shù)(ai)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,100％)組別pi(100％)ai(100％)plga-pb-ptx-peg-fa+nir17.62±3.27#87.06±3.01#plga-pb-peg-fa+nir29.76±2.35*#66.16±5.91*#plga-pb-ptx-peg-fa48.88±6.74*#48.85±3.98*#ptx60.05±4.44*#37.81±4.45*#plga-pb-peg-fa81.40±2.33*19.91±3.18*nir81.97±5.08*18.36±5.21*control84.79±3.08*17.53±7.49*注：與plga-pb-ptx-peg-fa+nir相比，*p<0.05；與對照組比較，#p<0.05。5、he染色各處理組腫瘤he染色結(jié)果為：plga-pb-ptx-peg-fa+nir組腫瘤he染色可見大量壞死，鏡下呈紅色片狀無結(jié)構(gòu)區(qū)域，其內(nèi)未見腫瘤細(xì)胞。plga-pb-peg-fa+nir組、plga-pb-ptx-peg-fa組、ptx組腫瘤he染色壞死程度依次減輕，對照組、plga-pb-peg-fa和nir組腫瘤區(qū)域細(xì)胞形態(tài)基本正常，細(xì)胞核染色較正常。plga-pb-ptx-peg-fa+nir組的心、肝、脾、肺、腎和對照組對比，he染色未見明顯異常。綜上：實(shí)驗(yàn)在尾靜脈注射靶向納米復(fù)合物后1h，用激光輻照腫瘤區(qū)域10min。腫瘤表面的溫度從34.88±0.75℃上升至52±3.05℃，這一溫度足以“燒死”腫瘤。而腫瘤周圍組織的溫度僅為39℃，說明靶向光熱治療的安全性，對周圍組織沒有損傷。而激光輻照組(control)在激光輻照10分鐘后，溫度僅升至41±0.14℃，這一溫度不能殺死腫瘤細(xì)胞，在后面觀察的21d的結(jié)果也證實(shí)了激光輻照組裸鼠的腫瘤持續(xù)增大，并且也排除這樣一種可能性，即如此低能量的近紅外激光自身產(chǎn)生足夠的熱，進(jìn)一步說明plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物真正靶向到了腫瘤區(qū)域，經(jīng)激光照射后產(chǎn)生了足以殺死腫瘤細(xì)胞的熱量。各實(shí)驗(yàn)組處理措施僅實(shí)施一次，且激光能量僅為0.647w/cm2，說明制備的靶向納米復(fù)合物具有良好的靶向效果和光熱能量，且載藥量較高，能聚集于腫瘤區(qū)域，結(jié)合光熱和化療作用，增加腫瘤治療效果。后續(xù)治療隨訪階段裸鼠腫瘤圖片和相對腫瘤生長曲線也說明了這一點(diǎn)，plga-pb-ptx-peg-fa+nir組可以顯著地抑制腫瘤的生長。plga-pb-peg-fa+nir組僅次于plga-pb-ptx-peg-fa+nir組，也可以抑制腫瘤生長，原因歸結(jié)為plga-pb-peg-fa的光熱作用。plga-pb-ptx-peg-fa和ptx相比，因其具有靶向腫瘤細(xì)胞的作用和納米藥物遞送功能，可以更多的被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，使腫瘤局部藥物濃度高于游離ptx，從而發(fā)揮比ptx更大的抗腫瘤作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和其他pbnps相關(guān)的文獻(xiàn)報道結(jié)果類似。而根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，plga-pb-peg-fa不能抑制腫瘤生長，也說明不帶化療藥物的納米復(fù)合物的生物安全性。nir組也不能抑制腫瘤生長，同上述排除了激光自身發(fā)熱導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的因素。我們的結(jié)果證實(shí)，制備的plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物可作為理想的體內(nèi)綜合化療和光熱腫瘤治療的納米物質(zhì)。pcna和tunel法檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了上面的觀點(diǎn)。plga-pb-ptx-peg-fa+nir組腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)(pi)最低，而凋亡指數(shù)(ai)最低。而腫瘤he染色顯示plga-pb-ptx-peg-fa+nir組壞死區(qū)域最大，病理切片顯示滿視野幾乎都是無定型壞死細(xì)胞形態(tài)。這和pcna、tunel結(jié)果一致，更進(jìn)一步證實(shí)了plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物高效的綜合治療腫瘤的能力。并且，plga-pb-ptx-peg-fa+nir組在隨訪21d后裸鼠心、肝、脾、肺、腎的he染色切片和對照組相比，沒有明顯改變，說明制備的靶向納米復(fù)合物良好的生物安全性。綜上所述，制備的plga-pb-ptx-peg-fa靶向納米復(fù)合物有能力成為光聲、磁共振多模態(tài)顯影劑及影像介導(dǎo)下結(jié)合化療和光熱綜合腫瘤治療的靶向納米物質(zhì)。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利的實(shí)用性。當(dāng)前第1頁12