本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及大黃素甲醚及其衍生物的微囊、其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

中藥大黃為蓼科植物藥用大黃(rheumoffcinalebaill)、掌葉大黃(rheumpalmatuml.)、唐古特大黃(rheumtanguticummaxim.exbalf)的干燥根和根莖。大黃性寒、味苦，具瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的作用。大黃還可以用于實(shí)熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、癰腫疔瘡、腸癰腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、跌打損傷、濕熱痢疾、黃疸尿赤、淋證、水腫；、外治燒燙傷等。酒大黃善清上焦血分熱毒，熟大黃瀉下力緩瀉火解毒，大黃炭涼血化瘀止血。

通過現(xiàn)代分離及分析手段，人們發(fā)現(xiàn)大黃藥理活性的主要成分為蒽醌類衍生物，包括蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚及大黃酸等，其中大黃素甲醚是大黃中的主要有效成分之一。大黃素甲醚別名朱砂蓮乙素、非斯酮、1,8-二羥基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌，分子式是c16h12o5，為金黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為203℃～207℃，幾乎不溶于水，微溶于冷乙醇，易溶于沸乙醇，溶于苯、氯仿、乙醚、丙酮、冰醋酸、氫氧化鈉及熱碳酸鈉溶液，極微溶于石油醚。

大黃素甲醚結(jié)構(gòu)式

大黃素甲醚的藥理學(xué)活性已引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道，大黃素甲醚能使模型組血清alt、ast及tnf水平下降，病理組織改變有所減輕，從而起到對大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。另有研究表明大黃素甲醚可減輕腦缺血再灌注損傷。此外，大黃素甲醚還對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、鏈球菌和痢疾桿菌等多種細(xì)菌均有抑制作用。

大黃素甲醚口服時(shí)的生物利用度低，藥物吸收差，為此在臨床應(yīng)用上具有一定的局限性。因此，亟需開發(fā)患者依從性好、性能穩(wěn)定且藥物特性得以保持的大黃素甲醚藥物劑型，從而有利于發(fā)揮該藥物的療效，改善治療效果，并達(dá)到降低毒副作用的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為改善現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種腸溶制劑，包含作為活性成分的式i所示的大黃素甲醚或其衍生物，和藥學(xué)上可接受的輔料；

優(yōu)選地，所述腸溶制劑選自腸溶微囊、腸溶片或腸溶膠囊；

其中，所述微囊包含作為活性成分的式i所示的大黃素甲醚或其衍生物，和作為囊材的海藻酸鈉-殼聚糖；

其中，r1、r4彼此獨(dú)立地代表無取代或被一個(gè)或多個(gè)ra取代的下列基團(tuán)：烷基、烷基氧基；

r2、r3彼此獨(dú)立地代表h，無取代或被一個(gè)或多個(gè)ra取代的下列基團(tuán)：烷基、烷基羰基、烷基磺?；?、烷基磷?；?；

每一個(gè)r^a彼此獨(dú)立地選自鹵素、羥基、巰基、硝基、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷基氧基、環(huán)烷基氧基、雜環(huán)基氧基、芳基氧基、雜芳基氧基、-nr^dr^er^f、-c(o)or^g、-s(o)2or^g；

r^d、r^e、r^f彼此獨(dú)立地選自h，無取代或被一個(gè)或多個(gè)r^b取代的下列基團(tuán)：烷基、烯基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基；

r^g獨(dú)立地選自h，無取代或被一個(gè)或多個(gè)r^b取代的下列基團(tuán)：烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基氧基、環(huán)烷基氧基、雜環(huán)基氧基、芳基氧基、雜芳基氧基；

每一個(gè)r^b獨(dú)立地選自鹵素、羥基、巰基、硝基、氨基、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷基氧基、環(huán)烷基氧基、雜環(huán)基氧基、芳基氧基、雜芳基氧基；

優(yōu)選地，r1和r4為甲基，r2和r3為h。

根據(jù)本發(fā)明，所述微囊的平均粒徑可為120～3000μm，例如1000～1800μm，如1400～1800μm，具體實(shí)例可以是約1574～1722μm。

根據(jù)本發(fā)明，所述微囊的載藥量可以為5～40μg/g，如10～30μg/g，優(yōu)選為12-20μg/g。

根據(jù)本發(fā)明，所述微囊對藥物例如大黃素甲醚的包封率可以為60％以上，例如為65％～75％。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，所述腸溶制劑是腸溶微囊。

所述腸溶制劑(例如微囊)可以是具有抗腫瘤活性的腸溶制劑，優(yōu)選具有廣譜抗腫瘤活性的腸溶制劑；

所述腫瘤可以是選自下列的一種或多種癌癥：肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

本發(fā)明還提供所述腸溶制劑(例如微囊)的制備方法，包括：

1)將式i所示的大黃素甲醚或其衍生物的油相溶液，與海藻酸鈉的水相溶液混合，制備乳液；

2)將步驟1)所得的乳液與cacl2溶液混合，攪拌，過濾，洗滌，得到濕微囊；

3)將濕微囊投入殼聚糖溶液中孵化，洗滌，干燥，得到所述微囊。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，優(yōu)選地，所述制備方法中：

步驟1)中：

大黃素甲醚或其衍生物的油相溶液可通過將大黃素甲醚或其衍生物與魚肝油混合，超聲助溶得到；

海藻酸鈉的水相溶液可通過將海藻酸鈉與水混合得到；

例如，可以通過將油相溶液加入水相溶液中，攪拌形成乳液；

優(yōu)選地，所述大黃素甲醚及其衍生物的質(zhì)量(g)與魚肝油的體積(ml)比為(50～70):1，優(yōu)選(55～60):1，例如使用60:1或57:1的大黃素甲醚與魚肝油；

優(yōu)選地，所述海藻酸鈉水溶液的濃度可以為0.5～10質(zhì)量％，如1～3質(zhì)量％，例如2質(zhì)量％。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述水相溶液與油相溶液的水油相體積比可以為2～50:1，如8～10:1，其實(shí)例可以為9:1。

根據(jù)本發(fā)明，將油相溶液加入水相溶液中時(shí)，可以在5～40℃下進(jìn)行，例如10～30℃下進(jìn)行，如15～25℃(如室溫)下進(jìn)行。

步驟2)中：

可以將所述乳液加入cacl2溶液中，攪拌，平衡，過濾，沖洗，形成濕微囊；

根據(jù)本發(fā)明，所述cacl2溶液的濃度可以為1～10質(zhì)量％，例如2～4質(zhì)量％，如3質(zhì)量％。

根據(jù)本發(fā)明，所述乳液加入可以使用連續(xù)滴注的方式，例如采用40～80滴/min的速度滴注，如采用50～70滴/min(如60滴/min)的速度滴注。

根據(jù)本發(fā)明，所述平衡時(shí)間可以為10～120min，例如30～60min。

步驟3)中：

例如，殼聚糖溶液的ph可以為5.5～6.5，例如ph＝6～6.5；

例如，所述殼聚糖溶液的濃度可以為0.1～10質(zhì)量％，如0.3～5質(zhì)量％，如0.5～1質(zhì)量％；

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述孵化時(shí)間為10～120min，例如30～60min，如40min。

作為實(shí)例，所述腸溶制劑(例如微囊)的制備方法包括如下步驟：

(1)取大黃素甲醚粉末300mg分散溶解在魚肝油5ml中，超聲助溶，作為油相溶液；

(2)采用1～3％的海藻酸鈉水溶液作為水相溶液；

(3)室溫條件下，將油相溶液緩慢加入水相中，水油相比為8～10:1，磁力攪拌器不斷攪拌，直至形成乳液；

(4)用5號針頭注射器將乳液以60滴/min的速度連續(xù)滴注至2～4％濃度的cacl2溶液中，期間磁力攪拌器不斷攪拌，平衡30min～2小時(shí)，過濾，蒸餾水沖洗2次，形成濕微囊；

(5)0.5～1％殼聚糖溶液調(diào)整ph＝6；

(6)將濕微囊投入殼聚糖溶液中孵化30min～1小時(shí)，蒸餾水沖洗2次，自然干燥，即得大黃素甲醚腸溶微囊。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包含所述腸溶制劑(例如微囊)。

根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物還可以任選地含有或不含有藥學(xué)上可接受的一種或多種輔料。作為實(shí)例，所述輔料可以包括但不限于選自下列的一種或多種：崩解劑、助流劑、潤滑劑、稀釋劑或填充劑、粘合劑、著色劑。

優(yōu)選地，所述藥物組合物為抗腫瘤藥物，特別是廣譜抗腫瘤藥物。

根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物任選地含有或不含有另外的抗腫瘤活性成分。

本發(fā)明還提供一種制備所述藥物組合物的方法，包括將所述腸溶制劑(例如微囊)與其他組分混合。

本發(fā)明還提供一種式i所示的大黃素甲醚或其衍生物在制備藥物組合物，例如腸溶制劑，如微囊劑中的用途。

所述腸溶制劑可以是抗腫瘤腸溶制劑。

根據(jù)本發(fā)明，所述腫瘤可以是選自下列的一種或多種癌癥：肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

本發(fā)明還提供所述腸溶制劑，例如所述微囊在制備抗腫瘤藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明，所述抗腫瘤藥物優(yōu)選為廣譜抗腫瘤藥物，例如可用于預(yù)防、抑制或治療下列一種或多種癌癥的藥物：肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌或慢性髓系白血病。

本發(fā)明還提供所述腸溶制劑，例如所述微囊用于預(yù)防、抑制或治療腫瘤，例如上述癌癥的用途。

術(shù)語定義和解釋

除非另有說明，本申請說明書和權(quán)利要求書中記載的基團(tuán)和術(shù)語定義，包括其作為實(shí)例的定義、示例性的定義、優(yōu)選的定義、表格中記載的定義、實(shí)施例中具體化合物的定義等，可以彼此之間任意組合和結(jié)合。這樣的組合和結(jié)合后的基團(tuán)定義及化合物結(jié)構(gòu)，應(yīng)當(dāng)屬于本申請保護(hù)的范圍內(nèi)。

本申請說明書和權(quán)利要求書記載的數(shù)值范圍，當(dāng)該數(shù)值范圍僅可為“整數(shù)”時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為記載了該范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及該范圍內(nèi)的每一個(gè)整數(shù)。例如，碳原子數(shù)為“1～10”應(yīng)當(dāng)理解為記載了1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一個(gè)整數(shù)。

本發(fā)明使用的“鹵素”指氟、氯、溴和碘。

本發(fā)明單獨(dú)使用或用作后綴或前綴的“烷基”意在包括具有1至20個(gè)，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子(或若提供了碳原子的具體數(shù)目，則指該具體數(shù)目)的支鏈和直鏈飽和脂族烴基。例如，“c1-6烷基”表示具有1、2、3、4、5或6個(gè)碳原子的直鏈和支鏈烷基。烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。

本發(fā)明使用的術(shù)語“環(huán)烷基”意在包括具有指定數(shù)目碳原子的飽和環(huán)基。這些術(shù)語可包括稠合或橋接的多環(huán)系統(tǒng)。環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3至40個(gè)碳原子。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3～10個(gè)碳原子。例如，“c3-6環(huán)烷基”表示例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基的基團(tuán)。

本發(fā)明使用的術(shù)語“芳基”指由5至20個(gè)碳原子構(gòu)成的芳族環(huán)結(jié)構(gòu)。例如：包含5、6、7和8個(gè)碳原子的芳族環(huán)結(jié)構(gòu)可以是單環(huán)芳族基團(tuán)例如苯基；包含8、9、10、11、12、13或14個(gè)碳原子的環(huán)結(jié)構(gòu)可以是多環(huán)的例如萘基。芳環(huán)可在一個(gè)或多個(gè)環(huán)位置取代有上述那些取代基。術(shù)語“芳基”還包括具有兩個(gè)或更多個(gè)環(huán)的多環(huán)環(huán)系，其中兩個(gè)或更多個(gè)碳為兩個(gè)相鄰環(huán)所共有(所述環(huán)為“稠環(huán)”)，其中至少一個(gè)環(huán)是芳族的且其它環(huán)例如可以是環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。多環(huán)的實(shí)例包括但不限于2,3-二氫-1,4-苯并二氧雜環(huán)己二烯和2,3-二氫-1-苯并呋喃。

本發(fā)明使用的“雜芳基”指具有至少一個(gè)環(huán)雜原子(例如硫、氧或氮)的雜芳族雜環(huán)。雜芳基包括單環(huán)系統(tǒng)和多環(huán)系統(tǒng)(例如具有2、3或4個(gè)稠環(huán))。雜芳基的實(shí)例包括但不限于吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三嗪基、呋喃基、喹啉基、異喹啉基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、吡咯基、噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、異噁唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲唑基、1,2,4-噻二唑基、異噻唑基、苯并噻吩基、嘌呤基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、氮雜苯并噁唑基、咪唑并噻唑基、苯并[1,4]二氧雜環(huán)己烯基、苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯基等。在一些實(shí)施方案中，雜芳基具有3至40個(gè)碳原子且在其它實(shí)施方案中具有3至20個(gè)碳原子。在一些實(shí)施方案中，雜芳基包含3至14個(gè)、4至14個(gè)、3至7個(gè)或5至6個(gè)成環(huán)原子。在一些實(shí)施方案中，雜芳基具有1至4個(gè)、1至3個(gè)或1至2個(gè)雜原子。在一些實(shí)施方案中，雜芳基具有1個(gè)雜原子。

除非另有說明，本發(fā)明使用的術(shù)語“雜環(huán)基”指包含3至20個(gè)原子的飽和、不飽和或部分飽和的單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)，其中1、2、3、4或5個(gè)環(huán)原子選自氮、硫或氧，除非另有說明，其可通過碳或氮來連接，其中-ch2-基團(tuán)任選被-c(o)-代替；及其中除非另有相反說明，環(huán)氮原子或環(huán)硫原子任選被氧化以形成n-氧化物或s-氧化物或環(huán)氮原子任選被季銨化；其中環(huán)中的-nh任選被乙?；⒓柞；⒓谆蚣谆酋；〈?；及環(huán)任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代。應(yīng)該理解的是，當(dāng)雜環(huán)基中s原子和o原子的總數(shù)超過1時(shí)，這些雜原子不彼此相鄰。若所述雜環(huán)基為二環(huán)或三環(huán)，則至少一個(gè)環(huán)可任選為雜芳族環(huán)或芳族環(huán)，條件是至少一個(gè)環(huán)是非雜芳族的。若所述雜環(huán)基為單環(huán)，則其一定不是芳族的。雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于哌啶基、n-乙?；哙せ?、n-甲基哌啶基、n-甲?；哙夯-甲磺?；哙夯?、高哌嗪基、哌嗪基、氮雜環(huán)丁烷基、氧雜環(huán)丁烷基、嗎啉基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、二氫吲哚基、四氫吡喃基、二氫-2h-吡喃基、四氫呋喃基、四氫噻喃基、四氫噻喃-1-氧化物、四氫噻喃-1,1-二氧化物、1h-吡啶-2-酮和2,5-二氧代咪唑烷基。

式i化合物還包括其各自所有可能的立體異構(gòu)體，其是單一立體異構(gòu)體或所述立體異構(gòu)體(例如r-異構(gòu)體或s-異構(gòu)體，或者e-異構(gòu)體或z-異構(gòu)體)的任意比例的任意混合物的形式?？赏ㄟ^任意適合的現(xiàn)有技術(shù)方法(例如色譜法，特別是例如手性色譜法)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的化合物的單一立體異構(gòu)體(例如單一對映異構(gòu)體或單一非對映異構(gòu)體)的分離。另外，所述化合物還可以互變異構(gòu)體的形式存在。本發(fā)明式i化合物包括所有可能的互變異構(gòu)體，其是單一互變異構(gòu)體或所述互變異構(gòu)體的任意比例的任意混合物的形式。所有這些異構(gòu)體及它們的混合物都包括在本發(fā)明中。

本發(fā)明的式i化合物、其異構(gòu)體、前藥、藥學(xué)上可接受的鹽以及復(fù)合物可以分別以溶劑合物如水合物的形式存在，其中本發(fā)明的化合物包含作為所述化合物晶格的結(jié)構(gòu)要素的極性溶劑，特別是例如水、甲醇或乙醇。極性溶劑特別是水的量可以化學(xué)計(jì)量比或非化學(xué)計(jì)量比存在。在化學(xué)計(jì)量溶劑合物(例如水合物)的情況下，可能分別是半溶劑合物、一溶劑合物、倍半溶劑合物、二溶劑合物、三溶劑合物、四溶劑合物、五溶劑合物、半五溶劑合物等。本發(fā)明包括所有此類溶劑合物，特別是水合物。

本發(fā)明式i化合物的藥學(xué)上可接受的鹽可以是例如在鏈或環(huán)中具有氮原子或其他堿性基團(tuán)的、具有足夠堿性的本發(fā)明的化合物的酸加成鹽，例如與如下無機(jī)酸形成的酸加成鹽：例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸或硝酸，或者與如下有機(jī)酸形成的酸加成鹽：例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水楊酸、2-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、樟腦酸、肉桂酸、環(huán)戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羥基-2-萘甲酸、煙酸、撲酸、果膠酯酸、過硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羥基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟腦磺酸、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、己二酸、藻酸、馬來酸、富馬酸、d-葡糖酸、扁桃酸、抗壞血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水楊酸、半硫酸或硫氰酸。

另外，具有足夠酸性的本發(fā)明的化合物的另一種適合的藥學(xué)上可接受的鹽是堿金屬鹽(例如鈉鹽或鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽或鎂鹽)、銨鹽，或與提供生理學(xué)可接受的陽離子的有機(jī)堿形成的鹽，例如與如下物質(zhì)形成的鹽：n-甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、賴氨酸、二環(huán)己基胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、肌氨酸、絲氨醇、三羥基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、1-氨基-2,3,4-丁三醇。另外，堿性含氮基團(tuán)可用如下試劑季銨化：低級烷基鹵化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；長鏈鹵化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基鹵化物如芐基和苯乙基溴化物等。

并且，所述藥學(xué)上可接受的鹽還應(yīng)當(dāng)包括部分為內(nèi)鹽形式的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。

術(shù)語“有效量”或者“治療有效量”是指足以實(shí)現(xiàn)預(yù)期應(yīng)用(包括但不限于如下定義的疾病治療)的本發(fā)明所述化合物的量。治療有效量可以取決于以下因素而改變：預(yù)期應(yīng)用(體外或者體內(nèi))，或者所治療的受試者和疾病病癥如受試者的重量和年齡、疾病病癥的嚴(yán)重性和給藥方式等，其可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。該術(shù)語也適用于可在靶細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)特定響應(yīng)(例如減少血小板粘附和/或者細(xì)胞遷移)的劑量。具體劑量將取決于以下因素而改變：所選擇的特定化合物、所依據(jù)的給藥方案、是否與其它化合物組合給藥、給藥的時(shí)間安排、所給藥的組織和所承載的物理遞送系統(tǒng)。

術(shù)語“前藥”意在表示可以在生理?xiàng)l件下或者通過溶劑分解轉(zhuǎn)化成本發(fā)明所述的生物活性化合物的化合物。因此，術(shù)語“前藥”是指可藥用的生物活性化合物的前體。當(dāng)給藥至受試者時(shí)，前藥可以是無活性的，但是例如通過水解在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性化合物。前藥化合物通常提供以下優(yōu)點(diǎn)：在哺乳動物生物體中的溶解性、組織相容性或者延遲釋放。術(shù)語“前藥”也意在包括任何共價(jià)結(jié)合的載體，當(dāng)將該前藥給藥哺乳動物受試者時(shí)，所述前藥在體內(nèi)釋放活性化合物。本發(fā)明所述的活性化合物的前藥可以如下制備：以下述方式修飾活性化合物中存在的官能團(tuán)，所述方式使得修飾物在常規(guī)操作中或者在體內(nèi)裂解成母體活性化合物。前藥包括這樣的化合物，其中羥基、氨基或者巰基與任何基團(tuán)結(jié)合，當(dāng)將活性化合物的前藥給藥哺乳動物受試者時(shí)，所述任何基團(tuán)裂解以分別形成游離的羥基、游離的氨基或者游離的巰基。前藥的實(shí)例包括但不限于活性化合物中羥基官能團(tuán)的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或者胺官能團(tuán)的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。

術(shù)語“輔料”是指可藥用惰性成分。賦形劑種類的實(shí)例非限制性地包括粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、穩(wěn)定劑、填充劑和稀釋劑等。賦形劑能增強(qiáng)藥物制劑的操作特性，即通過增加流動性和/或粘著性使制劑更適于直接壓縮。適用于上述制劑的典型的藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例為：糖類，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；淀粉類，例如玉米淀粉、木薯淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和甲基纖維素；磷酸鈣類，例如磷酸二鈣和磷酸三鈣；硫酸鈉；硫酸鈣；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；硬脂酸堿土金屬鹽，例如硬脂酸鎂和硬脂酸鈣；硬脂酸；植物油類，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油和玉米油；非離子、陽離子和負(fù)離子表面活性劑；乙二醇聚合物；β-環(huán)糊精；脂肪醇類；和谷物水解固形物以及其它無毒的可相容的填充劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧劑、潤滑劑、著色劑等在藥物制劑中常用到的輔料。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明制備了大黃素甲醚及其衍生物的腸溶制劑及微囊，避免了常規(guī)口服制劑在通過胃部時(shí)，活性成分被胃酸水解滅活及對胃的刺激作用，同時(shí)利用緩釋作用，提高了生物利用度，有利于發(fā)揮大黃素甲醚及其衍生物的抗腫瘤作用。發(fā)明人經(jīng)過大量工藝和囊材組分研究，通過調(diào)節(jié)微囊囊材及各組分配比，選擇更適于大黃素甲醚的工藝和參數(shù)條件，能夠改善大黃素甲醚及其衍生物抗腫瘤性能，更適于大黃素甲醚及其衍生物在特定ph值、酶等的作用下，在動物體內(nèi)高效、穩(wěn)定地釋放和吸收，以使活性成分發(fā)揮最佳的效能，從而取得更佳的技術(shù)效果。

本發(fā)明在微囊的囊材選擇上使用了海藻酸鈉-殼聚糖微囊，海藻酸鈉與氯化鈣接觸，具有瞬時(shí)成囊的性質(zhì)，而殼聚糖和海藻酸鈉可以通過正、負(fù)電荷作用形成聚電解質(zhì)膜，從而提高微囊的穩(wěn)定性和載藥量，并可調(diào)節(jié)藥物釋放速度。

海藻酸鈉-殼聚糖是天然高分子材料，具有無毒、無刺激性、成膜性能好、穩(wěn)定性好、具有可生物降解的優(yōu)勢，尤其殼聚糖自身即具有一定的抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、降血脂及膽固醇和腫瘤細(xì)胞抑制的作用，可對大黃素甲醚及其衍生物抗腫瘤產(chǎn)生輔助效果，從微囊的囊材選擇上優(yōu)于半合成高分子的纖維素衍生物，以及合成高分子的聚酯、聚酸酐等。

以天然高分子材料海藻酸鈉-殼聚糖為微囊的囊材，與合成及半合成高分子材料相比，具有無毒、無刺激性、成膜性能好、穩(wěn)定性好、可生物降解的優(yōu)勢，且殼聚糖本身具有抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、降血脂及膽固醇和腫瘤細(xì)胞抑制的作用，對大黃素甲醚及其衍生物的抗腫瘤作用具有促進(jìn)效果，為此取得了優(yōu)于半合成高分子的纖維素衍生物，以及合成高分子的聚酯、聚酸酐等囊材的良好效果。

使用本發(fā)明所述濃度的海藻酸鈉水溶液作為水相，可以使后續(xù)制備的乳液粘度適中，利于滴制，穩(wěn)定性好，不易分層。采用本發(fā)明的水油相比，既保證了乳劑穩(wěn)定性，又提高了乳液載藥量。

隨著cacl2溶液濃度增大、平衡時(shí)間延長，微囊的硬度增大，但載藥量降低，采用本發(fā)明濃度的cacl2溶液和平衡時(shí)間，可以保證微囊具有適當(dāng)?shù)挠捕龋冶ＷC了高載藥量。

本發(fā)明采用濃度為0.5～1％殼聚糖溶液，在此濃度時(shí)，微囊粒徑較低，孵化得到的微囊圓整度好；殼聚糖溶液的ph值還有利于改善微囊膜的強(qiáng)度。將濕微囊投入殼聚糖溶液中孵化30min～1小時(shí)，在微囊粒徑減小的同時(shí)，保證了微囊的載藥量。

在制備微囊的過程中，優(yōu)化了制備工藝，得出簡單易行、安全環(huán)保的制備方法，按優(yōu)化條件制備的多批大黃素甲醚及其衍生物微囊自然干燥后呈白色顆粒，球形圓整，大小均勻，分散良好，粒徑、載藥量、包封率均保持穩(wěn)定，表明此工藝下制備的微囊性質(zhì)穩(wěn)定，適于在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例4中受試裸鼠體重的變化圖。

圖2為實(shí)施例4中受試裸鼠腫瘤體積的變化圖(**p＜0.01)。

圖3為實(shí)施例4中受試裸鼠腫瘤的細(xì)胞凋亡及he染色圖。

具體實(shí)施方式

下文將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的大黃素甲醚及其衍生物微囊的制備方法和應(yīng)用做更進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下列實(shí)施例僅為示例性地說明和解釋本發(fā)明，而不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均涵蓋在本發(fā)明旨在保護(hù)的范圍內(nèi)。

除非另有說明，以下實(shí)施例中使用的原料和試劑均為市售商品，或者可以通過已知方法制備。

i.微囊的制備和活性測試實(shí)驗(yàn)

實(shí)施例1：

(1)取大黃素甲醚粉末300mg分散溶解在魚肝油5ml中，超聲助溶，作為油相溶液；

(2)采用3％的海藻酸鈉水溶液作為水相溶液；

(3)水油相比為8:1；

(4)在23℃將油相溶液緩慢加入水相溶液中，磁力攪拌器不斷攪拌，直至形成乳液，乳液粘稠度較高，混勻成乳時(shí)間延長，滴制難度增加；

(5)用5號針頭注射器將乳液以40滴/min的速度連續(xù)滴注至4％濃度的cacl2溶液中，期間磁力攪拌器不斷攪拌，形成漩渦，平衡1小時(shí)，過濾，蒸餾水沖洗2次，形成濕微囊；

(6)1％殼聚糖溶液調(diào)整ph＝6；

(7)將濕微囊投入殼聚糖溶液中孵化1小時(shí)，蒸餾水沖洗2次，自然干燥，即得大黃素甲醚腸溶微囊；

所得大黃素甲醚腸溶微囊為白色顆粒，球形圓整，表面光滑，大小均勻，分散良好，平均粒徑1574.36μm、載藥量14.23μg/g、包封率69.51％。

實(shí)施例2：

(1)取大黃素甲醚粉末300mg分散溶解在魚肝油5ml中，超聲助溶，作為油相溶液；

(2)采用2％的海藻酸鈉水溶液作為水相溶液；

(3)水油相比為9:1；

(4)在23℃將油相溶液緩慢加入水相溶液中，磁力攪拌器不斷攪拌，直至形成乳液；

(5)用5號針頭注射器將乳液以60滴/min的速度連續(xù)滴注至4％濃度的cacl2溶液中，期間磁力攪拌器不斷攪拌，形成漩渦，平衡1小時(shí)，過濾，蒸餾水沖洗2次，形成濕微囊；

(6)1％殼聚糖溶液調(diào)整ph＝6；

(7)將濕微囊投入殼聚糖溶液中孵化40min，蒸餾水沖洗2次，自然干燥，即得大黃素甲醚腸溶微囊；

所得大黃素甲醚腸溶微囊為白色顆粒，球形圓整，表面光滑，大小均勻，分散良好，平均粒徑1135.41μm、載藥量20.14μg/g、包封率72.12％。

實(shí)施例3：

(1)取大黃素甲醚粉末2000mg分散溶解在魚肝油35ml中，超聲助溶，作為油相溶液；

(2)采用2％的海藻酸鈉水溶液作為水相溶液；

(3)水油相比為10:1；

(4)在25℃將油相溶液緩慢加入水相溶液中，磁力攪拌器不斷攪拌，直至形成乳液；

(5)用5號針頭注射器將乳液以60滴/min的速度連續(xù)滴注至3％濃度的cacl2溶液中，期間磁力攪拌器不斷攪拌，形成漩渦，平衡1小時(shí)，過濾，蒸餾水沖洗2次，形成濕微囊；

(6)1％殼聚糖溶液調(diào)整ph＝6；

(7)將濕微囊投入殼聚糖溶液中孵化40min，蒸餾水沖洗2次，自然干燥，即得大黃素甲醚腸溶微囊；

所得大黃素甲醚腸溶微囊為白色顆粒，球形圓整，表面光滑，大小均勻，分散良好，經(jīng)平均粒徑1721.78μm、載藥量12.58μg/g、包封率65.49％。

實(shí)施例4大黃素甲醚腸溶微囊的抗腫瘤的活性評價(jià)

1.試驗(yàn)動物：

裸鼠：spf級balb/cnu，雌雄各半，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所繁育場提供。

2.試驗(yàn)方法：

2.1腫瘤模型的建立

將人肝癌hepg2細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞增殖至所需量后胰酶消化，收集細(xì)胞，取細(xì)胞懸液置顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，在無菌條件下，接種于裸小鼠右腋皮下，接種量為2.0×10⁷個(gè)細(xì)胞/0.2ml/只。

2.2分組與給藥

自接種瘤細(xì)胞后定期用游標(biāo)卡尺分別測量瘤體積(tv)，測量所得瘤體積達(dá)到100mm³時(shí)，隨機(jī)分為空白對照組、大黃素甲醚腸溶微囊20mg/kg/day、40mg/kg/day劑量組，每組10只。各組均每天灌胃給藥一次。空白對照組給等體積的滅菌蒸餾水。每周測量各組腫瘤體積2次，同時(shí)稱量裸鼠體重。

2.3瘤體積測定

經(jīng)過24天灌胃，末次給藥后24小時(shí)處死動物，稱體重，解剖瘤塊，稱瘤重。

計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積計(jì)算公式：v＝1/2×a×b²，其中a、b分別為瘤體的長、寬徑。根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算相對腫瘤體積(rtv)。

2.4瘤體切片染色及凋亡測定

動物處死后，分離瘤體，采用常規(guī)40g/l多聚甲醛固定，石蠟包埋。包埋后，用石蠟切片機(jī)連續(xù)切取3μm厚度的切片，置于60℃溫水漂浮展平，平鋪于涂有apes膠的載玻片上，入40℃左右烤片箱10min烘干。采用tunel法檢測，操作按照試劑盒說明進(jìn)行。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片選取3個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)較多的高倍視野，計(jì)算平均每100個(gè)瘤體細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比，即細(xì)胞凋亡率。

石蠟切片染色前進(jìn)行脫蠟，脫蠟完成后，使用he染色法以蘇木精溶液染色20min，1％鹽酸酒精浸泡5秒鐘，用自來水洗10秒，浸入飽和碳酸鋰水溶液中，切片變藍(lán)化10秒鐘。以70％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡5min，1％伊紅酒精溶液浸泡1min，無水乙醇浸泡兩次各5min，無水乙醇：二甲苯為1:1的溶液浸泡5min，二甲苯浸泡兩次各5min，完成染色，中性樹脂封片，鏡下觀察。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±sd表示，單個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，graph-padprism5.01軟件處理數(shù)據(jù)，student’sttest統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)，p<0.05代表結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.試驗(yàn)結(jié)果

3.1大黃素甲醚腸溶微囊對荷瘤裸鼠體重的影響

當(dāng)腫瘤接種后瘤體積達(dá)到100mm³時(shí)，進(jìn)行分組灌胃，期間裸鼠未發(fā)生死亡現(xiàn)象。結(jié)果如圖1所示，灌胃期間裸鼠體重未發(fā)生變化。

3.2大黃素甲醚腸溶微囊對荷瘤裸鼠瘤體積的影響

經(jīng)過大黃素甲醚腸溶微囊灌胃后，裸鼠腫瘤體積得到抑制，結(jié)果如圖2所示，且隨著大黃素甲醚灌胃劑量的增加，腫瘤體積不斷下降。

3.3大黃素甲醚腸溶微囊對荷瘤裸鼠瘤體細(xì)胞凋亡的影響

瘤體經(jīng)過石蠟切片，通過tunel法分析腫瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)經(jīng)大黃素甲醚腸溶微囊灌胃，腫瘤細(xì)胞的凋亡有所提升，且隨著灌胃劑量加大，腫瘤細(xì)胞凋亡率不斷增加，結(jié)果如圖3所示，表明大黃素甲醚腸溶微囊具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤作用。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大黃素甲醚腸溶微囊對裸鼠體重?zé)o顯著影響，對肝癌荷瘤裸鼠的腫瘤體積具有抑制作用，其腫瘤抑制作用與促進(jìn)腫瘤凋亡有關(guān)。

ii.大黃素甲醚活性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法：

1.試驗(yàn)細(xì)胞及動物：

細(xì)胞株：8種人癌細(xì)胞株，包括：hepg2(肝癌)、h1299(肺癌)、mda-mb-231(乳腺癌)、sw620(結(jié)腸癌)、cne2(鼻咽癌)、sgc-7901(胃癌)、kb(口腔上皮細(xì)胞癌)、k562(慢性髓系白血病)，以及3種正常細(xì)胞株hl-7702(正常肝細(xì)胞)、beas-2b(正常肺細(xì)胞)、ncm460(正常結(jié)腸上皮細(xì)胞)。上述細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞所提供。

裸鼠：spf級balb/cnu，雌雄各半。spf級昆明小鼠，雌雄各半，體重為18～22g。spf級wistar大鼠，體重50～70g，雌雄各半。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。

2.試驗(yàn)方法：

2.1cck-8法

將各種細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，每種細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(dmso組)、大黃素甲醚10μm組、大黃素甲醚20μm組，加入相應(yīng)的藥物孵育24-72小時(shí)，更換rpmi1640培養(yǎng)基，清洗細(xì)胞去除藥物，向每孔加入10μlcck-8溶液，將各種細(xì)胞重新放入37℃培養(yǎng)箱中孵育3h。用酶標(biāo)儀于450nm處檢測各孔的吸光度，計(jì)算各組活細(xì)胞百分比。

2.2裸鼠腫瘤模型的建立

hepg2肝癌細(xì)胞、h1299肺癌細(xì)胞、sw620結(jié)腸細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞增殖至所需量后胰酶消化，收集細(xì)胞，取細(xì)胞懸液置顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，在無菌條件下，接種于裸小鼠右腋皮下，接種量為2.0×10⁷個(gè)細(xì)胞/0.2ml/只。

2.3裸鼠瘤體積檢測

自接種瘤細(xì)胞后定期用游標(biāo)卡尺分別測量瘤體積(tv)，測量所得瘤體積達(dá)到100mm³時(shí)，隨機(jī)分為空白對照組(dmso組)、大黃素甲醚20mg/kg/day、40mg/kg/day劑量組，每組10只。各組均每天灌胃給藥一次。每周測量各組腫瘤體積2次。經(jīng)過24天灌胃，末次給藥后24小時(shí)處死動物，稱體重，解剖瘤塊，稱瘤重。

計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積計(jì)算公式：v＝1/2×a×b²，其中a、b分別為瘤體的長、寬徑。

2.4大黃素甲醚急性毒性試驗(yàn)

按照最大耐受量(mtd)法試驗(yàn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前空腹16h備用(不限制飲水)。稱取5.0g大黃素甲醚，以dmso溶解灌胃給予實(shí)驗(yàn)動物，灌胃量為0.2ml/10g.bw，染毒劑量為5.0g/kg.bw，觀察用藥后小鼠有無出現(xiàn)明顯的中毒癥狀及死亡情況，連續(xù)觀察一周，記錄動物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，14天后解剖小鼠，肉眼及顯微鏡觀察重要臟器，有無出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。

2.5大黃素甲醚亞急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)藥物劑量換算，以換算后抗腫瘤劑量的20、50、100倍為染毒劑量，染毒劑量分別為0.08、0.2、0.4g/kg.bw，3種劑量分別灌胃大鼠，每日一次，對照組給予同體積的dmso。單籠喂養(yǎng)，自由飲食，觀察大鼠的一般表現(xiàn)、行為、中毒體征等，連續(xù)觀察30天，每周稱量體重1次，稱量2次食物剩余量和撒食量，計(jì)算每周食物攝入量，每周及總食物利用率。第30天尾靜脈取血，進(jìn)行血常規(guī)測定。禁食16h后于第31天腹主動脈取血，進(jìn)行血生化測定。30天后解剖大鼠，肉眼及顯微鏡觀察重要臟器，有無出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±sd表示，單個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，graph-padprism5.01軟件處理數(shù)據(jù)，student’st-test統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)，p<0.05代表結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)施例5大黃素甲醚對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞存活率的影響

按照如上實(shí)驗(yàn)方法，大黃素甲醚對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞存活率的影響測試結(jié)果如表1所示：與對照組相比，大黃素甲醚對肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌、慢性髓系白血病細(xì)胞的存活率均有顯著的抑制作用，且隨著大黃素甲醚劑量提升，對以上腫瘤細(xì)胞存活率的抑制作用增強(qiáng)。大黃素甲醚的腫瘤抑制作用在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞中尤其明顯。而對于正常肝細(xì)胞、正常的支氣管上皮細(xì)胞、正常結(jié)腸上皮細(xì)胞的存活率無顯著影響。由表1的結(jié)果可知，大黃素甲醚能抑制多種腫瘤細(xì)胞活性，尤其對肝癌、肺癌、結(jié)腸癌有效，但對機(jī)體正常細(xì)胞的活性無影響。

表1大黃素甲醚對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞存活率的影響

vs對照組*p＜0.05，**p＜0.01。

實(shí)施例6大黃素甲醚對荷瘤裸鼠瘤體積的影響

按照如上實(shí)驗(yàn)方法，大黃素甲醚對荷瘤裸鼠的瘤體積的影響結(jié)果如表2所示，與day0相比，肝癌、肺癌、結(jié)腸癌day24的腫瘤體積均有顯著增長；在day24，與空白對照組比較，應(yīng)用大黃素甲醚灌胃的裸鼠瘤體積顯著減小，且隨著灌胃劑量的增長，瘤體積的抑制作用更加顯著。此結(jié)果表明：大黃素甲醚能有效抑制肝癌、肺癌、結(jié)腸癌荷瘤裸鼠的瘤體積增長，對腫瘤有顯著的抑制作用。

表2大黃素甲醚對對荷瘤裸鼠瘤體積的影響

vsday0##p＜0.01；vsday24對照組**p＜0.01。

實(shí)施例7大黃素甲醚的急性、亞急性毒性實(shí)驗(yàn)

3.1急性毒性試驗(yàn)：

灌胃給予受試物一周后，動物100％存活率，活動度、毛發(fā)光滑度、飲食呼吸正常，鼻、眼、口腔有無異常分泌物，未見明顯中毒癥狀。一周后解剖小鼠，肉眼及顯微鏡觀察重要臟器，未出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。最大耐受量(mtd)試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，大黃素甲醚對兩種性別小鼠的mtd均大于5.0g/kg.bw。根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，該樣品屬實(shí)際無毒級物質(zhì)。

表3小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2亞急性毒性試驗(yàn)：

試驗(yàn)周期內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組動物總體生長狀況良好，體重逐周增長，100％存活率，活動度、毛發(fā)光滑度、飲食呼吸正常，未見中毒體征及死亡。各實(shí)驗(yàn)組動物每周體重(如表4)、進(jìn)食量、食物利用率無顯著性差異。各組大鼠血液學(xué)檢測各項(xiàng)指標(biāo)如表5-6所示，無顯著性差異。30天后解剖大鼠，肉眼及顯微鏡觀察重要臟器，未出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。

表4大鼠30天體重的變化

表5大鼠30天喂養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)┢谘簩W(xué)檢查結(jié)果

表630天喂養(yǎng)對大鼠白細(xì)胞的影響

由以上實(shí)施例的結(jié)果可知，大黃素甲醚作為一種具有廣譜抗腫瘤作用的中藥有效成分，在體外實(shí)驗(yàn)中對肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、胃癌、口腔上皮癌、慢性髓系白血病細(xì)胞的活性均有明顯的抑制作用，尤其對肝癌、肺癌、結(jié)腸癌的抑制作用更為顯著。在動物實(shí)驗(yàn)中，對肝癌、肺癌、結(jié)腸癌荷瘤裸鼠的瘤體積均有明顯的抑制作用。而且大黃素甲醚本身對正常機(jī)體無毒副作用。

并且，本發(fā)明的大黃素甲醚及其衍生物微囊，避免了大黃素甲醚及其衍生物在通過胃部時(shí)，被胃酸水解滅活及對胃的刺激作用，同時(shí)利用緩釋作用，提高了生物利用度，有利于發(fā)揮大黃素甲醚及其衍生物的抗腫瘤作用，能夠改善大黃素甲醚及其衍生物抗腫瘤性能，取得更佳的治療效果。

以上，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行了說明。但是，本發(fā)明不限定于上述實(shí)施方式。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。