本發(fā)明涉及一種藥物制劑及其制備方法，特別涉及葛根素立方液晶納米粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

葛根素為常用中藥葛根的主要藥效成分，治療缺血性腦中風(fēng)療效確切，藥理作用廣泛。多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)顯示，葛根素能夠有效的降低中風(fēng)患者的血漿內(nèi)皮素、同型半光氨酸、氧化低密度脂蛋白的水平；具有改善患者神經(jīng)功能、提高日常生活能力的作用。但由于葛根素為異黃酮碳苷，溶解度低，口服給藥絕對(duì)生物利用度僅為3.77％，caco-2、mdck細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，其表觀滲透系數(shù)papp僅為1×10^-7，細(xì)胞吸收和黏膜滲透性較差。另外，臨床多采用注射給藥進(jìn)行治療。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，靜脈注射給藥，腦靶向性極差，靶向指數(shù)te不到2％。為葛根素尋求一種安全性高、順應(yīng)性好、能夠迅速發(fā)揮藥效的給藥途徑，和增加葛根素溶解性和滲透性給藥劑型具有重要的臨床價(jià)值。

目前，在中、西醫(yī)兩方面領(lǐng)域中，鼻腔給藥制劑均已被廣泛認(rèn)為是一種能夠?qū)崿F(xiàn)快速遞藥、直達(dá)腦部的新型給藥系統(tǒng)。有實(shí)驗(yàn)表明葛根素經(jīng)鼻給藥后，嗅球部位藥物峰濃度(cmax)和生物利用度(aucbrain)顯著高于靜脈注射組(分別為靜脈注射組的1.72倍和3.05倍)，半衰期和平均滯留時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，腦靶向指數(shù)高達(dá)14％，是靜脈注射組的7.5倍。可見(jiàn)，葛根素以鼻腔給藥形式治療腦部疾病具有良好前景。

液晶是一種獨(dú)立的物質(zhì)狀態(tài)，處于該狀態(tài)的物質(zhì)具有像液體一樣的流動(dòng)性和連續(xù)性，同時(shí)具有晶體的各向異性。與脂質(zhì)體相比，液晶的載體材料更為穩(wěn)定，不易發(fā)生氧化或被酶解，能夠?yàn)樗幬锾峁┓€(wěn)定的“內(nèi)環(huán)境”；并且其內(nèi)部具有獨(dú)特的雙水道結(jié)構(gòu)和更大的雙分子層面積，可通過(guò)將水溶性藥物(如四環(huán)素、頭孢唑啉、胰島素等)包封于水道之中，脂溶性藥物(如維生素e等)包裹于脂質(zhì)雙分子層中，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同極性藥物的增溶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高葛根素在包封率高、利用度高、細(xì)胞吸收和黏膜滲透性較好的脂質(zhì)立方液晶納米粒鼻用制劑及其制備方法。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

本發(fā)明葛根素液晶納米粒，其原料組成如下(以重量份計(jì)；)：

本發(fā)明葛根素液晶納米粒，其原料組成優(yōu)選為(以重量份計(jì))：

本發(fā)明鼻腔緩釋制劑葛根素液晶納米粒制備方法如下：

(1)取單油酸甘油酯、泊洛沙姆407、維生素e醋酸酯，加入溶劑無(wú)水乙醇，40-65℃熱水浴下溶解，減壓回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均勻分散在圓底燒瓶?jī)?nèi)壁；

(2)將促滲劑材料甘油加入蒸餾水中至混合溶解得到3-7％甘油-水，加入配方量的葛根素溶解；

(3)將水相(2)加入油相，在熱水浴中，常壓條件下旋轉(zhuǎn)混合至均勻。

(4)將(3)液體超聲得到色澤均一無(wú)分層的乳白色液體。

本發(fā)明鼻腔緩釋制劑葛根素液晶納米粒制備方法優(yōu)選為：

(1)取單油酸甘油酯、泊洛沙姆407、維生素e醋酸酯，加入溶劑無(wú)水乙醇，55℃熱水浴下溶解，減壓回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均勻分散在圓底燒瓶?jī)?nèi)壁；

(2)將促滲劑材料甘油加入蒸餾水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入配方量的葛根素溶解；

(3)將水相(2)加入油相，在熱水浴中，常壓條件下旋轉(zhuǎn)混合至均勻。

(4)將(3)液體超聲得到色澤均一無(wú)分層的乳白色液體。

附圖說(shuō)明

圖1是液晶納米粒的外觀圖

圖2是葛根素液晶液晶納米粒投射電鏡圖

圖3是葛根素液晶液晶納米粒偏光顯微鏡圖(a為溶劑，b為葛根素液晶納米粒)

圖4是葛根素液晶液晶納米粒粒徑、電位分布圖(a為電位，b為粒徑半徑)

圖5是葛根素液晶液晶納米粒體外釋放曲線圖

本發(fā)明涉及采用脂質(zhì)立方液晶作為藥物載體包封葛根素制備成葛根素脂質(zhì)立方液晶納米粒，運(yùn)用偏光顯微鏡證明液晶的存在，投射電鏡下外觀完整，形態(tài)明顯；電位為﹣37.47±1.550mv，粒徑半徑為94.62±3.18nm。該方法制備出的制劑包封率高，穩(wěn)定性好，體外釋放較葛根素水溶液緩慢，細(xì)胞透過(guò)率均較葛根素溶液高。證明液晶納米?？勺鳛楦鸶氐慕o藥劑型，增加其溶解性和細(xì)胞滲透性，下列實(shí)驗(yàn)例(實(shí)驗(yàn)樣本用實(shí)施例1制備)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)例1葛根素液晶納米粒的偏光效應(yīng)

溶劑5％甘油-水、液晶納米粒滴加于載玻片，用蓋玻片蓋住，偏光顯微鏡下觀察液晶納米粒狀態(tài)。與空白溶液相比(圖3a),液晶納米粒在偏光顯微鏡下可見(jiàn)折射光(圖3b)，可判斷有液晶存在。

實(shí)驗(yàn)例2葛根素液晶納米粒粒徑、電位分布

取空白納米粒和液晶載藥納米粒于樣品池中，用激光粒度分析儀測(cè)、貝克曼電位測(cè)定其粒徑、電位分布情況，測(cè)量三次。測(cè)定結(jié)果分散性良好，粒徑半徑為94.62±3.18nm，電位為﹣37.47±1.550。粒徑、電位分布圖分別見(jiàn)圖4(a)，4(b)。

實(shí)驗(yàn)例3葛根素液晶納米粒體外釋放情況考察

取實(shí)施案例1的液晶納米粒，采用透析袋法進(jìn)行體外釋放特性實(shí)驗(yàn)考察。釋放介質(zhì)為水。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：將1ml液晶納米粒、5mg/ml葛根素水溶液。樣品用注射器加入透析袋(截留分子量8000-10000)中，兩頭用夾子夾住。接受介質(zhì)為水，t＝37℃，轉(zhuǎn)速為300r/min，分別于0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12h，24h取樣1ml，每次再補(bǔ)入1ml相同條件下的水。取出的樣過(guò)0.22μm微孔濾膜，hplc測(cè)定葛根素濃度。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)釋放率(q)。

q＝(cn+∑civi)/q0×100％

式中q0為接受池葛根素總量；cn為第n次取樣實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，vi為第i次取樣體積，ci為第i次取樣實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)葛根素水溶液釋放速度快，于2h基本釋放完全。葛根素液晶納米粒釋放緩慢，于6小時(shí)釋放率達(dá)90％。提示葛根素被液晶納米粒裝載之后，可延緩藥物釋放，具有一定包裹性。

實(shí)驗(yàn)例4葛根素液晶納米粒mdck-mdr1細(xì)胞毒性

mdck-mdr1其許多生理特性均與血腦屏障(blood-brainbarrier,bbb)相似，常用于體外藥物透過(guò)bbb的篩選模型。選用體外血腦屏障細(xì)胞模型mdck-mdr1對(duì)葛根素液晶納米粒在腦部的吸收進(jìn)行研究，并且通過(guò)比較葛根素和葛根素液晶納米粒細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)參數(shù)，從細(xì)胞和分子水平闡明立方液晶納米粒促葛根素進(jìn)在腦部的吸收。在進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)之前，首先通過(guò)mtt實(shí)驗(yàn)考察葛根素液晶納米粒的安全給藥濃度。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

(1)常規(guī)條件下分別培養(yǎng)mdck-mdr1細(xì)胞至70-80％匯合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶(0.02％edta)消化細(xì)胞，以dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)終止消化，用移液器輕輕吹打后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800r·min^-1離心5min，棄去上清液，再加入新鮮的dmem高糖培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、100u·ml^-1青霉素和100μg·ml^-1鏈霉素)，制得單個(gè)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×10⁴個(gè)/ml，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，邊緣孔用無(wú)菌pbs填充。

(2)將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入co2培養(yǎng)箱，在37℃、5％co2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

(3)設(shè)置pue-lcn給藥濃度為稀釋5倍、稀釋10倍、稀釋12.5倍、稀釋20倍、稀釋25倍、稀釋50倍，培養(yǎng)24h。

(4)每孔加入mtt溶液20μl，37℃孵育4h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μldmso，振蕩10min，使mtt充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度，記錄結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)下表。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以存活率表示，采用sas9.0統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，^*p<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)液晶納米粒稀釋25倍(約200μg/ml)以下時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞無(wú)毒性，可以作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)濃度。

表1不同稀釋倍數(shù)pue-lcn的mdck-mdr1細(xì)胞毒性研究結(jié)果(n＝3)

實(shí)驗(yàn)例5葛根素液晶納米粒跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究實(shí)驗(yàn)

具體操作如下：

(1)培養(yǎng)mdck-mdr1細(xì)胞至70-80％匯合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶(含0.02％edta)消化，并以dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)終止消化反應(yīng)，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液混勻后轉(zhuǎn)移入15ml離心管中，以800r·min^-1離心5min，之后棄去上清液，重新加入新鮮的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基；mdck-mdr1細(xì)胞加入dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清))，制得單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度，接種于transwell聚碳酸酯12孔板(1.12cm²，0.4μm)上側(cè)細(xì)胞培養(yǎng)池。在常規(guī)條件下培養(yǎng)，頂側(cè)室0.5ml，基底側(cè)室加入1.5ml。在transwell板中培養(yǎng)細(xì)胞，隔天更換兩側(cè)細(xì)胞室的培養(yǎng)液，每天觀察細(xì)胞表面形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)使用細(xì)胞電阻儀測(cè)定細(xì)胞單層膜電阻(transepithelialelecteicalresistance,teer),當(dāng)電阻在250-350ω·cm2，表明其具有足夠得緊密鏈接和完整性，可用來(lái)進(jìn)行藥物吸收和機(jī)制研究。

(2)分別從ap-bl、bl-ap兩個(gè)方向考察葛根素、葛根素液晶納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況。實(shí)驗(yàn)前將單層細(xì)胞用hbss緩沖液小心清洗三次，然后加入37℃hbss緩沖液(ph7.2)孵育20min。

ap-bl方向：取濃度為200μg/ml的葛根素hbss緩沖液0.5ml，加入ap側(cè)作為供給池；同時(shí)取空白hbss緩沖液1.5ml，加入bl側(cè)，作為接受池。

bl-ap方向：取稀釋25倍的葛根素液晶納米粒hbss緩沖液1.5ml，加入bl側(cè)作為供給池；同時(shí)取空白hbss緩沖液0.5ml，加入ap側(cè)，作為接受池。

在30、60、90、120、150、180min時(shí)，從接受室中取樣，隨機(jī)加入相同體積的新鮮截至，ap-bl方向取樣600μl，bl-ap方向取樣200μl，hplc法測(cè)葛根素含量，計(jì)算表觀滲透系數(shù)(papp)和外排率er。

式中dq/dt為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)速率；a為聚碳酸脂膜面積；c為葛根素在供給池中的初始濃度。

papp(bl→ap)為基底側(cè)到細(xì)胞頂側(cè)的表觀滲透系數(shù)；papp(bl→ap)為細(xì)胞頂側(cè)到基底側(cè)的表觀滲透系數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以n＝3表示，采用sas9.0統(tǒng)計(jì)分析，組件數(shù)據(jù)差異比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，^*p<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2.pue和pue-lcn在mdck-mdr1單層膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)影響

液晶納米粒包封的葛根素納米粒稀釋25倍(約200μg/ml)后，葛根素在吸收方向的papp為1.333±0.1321×10-6cm·s^-1，外排papp為1.670±0.0944×10-6cm·s^-1，與相同濃度的葛根素相比分別提高了13.74％和25.93％，提示液晶納米?？梢源龠M(jìn)葛根素透過(guò)血腦屏障細(xì)胞，具有促進(jìn)葛根素腦部吸收的作用。

實(shí)驗(yàn)例6葛根素液晶納米粒宏觀、微觀形體觀察

制備得到pue-lcn外觀呈乳白色，穩(wěn)定性良好，分散均勻，無(wú)沉淀(圖1)。

通過(guò)投射電鏡可對(duì)液晶納米粒微觀形態(tài)進(jìn)行觀察。用1ml注射器吸取適量pue-lcn，分次滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，自然干燥后投射電鏡下觀察立方液晶納米粒在水中分散程度良好，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，分散均勻，結(jié)果見(jiàn)圖1。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例所述葛根素脂質(zhì)立方液晶納米粒的組成和制法如下：

原料組成為單油酸甘油酯(gmo)，泊洛沙姆407(f127)，5％甘油-水溶液，葛根素，維生素e醋酸酯的配方用量如下：

(1)制備配方量總量為100g。取單油酸甘油酯2g、泊洛沙姆4072.13g、維生素e醋酸酯1g，加入溶劑100ml無(wú)水乙醇，55℃熱水浴下溶解，減壓回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均勻分散在圓底燒瓶?jī)?nèi)壁；

(2)將促滲劑材料甘油加入蒸餾水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入0.5g的葛根素?zé)崴∪芙獠⒓又?00g；

(3)將水相加入油相，加入玻璃珠，在55℃，90r/min條件下旋轉(zhuǎn)混合至均勻。

(4)將上述液體探頭超聲3min(超聲4s，間隔3)，得到色澤均一無(wú)分層的乳白色液體。

實(shí)施例2

原料組成為單油酸甘油酯(gmo)，泊洛沙姆407(f127)，5％甘油-水溶液，葛根素，維生素e醋酸酯的配方用量如下：

(1)制備配方量總量為100g。取單油酸甘油酯4.5g、泊洛沙姆4075g、維生素e醋酸酯1g，加入溶劑100ml無(wú)水乙醇，55℃熱水浴下溶解，減壓回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均勻分散在圓底燒瓶?jī)?nèi)壁；

(2)將促滲劑材料甘油加入蒸餾水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入0.3g的葛根素?zé)崴∪芙獠⒓又?00g；

(3)將水相加入油相，加入玻璃珠，在60℃，70r/min條件下旋轉(zhuǎn)混合至均勻。

(4)將上述液體探頭超聲5min(超聲4s，間隔3s)，得到色澤均一無(wú)分層的乳白色液體。

實(shí)施例3

原料組成為單油酸甘油酯(gmo)，泊洛沙姆407(f127)，5％甘油-水溶液，葛根素，維生素e醋酸酯的配方用量如下：

(1)制備配方量總量為100g。取單油酸甘油酯4.5g、泊洛沙姆4071g、維生素e醋酸酯5g，加入溶劑100ml無(wú)水乙醇，55℃熱水浴下溶解，減壓回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均勻分散在圓底燒瓶?jī)?nèi)壁；

(2)將促滲劑材料甘油加入蒸餾水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入0.4g的葛根素?zé)崴∪芙獠⒓又?00g；

(3)將水相加入油相，加入玻璃珠，在60℃，110r/min條件下旋轉(zhuǎn)混合至均勻。

(4)將上述液體探頭超聲7min(超聲4s，間隔3s)，得到色澤均一無(wú)分層的乳白色液體。