本發(fā)明屬于中藥藥物提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的為一種具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
：山茶花(camelliajaponical.)為山茶科山茶屬紅山茶組植物，屬常綠闊葉林木本植物，又名茶花、山茶、耐冬，是中國(guó)十大名花之一。分布廣泛，資源豐富，主產(chǎn)于我國(guó)浙江、江蘇、云南、四川等，主要用于觀賞及美化環(huán)境。近年來(lái)，山茶花的藥用價(jià)值逐漸受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的抑菌、抗癌、止血、抗炎等活性。近年來(lái)，高血脂癥已成為全球人類健康的“第一殺手”，血脂異常對(duì)我國(guó)人民健康的危害程度已上升至原來(lái)的35倍。目前，考來(lái)烯胺和他汀類藥物是治療高血脂癥的常用西藥，但長(zhǎng)期服用，會(huì)帶來(lái)各種各樣的副作用，如膽損傷、惡心等，因此，從天然植物中尋找安全、高效的降血脂藥物，已成為科學(xué)研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。兒茶素和表兒茶素是茶葉的重要成分，一般都是從茶葉中提取而來(lái)的，具有防治心血管疾病、預(yù)防癌癥、抗氧化等多種功能，還具有抑制血壓(可降低舒張壓與收縮壓)及血糖(抑制醣分解酵素)、降低血中膽固醇等功能。兒茶素和表兒茶素不溶于氯仿和石油醚。中國(guó)專利號(hào)為2008100118991公開(kāi)了一種山茶花有效成分及其提取方法和用途，該專利的提取方法包括醇提—大孔樹(shù)脂分段純化或醇提—溶劑分段萃取—大孔樹(shù)脂純化或水提—醇沉—大孔樹(shù)脂分段純化，經(jīng)該方法，所得的提取物主要有效成分為黃酮、茶皂苷、苯乙醇苷，其含量分別為總黃酮1％～25％，總皂苷1％～20％，苯乙醇苷1％～3％，利用該有效成分生產(chǎn)加工數(shù)種制劑，將其作為治療和改善高血糖、高血脂、胃黏膜損傷等癥狀的藥物和功能性食品。然后，該發(fā)明并未明確哪種有效成分中何種化合物具有降血糖、降血脂，治療胃黏膜損傷的作用，而且制備得到的黃酮、茶皂苷、苯乙醇苷的含量低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制備方法。一種具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制備方法，包括以下步驟：①稱取山茶花花瓣于圓底燒瓶中，加20～60倍體積比為95％的乙醇回流提取1～3小時(shí)，得提取液，提取液用3～5層紗布過(guò)濾后減壓濃縮，烘干得膏狀提取物；②將上述提取物用30～60℃溫水懸浮分散，然后用石油醚萃取4～6次，得到上層溶液a和下層溶液a；下層溶液a再用氯仿萃取4～6次，得到上層溶液b和下層溶液b；下層溶液b再用乙酸乙酯萃取4～6次，得到上層溶液c和下層溶液c；合并每次的上層溶液c，下層溶液c再用水飽和正丁醇萃取4～6次，得到上層溶液d和下層溶液d，合并每次的上層溶液d；③將上述上層溶液c、上層溶液d分別減壓蒸發(fā)濃縮，然后在50～65℃溫度下烘干至恒重，得相應(yīng)的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；④將上述的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物混合均勻即為具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物。所述的步驟②中的溫水溫度優(yōu)選的為50℃，膏狀提取物水懸浮分散后才可以用溶劑進(jìn)行萃取，發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用溫水比冷水懸浮分散效果更好、更快，而50℃的溫水效果是最好，懸浮分散最徹底的。所述的步驟③中的烘干溫度優(yōu)選的為55℃，過(guò)高的烘干溫度會(huì)破壞提取物中的活性成分，溫度過(guò)低，又會(huì)延長(zhǎng)烘干時(shí)間，故經(jīng)過(guò)發(fā)明人創(chuàng)造性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)烘干溫度在55℃最為合適。一種具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物，通過(guò)上述的方法制得，其中乙酸乙酯提取物中兒茶素的含量為7～11％，表兒茶素52～67％，其中正丁醇提取物中兒茶素的含量為10～18％，表兒茶素31～53％。所述的乙酸乙酯提取物在選用agilent6110四級(jí)桿質(zhì)譜儀，離子源為電噴霧離子源(esi)，離子化模式為正離子化模式(esi+)，毛細(xì)管電壓為3000v，干燥氣用n2，霧化器流量12l/min，霧化器壓力35.0psi，干燥器溫度350℃，質(zhì)量掃描范圍100～1000m/z，碰撞誘導(dǎo)解離電壓70v/100v為檢測(cè)條件下，兒茶素的含量為7～11％，表兒茶素52～67％。所述的乙酸乙酯提取物在選用agilent6110四級(jí)桿質(zhì)譜儀，離子源為電噴霧離子源(esi)，離子化模式為正離子化模式(esi+)，毛細(xì)管電壓為3000v，干燥氣用n2，霧化器流量12l/min，霧化器壓力35.0psi，干燥器溫度350℃，質(zhì)量掃描范圍100～1000m/z，碰撞誘導(dǎo)解離電壓70v/100v為檢測(cè)條件下，兒茶素的含量為10～18％，表兒茶素31～53％。本發(fā)明的第二目的在于提供一種包含具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物藥物組合物。一種山茶花花瓣提取物藥物組合物，由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物5～10份，苦瓜粉3～6份，桑葚提取物2～5份，決明子粉1～1.6份，山楂提取物2～4.5份，芹菜提取物1.5～2.5份，何首烏提取物1～3份，大豆渣3～5份，甜葉菊2～3份。一種山茶花花瓣提取物藥物組合物，由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物6～8份，苦瓜粉4～5.5份，桑葚提取物3～4.5份，決明子粉1.1～1.5份，山楂提取物2.5～4份，芹菜提取物1.8～2.2份，何首烏提取物1.5～2.5份，大豆渣3.5～4.5份，甜葉菊2.2～2.8份。一種山茶花花瓣提取物藥物組合物，由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物6.5～7.5份，苦瓜粉4.5～5份，桑葚提取物3.5～4份，決明子粉1.2～1.4份，山楂提取物2.5～3.5份，芹菜提取物1.9～2.1份，何首烏提取物1.6～2.3份，大豆渣3.7～4.3份，甜葉菊2.4～2.6份一種山茶花花瓣提取物藥物組合物，由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物7份，苦瓜粉4.8份，桑葚提取物3.7份，決明子粉1.3份，山楂提取物3，芹菜提取物2份，何首烏提取物2份，大豆渣4份，甜葉菊2.5份。山茶花花瓣提取物中含量豐富的兒茶素和表兒茶素，因此具有很好的抑制血壓(可降低舒張壓與收縮壓)及血糖(抑制醣分解酵素)、降低血中膽固醇等功能?？喙现泻休^多的苦瓜皂甙，可刺激胰島素釋放，有非常明顯的降血糖作用，苦瓜中維生素b1、維生素c和多種礦物質(zhì)的含量都比較豐富，能調(diào)節(jié)血脂、提高機(jī)體免疫力的作用，又有“植物胰島素”的美稱。桑椹中的脂肪酸具有分解脂肪、降低血脂，防止血管硬化等作用。決明子具有清熱平肝、降脂降壓、潤(rùn)腸通便、明目益睛之功效，也具有抑制血清膽固醇升高和動(dòng)脈硬化斑塊形成的作用山楂含山楂酸、酒石酸、檸檬酸等物質(zhì)，有擴(kuò)張血管、降低血壓、降低膽固醇、增加胃液消化酶等作用。何首烏能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，減少膽固醇吸收，加快膽固醇排泄，從而起到降低血脂、抗動(dòng)脈硬化的作用。豆渣中的膳食纖維具有明顯的降低血漿膽固醇、調(diào)節(jié)胃腸功能及胰島素水平等功能。甜葉菊是一種低熱量、高甜度的天然甜味劑，同時(shí)還具有具有調(diào)節(jié)血壓、軟化血管、降低血脂、降血糖、尿糖、抑菌止血、鎮(zhèn)痛、減肥養(yǎng)顏、養(yǎng)陰生津、幫助消化，促進(jìn)胰腺、脾胃功能和清熱解毒的功能。因此本發(fā)明的山茶花花瓣提取物藥物組合物具有很好的降血脂的功能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單易行，提取充分。(2)本發(fā)明采用多級(jí)萃取的方式進(jìn)行，去除其他的雜質(zhì)，制備方法得到的兒茶素和表兒茶素純度高、含量高。(3)本發(fā)明的提供的山茶花花瓣提取物藥物組合物，組分天然無(wú)毒不添加其他人工合成組分，因此保持了綠色天然的特性。(4)本發(fā)明的提供的山茶花花瓣提取物藥物組合物口感好，組合物中添加了甜葉菊可以抵消苦瓜帶來(lái)的苦味，使得山茶花花瓣提取物藥物組合物具有甜葉菊的甘甜。附圖說(shuō)明圖1為山茶花花瓣乙酸乙酯提取物質(zhì)譜圖；圖2為山茶花花瓣正丁醇提取物質(zhì)譜圖；圖3為山茶花花瓣乙酸乙酯提取物hplc圖；圖4為山茶花正丁醇提取物hplc圖；圖5兒茶素、表兒茶素標(biāo)品在乙酸乙酯萃取洗脫條件下的hplc圖；圖6兒茶素、表兒茶素標(biāo)品在正丁醇萃取洗脫條件下的hplc圖；具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例，結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說(shuō)明：實(shí)施例1：一種具有降血脂功能的山茶花花瓣提取物的制備方法①稱取山茶花花瓣于圓底燒瓶中，加20～60倍體積比為95％的乙醇回流提取1～3小時(shí)，得提取液，提取液用3～5層紗布過(guò)濾后減壓濃縮，烘干得膏狀提取物；②將上述提取物用30～60℃溫水懸浮分散，然后用石油醚萃取4～6次，得到上層溶液a和下層溶液a，合并每次的上層溶液a；下層溶液a再用氯仿萃取4～6次，得到上層溶液b和下層溶液b，合并每次的上層溶液b；下層溶液b再用乙酸乙酯萃取4～6次，得到上層溶液c和下層溶液c，合并每次的上層溶液c；下層溶液c再用水飽和正丁醇萃取4～6次，得到上層溶液d和下層溶液d，合并每次的上層溶液d；③將上述上層溶液a、上層溶液b、上層溶液c、上層溶液d和下層溶液d分別減壓蒸發(fā)濃縮，然后在50～65℃溫度下烘干至恒重，得相應(yīng)的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和蒸餾水提取物；④將上述的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物混合均勻即為用于治療降血脂的山茶花花瓣提取物。實(shí)施例2～4：各種山茶花花瓣提取物對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力的測(cè)定膽固醇降解為膽汁酸排出體外是體內(nèi)膽固醇降解的主要途徑，而人體95％以上的膽汁酸在排入腸道后，而被重吸收再次進(jìn)行腸肝循環(huán)，剩余5％左右的膽汁酸便隨糞便排外。如果膽汁酸被結(jié)合，則無(wú)法經(jīng)腸肝循環(huán)再次返回肝臟，肝臟就會(huì)大量降解膽固醇，從而可以達(dá)到降血脂的目的。正常人膽汁中膽汁酸可分為游離型(脫氧膽酸和膽酸)和結(jié)合型(膽酸和脫氧膽酸等與?；撬?、甘氨酸的結(jié)合產(chǎn)物)兩種，但約90％左右的膽汁酸均為結(jié)合型膽汁酸，即以膽酸鹽形式在體內(nèi)存在。因此，本次測(cè)定選擇具有代表性的?；悄懰徕c(stc)、甘氨膽酸鈉(sgc)和膽酸鈉(sc)作為吸附結(jié)合對(duì)象。同時(shí)，選取降血脂藥物的主要成分考來(lái)烯胺對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力做對(duì)比。測(cè)定方法：分別稱取乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、蒸餾水提取物、氯仿提取物、石油醚提取物及考來(lái)烯胺各100mg于5只10ml具塞試管中，然后加入0.01mol/lhcl溶液1ml，37℃恒溫振蕩消化1h后，以0.1mol/lnaoh溶液調(diào)節(jié)ph值為6.3，隨后加入10mg/ml的胰酶5ml，胰酶用ph值6.3的0.1mol/lh3po4緩沖液配制，37℃恒溫振蕩消化1h，然后加入4ml?；悄懰徕c(stc)或甘氨膽酸鈉(sgc)或膽酸鈉(sc)標(biāo)準(zhǔn)溶液，37℃恒溫振蕩1h，之后4000rpm離心20min，取上清液。以膽酸鹽的減少量評(píng)價(jià)山茶花花瓣各提取物結(jié)合膽酸鹽能力，即各提取物的降血脂能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1山茶花花瓣各提取物對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力注：同列肩標(biāo)字母不同，表示有顯著性差異(p≤0.05)將降血脂藥物的主要成分考來(lái)烯胺對(duì)膽酸鹽的吸附率設(shè)定為100％，山茶花五種萃取提取物結(jié)合膽酸鹽的能力如表1所示。結(jié)果顯示，山茶花花瓣五種提取物對(duì)三種膽酸鹽均具有一定的結(jié)合能力。結(jié)合牛磺膽酸鈉和膽酸鈉能力大小依次為：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞蒸餾水提取物＞石油醚提取物＞氯仿提取物；結(jié)合甘氨膽酸鈉能力大小依次為：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞蒸餾水提取物＞氯仿提取物。其中，乙酸乙酯和正丁醇提取物結(jié)合三種膽酸鹽的能力均遠(yuǎn)高于蒸餾水、石油醚和氯仿提取物，表明山茶花花瓣乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物物中含有較強(qiáng)結(jié)合膽酸鹽的功能活性成分。這與兒茶素和表兒茶素不溶于石油醚和氯仿的性質(zhì)也是吻合的，因此采用實(shí)施例1的方法制備得到山茶花花瓣萃取提取物中兒茶素和表兒茶素的含量高，這是因?yàn)楸景l(fā)明采用的是多級(jí)萃取的方式進(jìn)行的，使得山茶花花瓣提取物中其他物質(zhì)溶解在了石油醚和氯仿中了，導(dǎo)致乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物中兒茶素和表兒茶素的含量和純度提高。實(shí)施例5～7：兒茶素和表兒茶素單體對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力的測(cè)定檢測(cè)方法同實(shí)施例2～4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2為兒茶素和表兒茶素對(duì)膽酸鹽的結(jié)合能力注：同列肩標(biāo)字母不同，表示有顯著性差異(p≤0.05)以降血脂藥物的主要成分考來(lái)烯胺對(duì)膽酸鹽的吸附率為100％，可知，表兒茶素和兒茶素單體對(duì)三種膽酸鹽均具有很強(qiáng)的結(jié)合作用，是同劑量考來(lái)烯胺的1～2倍，因此兒茶素、表兒茶素具有很好的降血脂作用。實(shí)施例5～7結(jié)合實(shí)施例2～4，對(duì)比表1和表2可以清楚的反映出，山茶花花瓣乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物具有很好的結(jié)合膽酸鹽能力是因?yàn)橐宜嵋阴ヌ崛∥锖蜕讲杌ɑò暾〈继崛∥镏袃翰杷睾捅韮翰杷氐暮扛?。因此乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物混合均勻后的山茶花花瓣提取物具有良好的降血脂功能。?shí)施例8～9：山茶花花瓣乙酸乙酯提取物和山茶花花瓣正丁醇提取物中兒茶素和表兒茶素含量的測(cè)定。山茶花花瓣乙酸乙酯提取物中兒茶素和表兒茶素含量檢測(cè)方法：通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用(lc-ms)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，選用色譜柱為hypersilbds-c18，柱溫25℃，流速0.5ml/min，進(jìn)樣量20μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；流動(dòng)相為a甲醇，流動(dòng)相b為1％乙酸水溶液，洗脫梯度為：0～5min流動(dòng)相a25～60％，5～10min流動(dòng)相a60～65％，10～22min流動(dòng)相a65％；選用agilent6110四級(jí)桿質(zhì)譜儀，離子源為電噴霧離子源(esi)，離子化模式為正離子化模式(esi+)，毛細(xì)管電壓為3000v，干燥氣用n2，霧化器流量12l/min，霧化器壓力35.0psi，干燥器溫度350℃，質(zhì)量掃描范圍100～1000m/z，碰撞誘導(dǎo)解離電壓70v/100v。山茶花花瓣正丁醇提取物中兒茶素和表兒茶素含量檢測(cè)方法：通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用(lc-ms)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，選用色譜柱為hypersilbds-c18，柱溫25℃，流速0.5ml/min，進(jìn)樣量20μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；流動(dòng)相為a甲醇，流動(dòng)相b為1％乙酸水溶液，洗脫梯度為：0～5min流動(dòng)相a25～50％，5～8min流動(dòng)相a50～55％，8～13min流動(dòng)相a55～85％，13～26min流動(dòng)相a85％；選用agilent6110四級(jí)桿質(zhì)譜儀，離子源為電噴霧離子源(esi)，離子化模式為正離子化模式(esi+)，毛細(xì)管電壓為3000v，干燥氣用n2，霧化器流量12l/min，霧化器壓力35.0psi，干燥器溫度350℃，質(zhì)量掃描范圍100～1000m/z，碰撞誘導(dǎo)解離電壓70v/100v。實(shí)施例8和實(shí)施例9的質(zhì)譜圖分別如圖1和圖2所示，從圖1和圖2可以看出，山茶花乙酸乙酯提取物和山茶花正丁醇提取物中均有多種物質(zhì)存在，均有正離子峰([m-h]+或[m-na]+)的質(zhì)荷比(m/z)均為291的分子離子峰存在，即圖1和圖2所對(duì)應(yīng)的是相對(duì)分子質(zhì)量均為290或268的分子，而多酚中兒茶素和表兒茶素相對(duì)分子質(zhì)量為290，與圖1和圖2的質(zhì)譜圖中的信息剛好吻合。實(shí)施例8和實(shí)施例9的hplc圖分別為圖3和圖4所示，兒茶素、表兒茶素標(biāo)品在乙酸乙酯萃取洗脫條件下和在正丁醇萃取洗脫條件下的hplc圖分別為圖5和圖6。對(duì)比圖3和圖5，發(fā)現(xiàn)圖5兒茶素標(biāo)品的出峰時(shí)間為9.775min，表兒茶素標(biāo)品的出峰時(shí)間為10.785min，因此圖3中出峰時(shí)間為9.773min的為兒茶素，出峰時(shí)間為10.773min的為表兒茶素，采用面積歸一化法測(cè)得兒茶素和表兒茶素的含量分別占總樣品量的7.65％和52.14％。對(duì)比圖4和圖6，發(fā)現(xiàn)圖6中兒茶素標(biāo)品的出峰時(shí)間為10.486min，表兒茶素標(biāo)品的出峰時(shí)間為11.881min，因此圖4中出峰時(shí)間為10.412min的為兒茶素，出峰時(shí)間為11.815min的為表兒茶素，采用面積歸一化法測(cè)得兒茶素和表兒茶素的含量分別占總樣品量的11.72％和31.37％。對(duì)比例1：選用中國(guó)專利號(hào)為2008100118991公開(kāi)了的方法制備得到的山茶花有效提取物。對(duì)比例2：選用中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?015102673547公開(kāi)的方法制備得到的金花茶花提取物。對(duì)比例3：采用實(shí)施例8～9相同的檢測(cè)方法檢測(cè)對(duì)比例1～2的提取物中兒茶素和表兒茶素的含量。表3為實(shí)施例8～9和對(duì)比例1～2的提取物中兒茶素和表兒茶素的含量實(shí)施例8實(shí)施例9對(duì)比例1對(duì)比例2兒茶素含量7.65％11.72％1.26％3.5％表兒茶素含量52.14％31.37％0％10.5％由表3數(shù)據(jù)可以看出，對(duì)比例1中只含有表兒茶素，對(duì)比例2中雖然含有兒茶素和表兒茶素，但本發(fā)明的山茶花花瓣提取物兒茶素和表兒茶素的含量明顯高于對(duì)比例1和對(duì)比例2的茶花提取物，說(shuō)明本發(fā)明的山茶花花瓣提取物中具有降血脂功能的兒茶素和表兒茶素全面且含量高。實(shí)施例10：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物藥物組合物。由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物5份，苦瓜粉3份，桑葚提取物2份，決明子粉1份，山楂提取物2份，芹菜提取物1.5份，何首烏提取物1份，大豆渣3份，甜葉菊2份。實(shí)施例11：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物藥物組合物。由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物7份，苦瓜粉5份，桑葚提取物4份，決明子粉1.3份，山楂提取物3，芹菜提取物2份，何首烏提取物2份，大豆渣4份，甜葉菊2.5份。實(shí)施例12：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物藥物組合物。由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物8份，苦瓜粉5.5份，桑葚提取物4.5份，決明子粉1.4份，山楂提取物3.5份，芹菜提取物2.2份，何首烏提取物2.5份，大豆渣4.5份，甜葉菊2.8份。實(shí)施例13：含有山茶花花瓣提取物的山茶花花瓣提取物藥物組合物。由如下重量份的組分組成：山茶花花瓣提取物10份，苦瓜粉6份，桑葚提取物5份，決明子粉1.6份，山楂提取物4.5份，芹菜提取物2.5份，何首烏提取物3份，大豆渣5份，甜葉菊3份。本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12