本發(fā)明涉及藥理學(xué)和化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及促生長激素釋放激素激動(dòng)劑在制備抗血管鈣化藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血管鈣化(vascularcalcification，vc)是一種以血管內(nèi)膜及中層鈣鹽沉積為特征的疾病，與多種疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病及慢性腎病存在密切聯(lián)系，嚴(yán)重影響這些疾病的預(yù)后。早期的研究認(rèn)為動(dòng)脈鈣化主要是被動(dòng)的鈣、磷酸鹽沉著。然而，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈鈣化過程與骨礦化之間存在相似性，不只是被動(dòng)地鈣鹽沉積，更多的是平滑肌細(xì)胞在應(yīng)激環(huán)境下向成骨樣細(xì)胞分化，導(dǎo)致鈣化的持續(xù)發(fā)展。同時(shí)，目前依舊缺乏有效治療動(dòng)脈鈣化的藥物。

促生長激素釋放激素(growthhormonereleasehormone,ghrh)是一種神經(jīng)多肽，由下丘腦分泌，經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)進(jìn)入后與垂體細(xì)胞表面促生長激素釋放激素受體結(jié)合，促進(jìn)生長激素釋放。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)該受體不僅僅表達(dá)于垂體，同時(shí)也表達(dá)在諸如心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞表面。人工合成的促生長激素釋放激素激動(dòng)劑(ghrh-a)比天然的ghrh更加穩(wěn)定，因此已經(jīng)在多種疾病模型中被證明有較好的治療效果，如心肌梗死、糖尿病及肺損傷等。此外，用ghrh-a預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療下肢缺血能力。然而，關(guān)于ghrh-a的用途仍有待于進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷與不足，提供促生長激素釋放激素激動(dòng)劑(ghrh-a)在醫(yī)學(xué)上的一種新用途，即提供促生長激素釋放激素激動(dòng)劑在制備抗血管鈣化藥物中的應(yīng)用，所述促生長激素釋放激素激動(dòng)劑能提高平滑肌細(xì)胞中camp水平和蛋白激酶a活性，降低平滑肌細(xì)胞napdh氧化酶表達(dá)和活性，降低平滑肌細(xì)胞中ros的水平，減少主動(dòng)脈中鈣沉積和磷沉積，和減少主動(dòng)脈中alp活性。

ghrh-a以hghrh的1-29位氨基酸(人ghrh1-44位氨基酸如seqidno.1所示)為骨架，進(jìn)行特定位點(diǎn)氨基酸的替換或者修飾，ghrh-a的序列如表1所示。其中，mr-326/327/502/502包含30個(gè)氨基酸，而mr-702則含有31個(gè)氨基酸。首行中的數(shù)字代表對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)，“—”表示該氨基酸位點(diǎn)與hghrh中的相同。

表1：ghrh-a的序列：

其中，n-me-tyr指酪氨酸n端存在甲基化，本發(fā)明中的ghrh-a還包括其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物。

本發(fā)明所提供的ghrh-a的新用途是ghrh-a或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物等藥物組合在治療或預(yù)防血管鈣化中的應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ghrh-a可以提高平滑肌細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷(camp)水平和平滑肌細(xì)胞蛋白激酶a(pka)活性，降低平滑肌細(xì)胞napdh氧化酶表達(dá)和活性，降低平滑肌細(xì)胞中活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ros)的水平，降低平滑肌細(xì)胞中runx2表達(dá)和活性及細(xì)胞堿性磷酸酶(alp)表達(dá)和活性，以及降低體內(nèi)血液中無機(jī)磷的含量，從而減少主動(dòng)脈中鈣沉積和磷沉積，減少主動(dòng)脈中alp活性，達(dá)到治療或預(yù)防血管鈣化、動(dòng)脈硬化的目的。

所述藥物為凍干粉針、注射液、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、糖漿、軟膠囊、藥膏或貼劑。

所述藥物可通過注射、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。必要時(shí)在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。

所述血管鈣化包括所有涉及鈣鹽在血管壁及心臟瓣膜的沉積為特征的血管及瓣膜病變。

本發(fā)明ghrh-a治療心血管疾病(如血管鈣化、動(dòng)脈硬化、心肌病等)藥物的藥理機(jī)制，包括1)ghrh-a可以治療或預(yù)防血管鈣化。2)ghrh-a可以治療或預(yù)防動(dòng)脈硬化。3)ghrh-a可以治療或預(yù)防平滑肌細(xì)胞鈣化。4)ghrh-a可以提高平滑肌細(xì)胞中camp水平。5)ghrh-a可以提高平滑肌細(xì)胞pka活性。6)ghrh-a可以降低平滑肌細(xì)胞napdh氧化酶表達(dá)和活性。7)ghrh-a可以降低平滑肌細(xì)胞中ros的水平。8)ghrh-a可以降低平滑肌細(xì)胞runx2表達(dá)和活性。9)ghrh-a可以降低平滑肌細(xì)胞堿性磷酸酶(alp)表達(dá)和活性。10)ghrh-a可以降低體內(nèi)血液中無機(jī)磷的含量。11)ghrh-a可以減少主動(dòng)脈中鈣沉積。12)ghrh-a可以減少主動(dòng)脈中磷沉積。13)ghrh-a可以減少主動(dòng)脈中alp活性。

本發(fā)明利用體外細(xì)胞培養(yǎng)鈣化模型及體內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠(opg^-/-，自發(fā)動(dòng)脈鈣化小鼠)模型檢測ghrh-a，mr409，證實(shí)了促生長激素釋放激素激動(dòng)劑在抑制鈣化中的作用。

實(shí)驗(yàn)證明，ghrh-a(mr409)可以顯著抑制平滑肌細(xì)胞在體外的鈣化過程，抑制成骨相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ghrh-a降低血磷水平，減少動(dòng)脈鈣化面積。

如圖1所示，是ghrh-a抑制平滑肌細(xì)胞體外鈣化示意圖。其中，a)小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外β-gp誘導(dǎo)鈣化后行茜素紅染色；b)鈣化統(tǒng)計(jì)圖，縱坐標(biāo)為a中染料萃取后的吸光度值。c)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外鈣化誘導(dǎo)；d)鈣化統(tǒng)計(jì)圖，縱坐標(biāo)為c中染料萃取后的吸光度值。pi：β-甘油磷酸(β-glycerophosphoricacid)，mr409即ghrh-a，mia602即ghrh拮抗劑(ghrhantagonist)。從圖中可以得出：ghrh-a(mr409)，可以抑制β-磷酸甘油(β-gp，pi)誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞鈣化。

如圖2所示，是ghrh-a抑制平滑肌細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)及活性示意圖。，鈣化過程中鈣鹽沉積(a)減少，alp活性(b)增強(qiáng)，runx2的表達(dá)增加，包括mrna水平(e)和蛋白水平(c，d)，可被ghrh-a抑制。從圖中可得出：ghrh-a可顯著抑制成骨相關(guān)蛋白runx2表達(dá)及堿性磷酸酶(alp)活性。

圖3是高磷誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激示意圖。平滑肌細(xì)胞處于高磷環(huán)境時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ros含量顯著增加(圖4a)，流式檢測熒光強(qiáng)度顯示mr409抑制高磷誘導(dǎo)的ros增加。a)dhe染色檢測ros情況，紅色越濃提示ros含量越高。b)將a中細(xì)胞消化后進(jìn)行流式檢測，定量分析熒光強(qiáng)度。nc：空白對(duì)照組；pi：添加有10mmβ-磷酸甘油；pi+mr409：10mmβ-磷酸甘油+10nm的ghrh-a；pi+mr409+mia602：10mmβ-磷酸甘油+10nm的ghrh-a+100nm的ghrh-antagonist。從圖中可得出：ghrh-a可抑制高磷誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞ros含量增加。

圖4是ghrh-a抑制opg^-/-小鼠主動(dòng)脈鈣化示意圖。a)ghrh-a干預(yù)4周后收集主動(dòng)脈，行micro-ct掃描，ghrh-a可顯著抑制鈣鹽在主動(dòng)脈的沉積。b)micro-ct統(tǒng)計(jì)結(jié)果。c)主動(dòng)片石蠟切片后茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)ghrh-a減少主動(dòng)脈環(huán)上的鈣結(jié)節(jié)；d)染色陽性面積占總面積的比例。wt：野生型小鼠；opg-nc：opg^-/-小鼠溶劑對(duì)照組；opg-mr409：opg^-/-小鼠+ghrh-a。從圖中可得出：ghrh-a可抑制opg^-/-小鼠動(dòng)脈鈣化程度。

圖5是ghrh-a減少opg^-/-小鼠主動(dòng)脈中的鈣磷沉積、alp活性及血磷水平示意圖。a)主動(dòng)脈鈣含量；b)主動(dòng)脈磷含量；c)主動(dòng)脈alp活性；e)血磷水平。從圖中可得出：ghrh-a降低opg^-/-小鼠血磷濃度，減少主動(dòng)脈中的鈣磷沉積及alp活性。

圖6是ghrh激動(dòng)劑預(yù)處理smcs(平滑肌細(xì)胞)示意圖。提高smcs中camp濃度(a)，降低napdh氧化酶活性(c，d)，和ros水平(b)。mr409的效果都會(huì)被pka抑制劑h89消除，表明ghrh-a降低napdh氧化酶活性及ros水平都與pka活性相關(guān)。從圖中可得出：ghrh-a可以提高平滑肌細(xì)胞中camp水平，降低napdh氧化酶表達(dá)和活性，ros水平。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明藥物形式推薦凍干粉針，以0.1％dmso+10％丙二醇作為溶劑，使用方式為皮下注射。在該注射濃度下，促生長激素釋放激素激動(dòng)劑表現(xiàn)出了抗血管鈣化的特性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血管鈣化病理進(jìn)程的干預(yù)和病理癥狀的改善。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1是ghrh-a抑制平滑肌細(xì)胞體外鈣化示意圖。

圖2是ghrh-a抑制平滑肌細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)及活性示意圖。

圖3是高磷誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激示意圖。

圖4是ghrh-a抑制opg^-/-小鼠主動(dòng)脈鈣化示意圖。

圖5是ghrh-a減少opg^-/-小鼠主動(dòng)脈中的鈣磷沉積、alp活性及血磷水平示意圖。

圖6是ghrh激動(dòng)劑預(yù)處理smcs(平滑肌細(xì)胞)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。其中促生長激素釋放激素激動(dòng)劑(ghrh-a，mr409)及拮抗劑(ghrh-anta，mia602)由universityofmiami,andrewv.schally提供。

mr409氨基酸序列：n-me-tyr—d-ala—asp—ala—ile—phe—thr—asn—ser—tyr—arg—orn—val—leu—abu—gln—leu—ser—ala—arg—orn—leu—leu—gln—asp—ile—nle—asp—arg-nhch3。(n-甲基酪氨酸—d-丙氨酸—天冬氨酸—丙氨酸—異亮氨酸—苯丙氨酸—蘇氨酸—天冬酰胺—絲氨酸—酪氨酸—精氨酸—鳥氨酸—纈氨酸–亮氨酸—2-氨基丁酸—谷氨酰胺—亮氨酸—絲氨酸—丙氨酸—精氨酸—鳥氨酸—亮氨酸—亮氨酸—谷氨酰胺—天冬氨酸—異亮氨酸—正亮氨酸—天冬氨酸—精氨酸-nhch3)。

實(shí)施例1：檢測ghrh-a在平滑肌細(xì)胞體外鈣化的作用

實(shí)施流程：6-8周齡c57bl/6雄性小鼠(購于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)異氟烷麻醉后處死獲取胸主動(dòng)脈，經(jīng)膠原酶及彈力酶聯(lián)合消化后鋪板培養(yǎng)，選取3-5代平滑肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。在12孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)，分組為：(a)對(duì)照組，(b)成骨培養(yǎng)基組，(c)成骨培養(yǎng)基+ghrh-a組，(d)成骨培養(yǎng)基+ghrh-a——ghrh-anta。ghrh-a及ghrh-anta溶解于dmso(sigma，usa)中，以1000x母液儲(chǔ)存。ghrh-a工作濃度為10nm，ghrh-anta工作濃度為100nm。誘導(dǎo)14天后行鈣化染色，即茜素紅(賽業(yè)生物科技，中國)染色，并定量。在加入ghrh-a后，平滑肌鈣化誘導(dǎo)后的鈣結(jié)節(jié)顯著減少，定量分析顯示，茜素紅od值顯著降低，從成骨培養(yǎng)基組的0.92±0.05降低到0.53±0.02。如圖1所示。

免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)runx2蛋白表達(dá)水平。同前述誘導(dǎo)方案，收集d14蛋白，20μg蛋白樣品在10～15％(v/v)sds-page梯度膠用mini-gelsystem(bio-rad，piscataway，usa)電泳分離，用hoefertransfertank(bio-rad，piscataway，usa)將蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜(bio-rad，usa)上，膜置于緩沖液[tris緩沖鹽溶液，含0.1％(v/v)tween-20(tbs-t)，7％(w/w)牛奶，ph7.6]室溫下封閉2h，加入相應(yīng)一抗(1:1000,cellsignaling，usa)于4℃條件下孵育過夜，anti-gapdh(kc-5g5,kangchen,china)作為蛋白上樣對(duì)照；膜用0.5％(v/v)tbs-t洗滌后室溫下與結(jié)合辣根過氧化物酶的抗兔igg(santacruztechnology，usa)孵育2小時(shí)，最后tbs-t及tbs洗滌后用ecl溶液顯色(bio-rad,usa)，掃描后用imagepro5.2軟件分析信號(hào)。結(jié)果顯示：ghrh-a可以抑制平滑肌細(xì)胞在成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，且這種抑制作用可以被ghrh-anta阻斷(如圖2所示)。

實(shí)施例2：檢測ghrh-a對(duì)體外主動(dòng)脈鈣化的作用

實(shí)施流程：8周齡c57bl/6野生型小鼠及同周齡opg^-/-小鼠(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院單鵬飛課題組贈(zèng)予)進(jìn)行如下分組：(a)野生型小鼠，(b)opg^-/-小鼠，(c)opg^-/-小鼠+ghrh-a。ghrh-a用0.1％dmso+10％丙二醇溶解。ghrh-a的使用劑量為5μg/d，皮下注射，連續(xù)干預(yù)4周。4周后安樂死小鼠，留取血液樣本及主動(dòng)脈。主動(dòng)脈用10％多聚甲醛浸泡24小時(shí)后用d-pbs洗凈，進(jìn)行micro-ct掃描檢測(yuebobiotechnology,china)。結(jié)果顯示：野生型小鼠主動(dòng)脈幾乎無鈣化灶，而opg^-/-小鼠可見顯著的鈣化結(jié)節(jié)，而在使用ghrh-a組，主動(dòng)脈鈣化結(jié)節(jié)減少。如圖3所示。

小鼠全血經(jīng)5000rpm*10min離心后，收集血清，測定血磷水平。結(jié)果顯示，opg^-/-小鼠外周血中磷離子濃度顯著升高，而在ghrh-a處理后的opg^-/-小鼠血清中，磷離子濃度降至幾乎與野生型小鼠同一水平。如圖4所示。

序列表

<110>余紅

<120>促生長激素釋放激素激動(dòng)劑在制備抗血管鈣化藥物中的應(yīng)用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>prt

<213>ghrh

<400>1

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2025