本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法。

背景技術(shù)：

角膜內(nèi)皮是附著于后彈力層(descemet'smembrane)的六角形單層細(xì)胞，通過其主動(dòng)液泵功能維持角膜透明和正常的角膜厚度。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力極為有限，受損后主要由損傷區(qū)周邊細(xì)胞的擴(kuò)展移行進(jìn)行修復(fù)。各種原因如fuch角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良、外傷、手術(shù)或炎癥等均會(huì)引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷，當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度低于500-1500個(gè)/mm2時(shí)即發(fā)生角膜內(nèi)皮功能失代償，導(dǎo)致角膜水腫渾濁，呈現(xiàn)大皰型角膜病變，帶后彈力層的角膜內(nèi)皮移植或帶板層角膜的內(nèi)皮細(xì)胞移植是此類患者重建光明的希望，但角膜供體的來源匱乏嚴(yán)重制約了臨床角膜內(nèi)皮功能失代償?shù)闹委?。近年來，干?xì)胞的誘導(dǎo)分化和生物工程材料研究發(fā)展迅猛。將人多能干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,esc)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcell,ipsc)或間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，msc)進(jìn)行誘導(dǎo)分化后，接種于生物工程支架材料上，通過體外模擬生理構(gòu)造和細(xì)胞外環(huán)境，從而獲得用于再生醫(yī)學(xué)治療的目的組織器官已有多項(xiàng)報(bào)道。目前，豬的多種脫細(xì)胞組織材料已成功應(yīng)用于組織工程器官再造領(lǐng)域的研究，脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)材料已在動(dòng)物水平和臨床應(yīng)用中取得了初步的治療效果，但全層或厚板層豬角膜基質(zhì)并不適合角膜內(nèi)皮移植，會(huì)造成角膜不合格影響屈光，因此，體外構(gòu)建組織工程化的角膜內(nèi)皮是當(dāng)前臨床治療難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

申請(qǐng)人通過制備含有后彈力層的超薄脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)，聯(lián)合人多能干細(xì)胞來源角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程化角膜內(nèi)皮，不僅能夠解決角膜供體的來源問題，而且可以克服組織工程化角膜過厚不適合臨床治療的難題。

即本發(fā)明的第一目的在于提供一種體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法，包括以下步驟：

1)制備超薄脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)：切取豬角膜后基質(zhì)并保留后彈力層，去除豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞層，將脫內(nèi)皮細(xì)胞層的豬角膜后基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞面向上干燥、滅菌備用；

2)培養(yǎng)、誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞：將常規(guī)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)至適宜大小，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，至人多能干細(xì)胞克隆內(nèi)細(xì)胞體積變大、細(xì)胞形態(tài)由圓形或卵圓形變?yōu)槎噙呅?，排列緊密，克隆周邊細(xì)胞呈梭形纖維狀，終止誘導(dǎo)；將終止誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞克隆消化后使用分化培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)備用；

3)構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮：將步驟1)獲得的豬角膜后基質(zhì)，加入包被液進(jìn)行包被，再將步驟2)獲得的誘導(dǎo)分化后的人多能干細(xì)胞接種于步驟1)獲得的豬角膜后基質(zhì)，貼壁培養(yǎng)后，更換新鮮分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得組織工程角膜內(nèi)皮。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，所述步驟1)中去除豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞層的方法為高靜壓處理破碎細(xì)胞后，加入添加了去垢劑和核酸酶的保護(hù)液震蕩脫細(xì)胞處理，然后于保護(hù)液中漂洗。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，所述步驟1)中所述高靜壓處理的壓力條件為100-600mpa，頻率為2-5次，每次1-2分鐘，總時(shí)間不超過10分鐘。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，所述步驟1)中所述保護(hù)液為添加有5-12g/l透明質(zhì)酸、5-20g/l硫酸軟骨素、3-10g/l低分子量右旋糖酐、2.5-5mg/l妥布霉素、ph值為7.2-7.4、ph值為7.2-7.4的pbs緩沖液；

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，所述核酸酶為dnasei酶；更優(yōu)選地，所述dnasei酶的濃度為100-2000u/ml；

更優(yōu)選地，所述去垢劑為十二烷基硫酸鈉，質(zhì)量體積比為0.2％-0.5％；

更優(yōu)選地，所述去垢劑與所述核酸酶聯(lián)合作用時(shí)間為2-4小時(shí)，處理溫度為20-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為100-150轉(zhuǎn)/分鐘；

更優(yōu)選地，所述步驟1)中在所述保護(hù)液漂洗的時(shí)間為2-5小時(shí)；

更優(yōu)選地，所述步驟1)中所述干燥為普通風(fēng)干或使用干燥器進(jìn)行脫水干燥；所述滅菌方法為輻照或加入抗生素藥物滅菌。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，所述步驟2)中所述適宜大小的人多能干細(xì)胞的大小為60-100個(gè)細(xì)胞/克隆。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，在所述步驟2)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加以下物質(zhì)制成：β-巰基乙醇、谷氨酰胺、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bfgf)、非必須氨基酸(neaa)、血清替代物(knockoutserumreplacement，ksr)、全反式維甲酸(ra)；

更優(yōu)選地，所述β-巰基乙醇濃度為0.1mm、谷氨酰胺濃度為0.1mm、bfgf濃度為4-8ng/ml、neaa為0.1mm、ksr濃度為總液體量的20％(體積分?jǐn)?shù))、ra濃度為0.5-2μm；

更優(yōu)選地，所述分化培養(yǎng)基為含rock抑制劑的5％dksfm培養(yǎng)基。

更優(yōu)選地，所述含rock抑制劑的5％dksfm培養(yǎng)基為在dksfm基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加fbs和rock抑制劑制成的，其濃度分別為總液體量的5％(體積分?jǐn)?shù))和5-20μm。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，所述步驟3)中所述包被液為層黏連蛋白液或復(fù)合包被液(fnccoatingmix)。；

更優(yōu)選地，所述層黏連蛋白液的濃度為1-10μg/ml；最優(yōu)選地，所述層黏連蛋白液為使用1×dpbs稀釋后的濃度，每次使用前新鮮配制，包被時(shí)間為于37℃1小時(shí)或4℃過夜；

優(yōu)選地，在本發(fā)明的體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法中，所述fnc為商品即用型，包被時(shí)間為接種細(xì)胞前，室溫包被1分鐘左右。

更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種體外構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮的方法，包括以下步驟：

1)制備超薄脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)：使用飛秒激光切取新鮮豬角膜后基質(zhì)保留后彈力層，標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞一側(cè)。切取的豬角膜后基質(zhì)密封在盛有保護(hù)液的塑料袋中，采用高靜壓處理破碎細(xì)胞；取出豬角膜后基質(zhì)，置于添加了去垢劑和核酸酶的保護(hù)液中進(jìn)行震蕩脫細(xì)胞處理，然后于保護(hù)液中漂洗2小時(shí)以上；漂洗完成后，將脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞面向上貼附于培養(yǎng)板，干燥后滅菌備用。

2)誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)至適宜大小即開始使用含有ra的誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)3-5天，鏡下可見人多能干細(xì)胞克隆擴(kuò)大并相接，克隆內(nèi)細(xì)胞體積變大、細(xì)胞形態(tài)由圓形或卵圓形變?yōu)槎噙呅?，排列緊密，克隆周邊細(xì)胞呈梭形纖維狀。將終止誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞克隆消化后使用含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)備用。

所述適宜大小的人多能干細(xì)胞克隆是指；倒置相差顯微鏡下約60-100個(gè)細(xì)胞/克隆，克隆大小均勻，密度適中。

所述含有ra的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在knockoutdmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加以下物質(zhì)制成：β-巰基乙醇、谷氨酰胺、bfgf、neaa、ksr、ra。添加后，β-巰基乙醇濃度為0.1mm、谷氨酰胺濃度為0.1mm、bfgf濃度為4-8ng/ml、neaa為0.1mm、ksr濃度為總液體量的20％(體積分?jǐn)?shù))、ra濃度為0.5-2μm。

所述含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基是在dksfm基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加fbs和rock抑制劑制成的。其濃度分別為總液體量的5％(體積分?jǐn)?shù))、5-20μm。

3)體外構(gòu)建組織工程化角膜內(nèi)皮：制備好的脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞面朝上置于培養(yǎng)板中，加入無血清培養(yǎng)基復(fù)水。接種細(xì)胞前去掉復(fù)水液體，加入1-10μg/ml層黏連蛋白(laminin,ln，購于biolamina公司，貨號(hào)ln511,ln521)或fnccoatingmix(購于athenaes公司，貨號(hào)0470)進(jìn)行包被以促進(jìn)細(xì)胞黏附，包被足夠時(shí)間后去掉包被液體，風(fēng)干備用。將消化好的誘導(dǎo)細(xì)胞按150-2000個(gè)細(xì)胞/mm²密度接種薄層脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱貼壁過夜后，更換新鮮分化培養(yǎng)基培養(yǎng)一周左右，每日換液；

所述層黏連蛋白是指使用1×dpbs稀釋后的濃度，每次使用前新鮮配制，包被時(shí)間為于37℃1小時(shí)或4℃過夜；所述fnccoatingmix為商品即用型，包被時(shí)間為接種細(xì)胞前，室溫包被1分鐘左右。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法獲得的組織工程角膜內(nèi)皮。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述構(gòu)建方法獲得的組織工程角膜內(nèi)皮在角膜(內(nèi)皮)移植中的用途。

如本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例所示，本發(fā)明的組織工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建方法及其組織工程角膜內(nèi)皮，至少有以下優(yōu)點(diǎn)：超薄豬角膜基質(zhì)經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，水腫程度輕，利于種子細(xì)胞貼附和體外培養(yǎng)觀察；同時(shí)，所構(gòu)建的角膜內(nèi)皮具有一定強(qiáng)度，易于進(jìn)行角膜內(nèi)皮移植操作。而全層角膜基質(zhì)或厚板層角膜基質(zhì)，水腫程度高、透明性差，細(xì)胞不易接種且觀察困難；并且移植片過厚影響角膜內(nèi)皮移植術(shù)式選擇，增加其他并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中所構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮茜素紅染色圖；

圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中所構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞重要功能蛋白na⁺-k⁺-atpase圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說明，應(yīng)理解以下僅為本發(fā)明的示例性說明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例

1.制備超薄脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)：飛秒激光切取直徑為8mm、厚度為0.09mm的新鮮豬角膜后基質(zhì)，保留后彈力層，標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞一側(cè)。切取的豬角膜后基質(zhì)密封在盛有保護(hù)液的塑料袋中，全程使用保護(hù)液對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。于200mpa高靜壓條件下破碎細(xì)胞，處理2次，每次時(shí)間2分鐘；取出豬角膜后基質(zhì)，置于0.3％十二烷基硫酸鈉及200u/mldna酶的保護(hù)液中，設(shè)定搖床速度100轉(zhuǎn)/分鐘，25℃消化3小時(shí)去除角膜中的dna成分，完成后將豬角膜后基質(zhì)置于保護(hù)液中漂洗3小時(shí)。漂洗完成后，將脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞面向上貼附于培養(yǎng)板，干燥后輻照滅菌4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，本實(shí)施例中所用保護(hù)液為pbs緩沖液中添加8g/l透明質(zhì)酸、10g/l硫酸軟骨素、5g/l右旋糖苷，調(diào)整ph值為7.2，滲透壓為320mosm。

2.誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞：傳代后常規(guī)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞(h1人多能干細(xì)胞株，自atcc獲得)培養(yǎng)至適宜大小即開始誘導(dǎo)，使用含有ra(購于sigma公司，貨號(hào)r2625)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)5天，鏡下可見人多能干細(xì)胞克隆擴(kuò)大、相鄰克隆發(fā)生融合，克隆內(nèi)細(xì)胞體積變大、細(xì)胞形態(tài)由圓形或卵圓形變?yōu)槎噙呅?，排列緊密，克隆周邊細(xì)胞呈梭形纖維狀。終止誘導(dǎo)，去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入2ml無ca2+、mg2+的pbs緩沖液洗滌2遍，加入0.25％胰酶-0.02％edta1.5ml，去除纖維狀細(xì)胞及胰酶后，剩余細(xì)胞克隆放置培養(yǎng)箱繼續(xù)消化，待大多細(xì)胞脫落時(shí)使用含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基(購于invitrogen公司，貨號(hào)10744019)終止、重懸，吹打至單細(xì)胞后計(jì)數(shù)備用。

所述適宜大小的人多能干細(xì)胞克隆是指；倒置相差顯微鏡下約60-100個(gè)細(xì)胞/克隆，克隆大小均勻，密度適中。

所述含有ra的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在knockoutdmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加以下物質(zhì)制成：β-巰基乙醇、谷氨酰胺、bfgf、neaa、ksr、ra。添加后，β-巰基乙醇濃度為0.1mm、谷氨酰胺濃度為0.1mm、bfgf濃度為4ng/ml、neaa為0.1mm、ksr濃度為總液體量的20％(體積分?jǐn)?shù))、ra濃度為1μm。

所述含rock抑制劑的5％dksfm分化培養(yǎng)基是在dksfm基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加fbs和rock抑制劑制成的。其濃度分別為總液體量的5％(體積分?jǐn)?shù))、10μm。

3.構(gòu)建組織工程化角膜內(nèi)皮：取出制備好的脫細(xì)胞豬角膜后基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞面朝上置于培養(yǎng)板中，加入無血清培養(yǎng)基復(fù)水。接種細(xì)胞前去掉復(fù)水液體，加入fnccoatingmix進(jìn)行包被以促進(jìn)細(xì)胞黏附，室溫包被約1分鐘后去掉包被液體，置于生物安全柜中風(fēng)干備用。將消化好的誘導(dǎo)細(xì)胞按150-2000個(gè)細(xì)胞/mm²密度接種超薄脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱貼壁過夜，第二天更換新鮮分化培養(yǎng)基培養(yǎng)一周左右，鏡下可見后彈力層上人多能干細(xì)胞來源的角膜內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密、形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞邊界清晰。

所述fnccoatingmix為商品即用型，包被時(shí)間為接種細(xì)胞前，室溫包被1分鐘左右。

如圖1所示，為使用實(shí)施例中方法獲得組織工程角膜內(nèi)皮的茜素紅染色照片。將構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮片使用茜素紅染液染色5分鐘，浸于生理鹽水中小心漂洗，置于潔凈玻片光鏡下觀察?？梢娝鶚?gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密、細(xì)胞邊界茜素紅著染清晰，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、活性良好。結(jié)果說明：本發(fā)明方法所獲得的角膜內(nèi)皮具有良好形態(tài)和細(xì)胞活性。

如圖2所示，使用實(shí)施例體外構(gòu)建的組織工程角膜內(nèi)皮，鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿后，使用4％多聚甲醛固定角膜內(nèi)皮片，pbs緩沖液洗滌，加入na⁺-k⁺-atpase相應(yīng)一抗、二抗孵育后，熒光顯微鏡下觀察?？梢姡航M織工程角膜內(nèi)皮表達(dá)角膜內(nèi)皮細(xì)胞液泵功能標(biāo)志na⁺-k⁺-atpase。結(jié)果說明：本發(fā)明方法能夠獲得具有良好功能的組織工程角膜內(nèi)皮。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。