專利名稱：海參膠原、膠原蛋白的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用動物蛋白質(zhì)領(lǐng)域，同時還涉及使用酶獲得膠原和膠原蛋白 的方法。
背景技術(shù)：
研究表明，膠原、膠原蛋白有著多種生理功能，如保護(hù)胃粘膜及抗?jié)冏?用，抗過敏，降血壓，降膽固醇，抗衰老，促進(jìn)傷口愈合，增強(qiáng)骨強(qiáng)度和預(yù)防 骨質(zhì)疏松，預(yù)防關(guān)節(jié)炎，促進(jìn)角膜上皮損傷的修復(fù)和促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的生長 等多種生理活性功能，因此，其在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用， 目前對其的關(guān)注越來越多。刺參體壁蛋白含量的40%以上為膠原蛋白，其可食 部位的主要成分來自膠原蛋白，膠原蛋白中含有多種微量元素，多種生物活性 物質(zhì)，具有抗凝血、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用。海 參體壁的膠原蛋白除了具有膠原蛋白的共性之外，還具備了一定的特性，即在 一般條件下的不溶解性，因此人們極少涉及它的提取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用海參，提供一種制備海參膠原、膠原蛋白的方法，保持制備的 膠原、膠原蛋白的結(jié)構(gòu)及生理功能，對海參體壁膠原蛋白的提取制備旨在為海 參的加工利用及廢棄物附加值的提高，特別是優(yōu)化現(xiàn)有的加工方法，提供更為 詳盡的基礎(chǔ)理論依據(jù)。本發(fā)明的技術(shù)方案是分為原料的處理、提取和純化三步驟。原料處理中是在低溫下用水、Tris-HCl溶液、氫氧化鈉溶液處理海參以除去水溶性、鹽溶性 的蛋白以及色素；提取則是利用乙酸和胃蛋白酶提取，通過鹽析得粗品；提純 是將粗品用乙酸復(fù)溶，而后分別用磷酸氫二鈉溶液、乙酸和水透析而完成。 本發(fā)明的技術(shù)方案按如下所述實現(xiàn) (1).原料處理新鮮海參去內(nèi)臟，沖洗干凈，剪成碎塊后，加入5 10倍水用組織搗碎機(jī)破 壁、勻漿，之后0 5。C下攪拌30 60min，離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?0 120min，離心取沉淀，加入5 10倍0.1mol/LTris-HCl溶液攪拌12 24h，離心取沉淀攪拌 水洗至中性，之后再加入4 8倍水?dāng)嚢? 4天，離心取沉淀再次加入2 4倍水 攪拌2 4天，10000 12000rpm離心2 5min，去除水，得到沉淀，即粗膠原纖維 冷凍或儲存待用；將上述粗膠原纖維加入10~30倍0.05 0.20 mol/L的NaOH溶液中攪拌2~4 天，中途換溶液2 3次，13500rpm離心15 20min，沉淀得到的膠原纖維用水洗 至中性后冷凍儲存或凍干儲存待用；由于膠原不溶于水及堿性溶液，因此，此步驟中加水、Tris-HCl溶液及堿溶 液攪拌的作用是去除一些水溶性、鹽溶性的蛋白以及海參體內(nèi)的色素，處理能 力為蛋白總量的50%，同時使膠原蛋白不受到破壞。(2) .提取膠原纖維加入5 15pPH 2.0 3.0的乙酸及1 15%的胃蛋白酶0 25。C下進(jìn)行 提取2~3天，13500rpm離心lh，取上清液用終濃度為0.6 lmol/L NaCl鹽析， 離心得到粗品；因為海參膠原纖維具有廣泛的交鏈作用,因此海參中的膠原是膠原分子高度 交聯(lián)的聚合體。在沒有對其肽鍵處理時只有很少的膠原能夠溶解。胃蛋白酶促 溶法能夠使膠原肽鏈末端氨基酸斷裂，從而使膠原纖維大量溶于酸中，比單獨(dú) 用酸促溶法提取得率高70%以上，因此所用酶促溶法能夠最大限度的提取膠原 及膠原蛋白，原料的利用率達(dá)到最大。(3) 純化粗品用pH 2.0 3.0的乙酸復(fù)溶，用0.02mol/L pH 8.0的Na2HP04透析滅酶， 之后用pH 2.0 3.0的乙酸透析，再用水透析后離心取沉淀即成，冷凍或凍干儲 存。上述(2)提取和(3)純化的兩工藝步驟中溫度在0 5。C條件下進(jìn)行是提 取活性膠原的工藝歩驟，這是避免了高溫對膠原結(jié)構(gòu)的破壞，使膠原保持了原 有的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時使其活性保持在80%以上；溫度在0 25。C條件下進(jìn)行是 提取膠原蛋白工藝歩驟。本發(fā)明中所提取的兩種物質(zhì)的區(qū)別如下膠原屬于結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在海參體內(nèi)以膠原纖維的形式存在。在低溫下提取 得到的膠原，仍然保持三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有較好的柔韌性、彈性和強(qiáng)度，復(fù)水性好，具有生物活性。膠原蛋白是多肽混合物，相對分子質(zhì)量為幾千到幾萬， 相對分子質(zhì)量分布很寬，能夠被人體更好的吸收利用。膠原蛋白不能再度形成 纖維，不具有生物活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點是1. 在原料處理過程所使用的處理方法能夠最大限度的去除非膠原蛋白的雜 蛋白。2. 制取活性膠原采用低溫，保證了膠原的活性及結(jié)構(gòu)的完整性。3. 所用酶促溶法能夠最大限度的提取膠原及膠原蛋白，原料的利用率達(dá)到最 大值。4.制備膠原蛋白所用的原料可以是新鮮海參，也可是提取完海參中活性物質(zhì) 后剩余的海參，使原料得到了充分的利用。5.首次用海參制取膠原、膠原蛋白。
具體實施方式
實例一1. 活性膠原的提取取新鮮海參或提取完海參中活性物質(zhì)后剩余的海參，去內(nèi)臟，體壁沖洗干 凈，剪成碎塊后，加入5倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿，之后4'C下攪拌30min， 離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?0min，離心取沉淀，加入IO倍O.I mol/LTris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液攪拌12h，離心取沉淀攪拌水 洗至中性，之后再加入6倍水?dāng)嚢?天，離心取沉淀再次加入3倍水?dāng)嚢?天， 10000rpm離心2min，去除水，得到沉淀，即粗膠原纖維冷凍儲存或凍干儲存待 用。將卜.述粗膠原纖維加入20倍0.1 mol/L的NaOH溶液中4。C攪拌3天，中 途換溶液3次，13500rpm離心20min，沉淀用水洗至屮性后加入10倍pH 2.0 的乙酸及15%的胃蛋白酶4匸下進(jìn)行提取，時間為2天，13500rpm離心lh，之 后取上清液用終濃度0.8mol/LNaCl鹽析，離心取沉淀后用pH 2.0的乙酸復(fù)溶， 用0.02mol/LpH 8.0的Na2HP04透析滅酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水 透析，以達(dá)到除鹽的目的，離心取沉淀，即活性膠原，冷凍或凍干儲存。2. 膠原蛋白的提取取新鮮海參或提取完海參中活性物質(zhì)后剩余的海參，去內(nèi)臟，體壁沖洗干 凈，剪成碎塊后，加入5倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿，之后4。C下攪拌30min，離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?0min，離心取沉淀，加入10倍0.1 mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液攪拌12h，離心取沉淀攪拌水 洗至中性，之后再加入6倍水?dāng)嚢?天，離心取沉淀再次加入3倍水?dāng)嚢?天， 10000rpm離心2min，去除水，得到沉淀，即粗膠原纖維冷凍儲存或凍干儲存待 用。將上述粗膠原纖維加入20倍0.1 mol/L的NaOH溶液中4。C攪拌3天，中途 換溶液3次，13500rpm離心20min，沉淀用水洗至中性后加入10倍pH 2.0的乙 酸及10。/。的胃蛋白酶常溫(10。C)下進(jìn)行提取，時間為2天，13500rpm離心lh， 之后取上清液用終濃度0.8mol/LNaCl鹽析，離心取沉淀后用pH2.0的乙酸復(fù)溶， 用0.02mol/LpH8.0的Na2HPO4透析滅酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水 透析，以達(dá)到除鹽的目的，離心取沉淀，冷凍或凍干儲存。1. 活性膠原的提取取新鮮海參或提取完海參中活性物質(zhì)后剩余的海參，去內(nèi)臟，體壁沖洗干 凈，剪成碎塊后，加入8倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿，之后5"C下攪拌40min， 離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?0min，離心取沉淀，加入8倍0.1 mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液攪拌18h，離心取沉淀攪拌水 洗至中性，之后再加入8倍水?dāng)嚢?天，離心取沉淀再次加入4倍水?dāng)嚢?天， 11000rpm離心3min，去除水，得到沉淀，即粗膠原纖維冷凍儲存或凍干儲存待 用。將上述粗膠原纖維再加入30倍0.05 mol/L的NaOH溶液中4。C攪拌3天， 中途換溶液2次，13500rpm離心20min，沉淀用水洗至中性后加入5倍pH 3.0 的乙酸及12%的胃蛋白酶5"下進(jìn)行提取，時間為2天，13500rpm離心lh，之 后取上清液用終濃度0.7mol/LNaCl鹽析，離心取沉淀后用pH 3.0的乙酸復(fù)溶， 用0.02mol/LPH8.0的Na2HPO4透析滅酶，之后用pH 3.0的乙酸透析，再用水 透析，以達(dá)到除鹽的目的，離心取沉淀，冷凍或凍干儲存。2. 膠原蛋白的提取取新鮮海參或提取完海參中活性物質(zhì)后剩余的海參，去內(nèi)臟，體壁沖洗干 凈，剪成碎塊后，加入8倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿，之后5"C下攪拌40min， 離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?0min，離心取沉淀，加入8倍0.1 mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液攪拌18h，離心取沉淀攪拌水 洗至中性，之后再加入8倍水?dāng)嚢?天，離心取沉淀再次加入4倍水?dāng)嚢?天，11000rpm離心3min，去除水，得到沉淀，即粗膠原纖維冷凍儲存或凍干儲存待 用。將上述粗膠原纖維再加入30倍0.05 mol/L的NaOH溶液中4。C攪拌3天， 中途換溶液2次，13500rpm離心20min，沉淀用水洗至中性后加入5倍pH 3.0 的乙酸及8%的胃蛋白酶常溫(15°C)下進(jìn)行提取，時間為2天，13500rpm離 心lh，之后取上清液用終濃度0.7mol/L NaCl鹽析，離心取沉淀后用pH 3.0的 乙酸復(fù)溶，用0.02mol/LpH8.0的Na2HPO4透析滅酶，之后用pH3.0的乙酸透 析，再用水透析，以達(dá)到除鹽的目的，離心取沉淀，冷凍或凍干儲存。1. 活性膠原的提取取新鮮海參或提取完海參中活性物質(zhì)后剩余的海參，去內(nèi)臟，體壁沖洗干 凈，剪成碎塊后，加入10倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿，之后0'C下攪拌60min， 離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?20min，離心取沉淀，加入5倍0.1mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液攪拌24h，離心取沉淀攪拌水 洗至中性，之后再加入4倍水?dāng)嚢?天，離心取沉淀再次加入2倍水?dāng)嚢?天， 12000rpm離心5min，得到沉淀，即粗膠原纖維冷凍儲存或凍干儲存待用。將上 述粗膠原纖維加入10倍0.2 mol/L的NaOH溶液中0。C攪拌4天，中途換溶液2 次，13500rpm離心20min，沉淀用水洗至中性后加入15倍pH2.0的乙酸及10% 的胃蛋白酶0'C下進(jìn)行提取，時間為3天，13500rpm離心lh，之后取上清液用 終濃度0.9mol/LNaCl鹽析，離心取沉淀后用pH 2.0的乙酸復(fù)溶，用0.02mol/LpH 8.0的Na2HP04透析滅酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水透析，以達(dá)到除 鹽的目的，離心取沉淀，冷凍或凍干儲存。2. 膠原蛋白的提取取新鮮海參或提取完海參中活性物質(zhì)后剩余的海參，去內(nèi)臟，體壁沖洗干 凈，剪成碎塊后，加入10倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿，之后0。C下攪拌60min， 離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?20min，離心取沉淀，加入5倍O.lmol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/L NaCl， pH8.0)溶液攪拌24h，離心取沉淀攪拌水 洗至中性，之后再加入4倍水?dāng)嚢?天，離心取沉淀再次加入2倍水?dāng)嚢?天， 12000rpm離心5min，得到沉淀，即粗膠原纖維冷凍儲存或凍干儲存待用。將上 述粗膠原纖維加入10倍0.2 mol/L的NaOH溶液中0。C攪拌4天，中途換溶液2 次，13500rpm離心20min，沉淀用水洗至中性后加入8倍pH 2.0的乙酸及10%的胃蛋白酶常溫(20°C)下進(jìn)行提取，時間為2天，13500rpm離心lh，之后取 上清液用終濃度0.9mol/L NaCl鹽析，離心取沉淀后用pH 2.0的乙酸復(fù)溶，用 0.02mol/LpH 8.0的Na2HP04透析滅酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水透析， 以達(dá)到除鹽的目的，離心取沉淀，冷凍或凍干儲存。
權(quán)利要求
1.海參膠原、膠原蛋白的提取方法，其特征在于工藝過程為(1).原料處理新鮮海參去內(nèi)臟，沖洗干凈，剪成碎塊后，加入5～10倍水用組織搗碎機(jī)破壁、勻漿，之后0～25℃下攪拌30～60min，離心，取沉淀繼續(xù)加水?dāng)嚢?0～120min，離心取沉淀，加入5～10倍0.1mol/L Tris-HCl溶液攪拌12～24h，離心取沉淀攪拌水洗至中性，之后再加入4～8倍水?dāng)嚢?～4天，離心取沉淀再次加入2～4倍水?dāng)嚢?～4天，10000～12000rpm離心2～5min，去除水，得到沉淀，即粗膠原纖維冷凍或儲存待用；將上述粗膠原纖維加入10～30倍0.05～0.20mol/L的NaOH溶液中0～5℃攪拌2～4天，中途換溶液2～3次，13500rpm離心15～20min，沉淀得到的膠原纖維用水洗至中性后冷凍儲存或凍干儲存待用；(2).提取膠原纖維加入5～15倍pH2.0～3.0的乙酸及1～15％的胃蛋白酶0～25℃下進(jìn)行提取2～3天，13500rpm離心1h，取上清液用終濃度為0.6～1mol/L NaCl鹽析，離心得到粗活性膠原；(3)純化粗活性膠原用pH2.0～3.0的乙酸復(fù)溶，用0.02mol/L pH8.0的Na2HPO4透析滅酶，之后用pH2.0～3.0的乙酸透析，再用水透析后離心取沉淀即成，冷凍或凍干儲存。
2. 如權(quán)利要求1所述海參膠原、膠原蛋白的提取方法，其特征在于活性膠 原的提取方法，工藝過程中(2).提取和(3).純化步驟是在0 5'C下進(jìn)行。
3. 如權(quán)利要求1所述海參膠原、膠原蛋白的提取方法，其特征在于膠原蛋 白的提取方法，工藝過程中(2)提取和(3)純化步驟是在6 25t:下進(jìn)行。
4. 如權(quán)利要求l、 2或3所述海參膠原、膠原蛋白的提取方法，其特征在于 (1).原料預(yù)處理中所述的Tris-HCl溶液為EDTA、 NaCl，其pH值為8.0。
5. 如權(quán)利要求1所述海參膠原、膠原蛋白的提取方法，其特征在于所述原 料處理中的原料是提取完海參中活性物質(zhì)后剩余的海參。
全文摘要
一種海參海參膠原、膠原蛋白的制備方法，是將海參經(jīng)過水溶液、Tris-HCl溶液、NaOH溶液處理后冷凍或凍干，得到海參粗膠原纖維。得到的粗膠原纖維，加入乙酸溶液及胃蛋白酶，在0～5℃的條件下攪拌酶解，冷凍離心后進(jìn)行鹽析純化，之后用Na₂HPO₄、乙酸、水除鹽后得到活性膠原。得到的粗膠原纖維，加入乙酸溶液及蛋白酶，在6～25℃的條件下攪拌酶解，離心后進(jìn)行鹽析純化，之后用Na₂HPO₄、乙酸、水除鹽后得到膠原蛋白。
文檔編號C07K1/14GK101215315SQ20071015924
公開日2008年7月9日 申請日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者杰 丁, 丹 姜, 朱蓓薇, 李翠翠, 軍 王, 董秀萍, 靜 陳, 楊 高 申請人:大連工業(yè)大學(xué)