專(zhuān)利名稱(chēng)：可再吸收的角膜扣狀體的制作方法
可再吸收的角膜扣狀體
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般地涉及醫(yī)用植入物和植入方法并且，更具體而言，用于治 療角膜內(nèi)皮缺陷和疾病。
2.現(xiàn)有技術(shù)描述 角膜內(nèi)皮缺陷和疾病
內(nèi)皮功能障礙是在美國(guó)中角膜視力損失的主要原因，并且造成每年在 這個(gè)國(guó)家進(jìn)行的38,000例角膜移植的一半以上[Aintablian，2002 #1]。所述 角膜是透明的、凸起的、最外面的眼部分，并且是視覺(jué)系統(tǒng)的主要折射元 件。不像在身體內(nèi)的大多數(shù)組織，角膜不含有血管用于滋養(yǎng)或防止它免于 感染，因?yàn)榻悄け仨毐３滞该饕哉_折射光，并且即使最微小的血管的存 在也可能干擾該過(guò)程。代替地，所述角膜從在它后面填充所述室的淚和房 水接收它的營(yíng)養(yǎng)。所述角膜組織排列成五個(gè)基礎(chǔ)層，內(nèi)皮是最內(nèi)部的層。 內(nèi)皮細(xì)胞在保持角膜清潔方面是必需的。通常，流體從眼內(nèi)部緩慢泄漏到 中間角膜層(基質(zhì))。內(nèi)皮的主要任務(wù)是從所述基質(zhì)中抽吸該過(guò)量的流體。 在沒(méi)有該泵作用的情況下，所述基質(zhì)將與水溶脹，變成混濁的，并且最終 是不透明的。在健康的眼中，在移動(dòng)到角膜中流體和從角膜中抽吸的流體 之間保持完美的平衡。 一旦內(nèi)皮細(xì)胞被疾病、損傷或衰老破壞，則永久失 去它們。如果太多內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，則接著發(fā)生浮腫和盲，角膜移植作為 唯一目前可用的療法。
在角膜內(nèi)皮疾病的治療中，通常的實(shí)踐是代替角膜的中央部分，包括 上皮、基質(zhì)、后界層和內(nèi)皮。為此，將充分厚度的、圓柱狀的角膜部分除 去并且用來(lái)自供體眼的類(lèi)似部分代替，所謂的充分厚度的角膜移植術(shù)。雖 然該步驟可以提供優(yōu)秀的基質(zhì)移植物透明度，但是它被垂直基質(zhì)傷口的固
有問(wèn)題所折磨，所述傷口愈合不良并且需要表面角膜縫合。后者引起不規(guī) 則的散光，并且促進(jìn)視力危險(xiǎn)情況諸如潰瘍、脈管化、和移植排斥。
己經(jīng)認(rèn)可的是，大部分角膜內(nèi)皮病癥可以通過(guò)替換后界層連同內(nèi)皮而
治療。為此，在1993年，WWKo開(kāi)發(fā)了通過(guò)角膜緣切割替換內(nèi)皮的技術(shù)。 他的在動(dòng)物模型中的結(jié)果導(dǎo)致了由Gerrit Melles的進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)，其在 1998年公開(kāi)了他的關(guān)于在首次人外科手術(shù)中的后部板層角膜移植術(shù) (lamellarkerat叩lasty)的結(jié)果。開(kāi)發(fā)所述技術(shù)，其中經(jīng)過(guò)鞏膜角膜通道除去 所述后界層，連同所述內(nèi)皮和在其上攜帶后界層的基質(zhì)切片。然后將這個(gè) 在所述基質(zhì)切片上用具有內(nèi)皮的供體膜替換。利用薄刀將所述切片從基質(zhì) 切除。深度的板層內(nèi)皮角膜移植術(shù)(DLEK)程序通過(guò)在不需要表面角膜切割 或縫合的情況下容許內(nèi)皮替換并且通過(guò)保持最初的、正常角膜局部解剖而 避免PKP的固有問(wèn)題。
在全世界的范圍，存在全部類(lèi)型的供體器官的總體短缺。應(yīng)用區(qū)域包 括可能由于作戰(zhàn)相關(guān)的損傷或疾病而嚴(yán)重?fù)p傷的神經(jīng)、視覺(jué)、肌骨胳的、 和軟組織的替換。 一個(gè)顯著的實(shí)例是由于對(duì)角膜的損傷或疾病而產(chǎn)生的 盲。僅次于白內(nèi)障，在國(guó)際范圍內(nèi)，角膜盲列作為視覺(jué)喪失的原因的第二 位。估計(jì)全世界有一千萬(wàn)人遭受角膜有關(guān)的視覺(jué)病損或角膜盲。 一旦角膜 內(nèi)皮細(xì)胞被疾病、損傷或衰老破壞，則永久失去它們。如果太多內(nèi)皮細(xì)胞 被破壞，則接著發(fā)生浮腫和盲，角膜移植作為唯一可用的療法。然而，許 多問(wèn)題嚴(yán)重限制該當(dāng)前治療的成功供體可利用性的缺乏，特別是在器官 贈(zèng)款是傳統(tǒng)上不可接受的國(guó)家中，組織痊愈的成本，排除隨后的用于移植 的角膜應(yīng)用的矯正激光外科手術(shù)的最近普及，高的排斥反應(yīng)比例(成年人中 角膜同種異體移植物的20%和兒童中的同種異體移植物的50%，結(jié)果是同 種異體移植物的排斥反應(yīng))，廣泛接受的角膜取代的缺乏，以及目前的角膜 修復(fù)術(shù)沒(méi)有充分整合到宿主組織中。
從前已經(jīng)研究了聚合物作為用于角膜內(nèi)皮細(xì)胞的載體的應(yīng)用。見(jiàn)，例 如，授予Lui的PCT/US 04/032934， PCT/US 04/032933，和PCT/US 04/033194并且通過(guò)參考結(jié)合于此，好象以它們的整體所陳述。聚合物可 以作用為對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞層的永久性不可生物降解的載體。聚合物的永久性 需要除去接受者中存在的細(xì)胞和結(jié)締組織層。如果沒(méi)有除去所述層，則存 在被稱(chēng)為雙重前房的并發(fā)癥的潛在性。
內(nèi)皮細(xì)胞必須形成緊密的單一層以適當(dāng)?shù)仄鹱饔?。已?jīng)嘗試了上述努 力而將這些細(xì)胞包封到可生物降解的聚合物中，但是除非將其以單層培 養(yǎng)，否則所述細(xì)胞不起作用。
發(fā)明概述
面對(duì)現(xiàn)代角膜移植的主要挑戰(zhàn)是世界范圍的可得到的植入用供體角膜 組織的缺少。在本文公開(kāi)的裝置將通過(guò)利用可生物降解的聚合物膜和培養(yǎng) 的細(xì)胞組合作為用于供體角膜的替換而彌補(bǔ)該短缺。所述聚合物膜將作為 用于所述培養(yǎng)的細(xì)胞層的載體。 一旦植入，所述聚合物膜將分解，將所述 細(xì)胞層留在原處。
通過(guò)制備可生物降解的細(xì)胞載體，僅將細(xì)胞層留在后面。該方法將在 以下情況中是有利的，其中結(jié)締組織層(后界層)是完好的，但是細(xì)胞層具 有間隙。
用于支持附著、生長(zhǎng)并且最終作為在移植期間攜帶細(xì)胞的載體的生物 聚合物載體的應(yīng)用對(duì)于細(xì)胞替換療法的成功是極重要的，特別是在腦中和 眼的背部，其中從神經(jīng)嵴來(lái)源得到的細(xì)胞經(jīng)常在老化過(guò)程期間被損傷。存 在七個(gè)一般類(lèi)別的生物聚合物多核苷酸、聚酰胺、多糖、聚異戊二烯、
木質(zhì)素、聚磷酸酯和多羥基鏈烷酸酯。參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利6,495,152。生 物聚合物在膠原IV至聚有機(jī)硅氧垸組合物的范圍內(nèi)，其中所述表面用碳 顆粒埋置，或用伯胺和任選的肽處理，或者與含有伯胺或含有羧基的硅垸 或硅氧烷共固化，(美國(guó)專(zhuān)利4,822,741)，或例如，包含天然的軟骨材料的 其它修飾的膠原是已知的(美國(guó)專(zhuān)利6,676，969)，所述天然的軟骨材料已經(jīng) 經(jīng)受脫脂及其它處理，留下膠原II材料和糖胺聚糖，或者備選地，可以將 純化的膠原II的纖維與葡萄糖胺聚糖和任何其它需要的添加劑混合。這樣 的另外添加劑可以，例如，包括軟骨粘連蛋白或錨蛋白II以幫助將 chrondocytes附著到膠原II纖維和生長(zhǎng)因子諸如軟骨誘導(dǎo)因子(CIF)、胰島 素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有聚合物膜涂層的可再吸收的角膜 扣狀體(button)支持基質(zhì)，其中所述聚合物膜將由透明質(zhì)酸組成。透明質(zhì)酸
是可生物降解的，被眼充分忍受的，并且可以形成最佳的用于細(xì)胞生長(zhǎng)的 膜。
當(dāng)對(duì)下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明進(jìn)行參考時(shí)，本發(fā)明的這些及其它 目的，以及其許多伴隨的優(yōu)勢(shì)，將變得更顯而易見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示優(yōu)選實(shí)施方案的前視圖和側(cè)視圖。
圖2顯示本發(fā)明的實(shí)施方案的斜視圖。
圖3顯示示意性的角膜解剖學(xué)圖。
圖4顯示示意性的傳統(tǒng)的DLEK程序。
圖5A顯示示意性的修改的DLEK程序，其中將所述內(nèi)皮細(xì)胞層除去 并且將所述植入物直接放置在后界層上。
圖5B顯示示意性的修改的DLEK程序，其中不除去所述內(nèi)皮細(xì)胞層 并且將所述植入物放置殘留的內(nèi)皮細(xì)胞的上部上。
詳細(xì)說(shuō)明和優(yōu)選實(shí)施方案
在描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，為了清楚，將憑借具體的術(shù)語(yǔ)。然 而，本發(fā)明不意欲限于如此選擇的專(zhuān)用名詞，并且應(yīng)當(dāng)理解每個(gè)具體的術(shù) 語(yǔ)包括全部以類(lèi)似方式運(yùn)行以實(shí)現(xiàn)類(lèi)似目的的技術(shù)上的等價(jià)物。
如圖1-3所示的可再吸收的角膜扣狀體(RCB)裝置的優(yōu)選實(shí)施方案一 般地指定為(IO)。在圖1和2中，RCB裝置的優(yōu)選實(shí)施方案包括支持基質(zhì) (11)，其可以涂有聚合物膜，所述聚合物膜與培養(yǎng)細(xì)胞的層(12)在頂部形成 圓柱的形狀。
為了改善所述聚合物在支持細(xì)胞生長(zhǎng)或附著中的能力，包括一個(gè)或多 個(gè)下列各項(xiàng)的附著混合物將在合成期間埋置或結(jié)合到支持基質(zhì)(ll)組合物 中在約至500 g/ml的聚合物凝膠的范圍內(nèi)的濃度的纖連蛋白、在1至500 g/ml的聚合物凝膠范圍內(nèi)濃度的層粘連蛋白、在O.l到100g/ml的聚合物 凝膠范圍內(nèi)濃度的RGDS、在1至500 ng/ml的聚合物凝膠范圍內(nèi)的濃度 的與聚卡波菲綴合的bFGF、在10至1000 ng/ml的聚合物凝膠范圍內(nèi)的濃 度的與聚卡波菲綴合的EGF、在1至1000ng/ml的聚合物凝膠范圍內(nèi)的濃
度的NGF和在1至500g/ml的聚合物凝膠范圍內(nèi)的濃度的硫酸肝素。
本發(fā)明的方法還可以包括與聚卡波菲綴合的諸如纖連蛋白、層粘連蛋 白、RGDS、 IV型膠原、bFGF的附著蛋白質(zhì)以及與聚卡波菲綴合的EGF 的應(yīng)用。聚卡波菲是一種輕度交聯(lián)的"聚合物"。交聯(lián)劑是丁二烯二醇 (divinyl glycol)。聚卡波菲也是一種含有多個(gè)羧基基團(tuán)的弱多酸，其是它的 負(fù)電荷的來(lái)源。這些酸基團(tuán)容許與細(xì)胞表面的氫鍵作用。聚卡波菲與粘蛋 白在水中共同分享吸附40至60倍其重量的能力，并且通常用作不需處方 可以出售的輕瀉劑(Equalactin， Konsyl Fiber， Mitrolan， Polycarb) (Park H, 等，J. Control Release(控釋雜志)1985; 2:47-57)。聚卡波菲是非常大的分子 因此不被吸收。它也是非免疫原性的，即使在實(shí)驗(yàn)室中它也不可以將抗體 生長(zhǎng)到所述聚合物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包括在它的合成期間埋置或已經(jīng)結(jié) 合在所述聚合物之內(nèi)的自持聚合物，包括一個(gè)或多個(gè)下列各項(xiàng)的附著混合 物與聚卡波菲綴合的纖連蛋白、層粘連蛋白、RGDS、 bFGF，與聚卡波 菲綴合的EGF和如PCT/US 2004/032934中描述的硫酸肝素?？梢詫⑺?聚合物模制成任何需要的形狀，諸如圖1中顯示的形狀，優(yōu)選的是角膜扣 狀體的形狀，并且培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞將被接種到凹入的表面上并且容 許增殖直到匯合。
還預(yù)期的是，本發(fā)明將利用自持生物聚合物，所述自持生物聚合物還 可以利用DLEK程序被模制成正常人角膜厚度的一半并且用培養(yǎng)的人角 膜內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋用于半厚度移植。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，將薄片或微粒形式的涂層生物聚合物用作用于角 膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的支持基質(zhì)并且作為在細(xì)胞移植程序期間用于細(xì)胞運(yùn)送 的載體。
圖3顯示分成亞層的角膜的說(shuō)明。第一個(gè)是被稱(chēng)為上皮(13)的單層細(xì) 胞。深入到上皮的是前界層(Bowman，s layer)(14)，接著是中心基質(zhì)(15)。 將角膜的后部用后界層(16)填充，并且將細(xì)胞的最后層稱(chēng)為內(nèi)皮(17)。
圖4描述一種傳統(tǒng)的DLEK程序。在所述程序中，將后界層(16)，基 質(zhì)(15)的部分，和所述內(nèi)皮(17)除去并用植入物(18)替換。植入物(18)含有 內(nèi)皮細(xì)胞，后界層，和基質(zhì)(15)的部分。在DLEK程序中，外科醫(yī)生使用
特殊的儀器進(jìn)入眼白(鞏膜)并且在患病的角膜中"開(kāi)通道"。然后將角膜的 后面部分除去并且用來(lái)自角膜供體的健康的移植物組織的類(lèi)似的片替換。 雖然僅實(shí)際替換一小片角膜，但是所述移植物將幫助保持整個(gè)角膜清潔。
DLEK具有超過(guò)常規(guī)移植外科手術(shù)的數(shù)個(gè)優(yōu)勢(shì)。沒(méi)有將縫合線放在角 膜中。在臨床研究中，這已經(jīng)在外科手術(shù)以后導(dǎo)致了顯著較少的散光并且 加速視力的恢復(fù)。通常，需要更少的跟蹤檢查，因?yàn)闆](méi)有要除去的角膜縫
合線。正在進(jìn)行的研究也檢查用DLEK的角膜移植排斥反應(yīng)是否比常規(guī)移 植更不可能。
圖5A和5B提供了本發(fā)明的修改程序，不除去后界層(16)，并且可 以除去或可以不除去內(nèi)皮細(xì)胞層(17)。在角膜上皮營(yíng)養(yǎng)不良的情況下，存 在的內(nèi)皮細(xì)胞層可能損傷而無(wú)法修復(fù)。在該情況下，必須完全除去它。在 其它情況下，可能消耗所述內(nèi)皮細(xì)胞層，但是僅稍微損傷。在這些情況下， 不除去殘留的內(nèi)皮細(xì)胞并且將所述植入物放在它們之上。圖5A說(shuō)明了除 去內(nèi)皮細(xì)胞層(17)并且將植入物(10)直接放在后界層(16)上的情況。圖5B 說(shuō)明不除去所述內(nèi)皮細(xì)胞層(17)并且將所述植入物(10)放在殘留的內(nèi)皮細(xì) 胞頂部之上的情況。
所述裝置的應(yīng)用
在優(yōu)選實(shí)施方案中，將薄聚合物層用作所述支持基質(zhì)并且從透明質(zhì)酸 形成。將要從需要移植的患者收獲內(nèi)皮細(xì)胞。利用專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US 04/32933中描述的技術(shù)將這些細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)展，并且固定在所述聚合物層 上而形成RCB。 一旦所述細(xì)胞在聚合物上達(dá)到匯合，則將RCB準(zhǔn)備好用 于植入。
進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DLEK，角膜-鞏膜的切割以接近前房。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 不除去存在的內(nèi)皮細(xì)胞并且將RCB放在頂部上。 一旦放入所述前房中， 則將開(kāi)始抽吸RCB的細(xì)胞。由細(xì)胞產(chǎn)生的吸入作用將把RCB保持在緊密 接近于存在的角膜。
一旦RCB固定在角膜上，則將透明質(zhì)酸酶(hyaluronase)注入到前房中
并關(guān)閉切口。所述透明質(zhì)酸酶用作酶催化劑以加速透明質(zhì)酸聚合物圓盤(pán)支 持基質(zhì)的分解。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述圓盤(pán)在24小時(shí)內(nèi)溶解，留下穩(wěn)200680046714. X
說(shuō)明書(shū)第7/17頁(yè)
固地附著于患者角膜的新的內(nèi)皮細(xì)胞。
應(yīng)當(dāng)理解，在受體和供體角膜組織中制造的切口的大小和形狀的尺寸
僅表示可以進(jìn)行的外科手術(shù)的類(lèi)型。因而，容器、片、蓋子和角膜供體或 受體圓盤(pán)的尺寸和形狀的變化是預(yù)期的，全部保持在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
一般地預(yù)期，任何類(lèi)型的本領(lǐng)域己知的可再吸收的聚合物可以用作用 于RCB的支持基質(zhì)?？梢詫⑺鼍酆衔镏苯臃旁诂F(xiàn)有內(nèi)皮層頂部上或者 可以首先將現(xiàn)有層刮去。在備選的實(shí)施方案中，可以將現(xiàn)有的內(nèi)皮層刺激
(化學(xué)或利用RF電流)24小時(shí)而容許聚合物膜的再吸收并且除去二重前房 的風(fēng)險(xiǎn)。
在備選的實(shí)施方案中，所述聚合物載體可以包括哺乳動(dòng)物羊膜或羊膜 和膠原的組合。見(jiàn)例如，授予Sano等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2005/0214259，其 教導(dǎo)可以收集角膜內(nèi)皮細(xì)胞，然后在體外培養(yǎng)和增殖?？梢酝ㄟ^(guò)傳代培養(yǎng) 增殖的細(xì)胞并且將它們進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心可以產(chǎn)生具有高細(xì)胞密度的細(xì)胞 懸液。然后，作為基底(載體)，采用含有膠原作為主要成分的羊膜，并且 將細(xì)胞懸液置于其上并且培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間。結(jié)果，可以形成一分層的細(xì)胞 層，其中從角膜內(nèi)皮細(xì)胞獲得的細(xì)胞可以具有類(lèi)似于活體的形態(tài)的形態(tài)。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞層可以具有與活體的角膜內(nèi)皮細(xì)胞相等的細(xì)胞密度并 且具有這樣的構(gòu)造，其中將六角形形狀的細(xì)胞規(guī)則分層而形成單一層狀結(jié) 構(gòu)。
各種生物材料已經(jīng)用于治療并修復(fù)角膜以及視覺(jué)缺陷和損傷，并且預(yù) 期，許多適合于用作RCB用的支持基質(zhì)。例如，角膜細(xì)胞外基質(zhì)富有膠 原和糖胺聚糖(Robert等2001， Pathol Biol(病理生物學(xué))(巴黎)；49 (4): 353-63)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖、乙酰透明質(zhì)酸改善大鼠和兔模型中的角膜上 皮細(xì)胞的傷口愈合，如通過(guò)評(píng)價(jià)基質(zhì)和內(nèi)皮層所評(píng)價(jià)(Nakamura等1997, Exp Eye Res(實(shí)驗(yàn)的眼研究)；64 (6) : 1043-50; Chung等1999, Ophthalmic Res(眼科研究);31 (6): 432-9)。 Tseng及其他已經(jīng)開(kāi)辟了羊膜在治療各種視 覺(jué)病癥中的應(yīng)用(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,152,142)。所述羊膜是偏振化的，具有"基 質(zhì)"側(cè)和"基膜"側(cè)。基質(zhì)側(cè)含有膠原I和III和纖連蛋白以及具有IV型 膠原、層粘連蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖的基底板分布。羊膜的基膜側(cè)支持 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，而基質(zhì)側(cè)以類(lèi)似于膠原的方式支持成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。將 羊膜從人胎盤(pán)分離，冷凍保存，然后用于眼內(nèi)病癥的外科手術(shù)修復(fù)。
羊膜的作用機(jī)理還未被完全理解。然而，存在體外證據(jù)，羊膜在培養(yǎng)
物中的存在通過(guò)成纖維細(xì)胞抑制TGF的表達(dá)(Lee等2000， Curr Eye Res(當(dāng) 前眼研究)；20(4): 325-334)和通過(guò)上皮細(xì)胞的白介素1 a和白介素1的表 達(dá)(SoIomon等2001 ， Br J Ophthalmol(英國(guó)眼科雜志)；85(.4):444-449)。
羊膜還已經(jīng)被成功用于治療各種各樣的角膜和視覺(jué)缺陷。例如，已經(jīng) 通過(guò)利用多層羊膜以填充基質(zhì)層、基膜，并且作為傷口覆蓋物而治療深度 角膜和鞏膜的潰瘍(Hanada等2001， Am J Opthalmol(美國(guó)眼科雜志)； 131(3):324-31)。發(fā)現(xiàn)羊膜減少一種免疫介導(dǎo)疾病，HIV-I角膜炎中的基質(zhì) 發(fā)炎和潰瘍(Heiligenhaus等2001, Invest Ophthalmol Vis Sci(研究眼科學(xué) 和視覺(jué)科學(xué));42 (9) : 1969-1974)。嚴(yán)重的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的角膜潰殤還已經(jīng)用羊 膜治療(Chen等2000， Br J Ophthalmol(英國(guó)眼科學(xué)雜志)；84(8): 826-833)。 羊膜恢復(fù)角膜和結(jié)膜的表面并且減少?gòu)募毙曰瘜W(xué)或熱燒傷產(chǎn)生的角膜緣 基質(zhì)發(fā)炎(Meller等2000， Ophthalmology(眼科學(xué))；107(5): 980-989)。將羊 膜用作患者中的角膜緣的自體移植物或同種異體移植物的備選方案，所述 患者具有部分角膜緣的干細(xì)胞缺陷(Anderson等2001, Br J Ophthalmol(英 國(guó)眼科學(xué)雜志)；85 (5) : 567-575)。羊膜還己經(jīng)用于翼狀胬肉的外科手術(shù)治 療，所述翼狀胬肉是從結(jié)膜延伸到角膜的翼狀巻邊的膜，附著到鞏膜 (Solomon等2001, Ophthalmology(目艮科學(xué))108 (3) : 449-460)。將羊膜用于 成功治療晚期的發(fā)作青光眼濾床(filtering bed)泄漏，作為結(jié)膜的備選方案 (Budenz等2000, Am J Ophthalmol(美國(guó)眼科學(xué)雜志)；130(5): 580-588; Barton等2001, Invest Ophthalmol Vis Sci(研究眼科學(xué)和視覺(jué)科學(xué))；42 (8): 1762-1768 )以及在用于帶角膜病變的外科手術(shù)治療時(shí)，改善穩(wěn)定的角膜上 皮的恢復(fù)并且減少眼疼痛，結(jié)節(jié)病繼發(fā)的角膜基膜中的鈣沉積，慢性葡萄 膜炎及其它原因(Anderson等2001， Comea(角膜)；20(4): 354-361)。
還預(yù)期，其它基底可以供角膜內(nèi)皮細(xì)胞使用作為用于RCB的支持基 質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖可以用作支持基質(zhì)。
脫乙酰殼多糖是包括葡糖胺和N-乙?；咸前返年?yáng)離子生物聚合物， 其具有生物粘合性質(zhì)并且已經(jīng)顯示改善某些藥物化合物跨過(guò)粘膜表面諸 如鼻腔的全身生物利用度(見(jiàn)Illum， Drug Discovery Today(現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn))，
7:1184-1189(2002))。
通過(guò)術(shù)語(yǔ)"脫乙酰殼多糖"，本發(fā)明人包括殼多糖的全部衍生物，或聚 -N-乙?；?D-葡糖胺，包括全部聚葡糖胺和不同的分子量的葡糖胺材料的 寡聚體，其中已經(jīng)經(jīng)過(guò)水解(脫乙酰)除去了更大比例的N-乙?；８鶕?jù)本 發(fā)明，表示已經(jīng)經(jīng)過(guò)脫乙酰除去的N-乙酰基比例的脫乙酰的程度，應(yīng)當(dāng)優(yōu) 選在大約40-97%的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約60-96%的范圍內(nèi)并且最優(yōu)選在 大約70-95%的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中使用的脫乙酰殼多糖、脫乙酰殼多糖衍生物或鹽應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具 有在大約10,000至1,000，000Da范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約15,000至750,000Da 范圍內(nèi)并且最優(yōu)選在大約20,000至500,000 Da范圍內(nèi)的分子量。
脫乙酰殼多糖的鹽適合于在本發(fā)明中使用。多種有機(jī)和無(wú)機(jī)酸的鹽是 適合的。這樣的適合的鹽包括，但不限于，硝酸鹽，磷酸鹽，谷氨酸鹽， 乳酸鹽，檸檬酸鹽，鹽酸鹽和乙酸鹽。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽和谷氨酸鹽。
脫乙酰殼多糖衍生物和它們的鹽也適合在本發(fā)明中使用。適合的脫乙 酰殼多糖衍生物包括，但不限于，通過(guò)將酰基和/或烷基與羥基結(jié)合而形成 的酯，醚或其它的衍生物，然而并非脫乙酰殼多糖的氨基。實(shí)例包括脫乙 酰殼多糖的O-烷基醚和脫乙酰殼多糖的O-?；?。修飾的脫乙酰殼多糖， 諸如綴合至聚乙二醇的那些可以在本發(fā)明中使用。脫乙酰殼多糖和聚乙二 醇的綴合物描述在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公布WO99/01498中。
適合于在本發(fā)明中使用的脫乙酰殼多糖可以從多種來(lái)源獲得，包括 Primex, Haugesund，拐P威；NovaMatrix, Drammen，擁P威；Seigagaku美國(guó)有 限公司(Seigagaku America Inc.)， MD,美國(guó)；Meron (印度)Pvt公司(Meron (India) Pvt， Ltd.),印度；Vanson公司(Vanson Ltd)， VA，美國(guó)；和AMS生物 技術(shù)公司(AMS Biotechnology Ltd.),英國(guó)。適合的衍生物包括在Roberts, 殼多糖化學(xué)(Chitin Chemistry), MacMillan出版公司(MacMillan Press Ltd.)， 倫敦(1992)中公開(kāi)的那些。
用于RCB的支持基質(zhì)或"載體"還可以包含含有脫乙酰殼多糖的含 水聚合物凝膠，并且所述含水凝膠的表面涂有膠原和/或海藻酸。另外，根 據(jù)另一個(gè)方面的本發(fā)明的用于RCB的載體可以包括含有脫乙酰殼多糖的 凝膠層和相鄰地提供至所述凝膠層的無(wú)機(jī)層。
在說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)"用于RCB的載體"指的是可以在細(xì)胞培養(yǎng) 期間充當(dāng)載體或支持物的元件，并且該術(shù)語(yǔ)不應(yīng)該以任何限制性方式解
釋。例如，在日本專(zhuān)利未審查公布(KOKAI)號(hào)2001-120267中描述了用于 細(xì)胞培養(yǎng)的載體，其中將海藻酸凝膠層和作為細(xì)胞粘附成分凝膠層的細(xì)胞 外基質(zhì)成分凝膠層層壓在多孔膜上，并且本發(fā)明的用于RCB的載體可以 用于在類(lèi)似于在上述專(zhuān)利文獻(xiàn)中描述的細(xì)胞培養(yǎng)用載體的相同技術(shù)領(lǐng)域 中的培養(yǎng)。
術(shù)語(yǔ)"含有脫乙酰殼多糖的凝膠"指的是含有脫乙酰殼多糖凝膠作為 主要成分的凝膠。含有脫乙酰殼多糖的含水聚合物凝膠指的是含有"脫乙 酰殼多糖凝膠"作為主要成分的含水聚合物凝膠(在說(shuō)明書(shū)中，含有脫乙酰 殼多糖的含水聚合物凝膠也可以在下文中稱(chēng)為"脫乙酰殼多糖凝膠")。作 為脫乙酰殼多糖凝膠，可以使用不溶于其中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的中性區(qū)域的凝 膠。例如，可以利用下列脫乙酰殼多糖凝膠通過(guò)中和脫乙酰殼多糖分子 中的氨基而形成為凝膠的不溶于其中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的中性區(qū)域的脫乙酰 殼多糖凝膠，通過(guò)脫乙酰殼多糖的鹽形成而形成為凝膠和具有陰離子殘基 的有機(jī)聚合物化合物的脫乙酰殼多糖凝膠，通過(guò)與交聯(lián)試劑交聯(lián)而形成為 凝膠的脫乙酰殼多糖凝膠等。作為具有陰離子殘基的有機(jī)聚合物化合物， 例如，可以使用天然的或合成聚合物化合物諸如聚天冬氨酸、海藻酸、葡 聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素、和聚苯乙烯磺酸。交聯(lián)劑的實(shí)例包括具有兩個(gè) 或更多與氨基或羥基反應(yīng)的基團(tuán)的化合物，諸如戊二醛、二乙烯基砜和鹵 代三嗪，預(yù)先制成活性酯的具有兩個(gè)或更多羧酸基團(tuán)的化合物等。
脫乙酰殼多糖(聚D-葡糖胺)可以通過(guò)將殼多糖(聚-N-乙酰基-D-葡糖 胺)與濃縮堿溶液加熱或?qū)ざ嗵沁M(jìn)行鉀熔融，然后將生成物脫乙酰而獲 得。任何脫乙酰殼多糖可以用于制造本發(fā)明的RCB用載體。例如，從形 成具有高膜強(qiáng)度的膜的觀點(diǎn)看，優(yōu)選的是具有脫乙酰程度為60至100%并 且當(dāng)以0.5質(zhì)量％溶解在1質(zhì)量％乙酸水溶液中時(shí)提供10至10000 cP的溶 液粘度的脫乙酰殼多糖。更優(yōu)選的是具有脫乙酰程度為70至100%并且提 供40至5000 cP的溶液粘度的脫乙酰殼多糖。
不特別限制在供RCB載體用的凝膠表面上順序涂層包括膠原、海藻 酸、和脫乙酰殼多糖的多種其它聚合物化合物的方法。例如，優(yōu)選使用逐
層方法(layer-by-layer)方法(GeroDecher， Science(科學(xué))，277期，1232-1237 頁(yè)，1997年8月29日)。逐層方法包括重復(fù)下列步驟在多種聚合物化合 物的任何一種的水溶液中浸漬膜，隨后用水洗滌并浸漬在另一聚合物化合 物中。為了產(chǎn)生本發(fā)明RCB用的載體，可以對(duì)于含水聚合物凝膠的兩側(cè) 或一側(cè)進(jìn)行含有脫乙酰殼多糖的含水聚合物凝膠表面的表面修飾。對(duì)于進(jìn) 行一側(cè)的修飾，在上述基于施用的修飾方法或上述基于浸漬的修飾方法期 間，優(yōu)選使用在一側(cè)連接覆蓋物的方法，以便所述側(cè)不接觸到浸漬溶液。 如果需要，對(duì)于膠凝作用，可以使用膠凝劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于RCB的支持物基質(zhì)可以由從交聯(lián)的膠原 基質(zhì)獲得的膜所制成。利用包括下列步驟的方法可以產(chǎn)生這樣的材料預(yù) 固化來(lái)自哺乳動(dòng)物的膠原基的生物學(xué)組織；用聚環(huán)氧化合物處理所述生物 學(xué)組織以獲得具有交聯(lián)膠原結(jié)構(gòu)的生物學(xué)組織；將由此獲得的生物學(xué)組織 去細(xì)胞化以得到無(wú)細(xì)胞的組織；并且，將無(wú)細(xì)胞的組織浸漬在含有透明質(zhì) 酸的冷凍保存溶液中并且冷凍干燥所述組織。所述膠原基的組織包括，但 不限于這些，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物的筋膜、羊膜、胎盤(pán)或皮膚。聚環(huán)氧化合 物包括，然而不限于這些，優(yōu)選地是聚乙二醇多縮水甘油醚、聚乙二醇縮 水甘油醚，或其它市場(chǎng)上可買(mǎi)到的聚環(huán)氧化合物。優(yōu)選地，在pH8-11的 條件，在30-45C，將l-7。/。(w/v)的聚環(huán)氧化合物在生物學(xué)組織上處理10-20 小時(shí)。另外，優(yōu)選通過(guò)物理方法將冷凍干燥的無(wú)細(xì)胞組織磨成粉狀，例如， 在液氮環(huán)境下在粉磨機(jī)中進(jìn)行冷凍粉碎，以防止它被加工過(guò)程中產(chǎn)生的熱 破壞。所述方法還可以包括在冷凍粉碎以前在液氮環(huán)境下將冷凍干燥的無(wú) 細(xì)胞組織粉碎成更小的步驟，或水化所述冷凍干燥的無(wú)細(xì)胞組織并切割所 述水化的組織的步驟。
已知多種交聯(lián)技術(shù)用于穩(wěn)定膠原的結(jié)構(gòu)，同時(shí)保持用于移植的膠原組 織的機(jī)械強(qiáng)度和獨(dú)特的性質(zhì)。除了所述交聯(lián)技術(shù)之外，已經(jīng)活躍地進(jìn)行了 關(guān)于去細(xì)胞技術(shù)的研究以減少移植期間對(duì)于所移植的移植物的免疫排斥 反應(yīng)，以便在移植物中增殖細(xì)胞并且開(kāi)發(fā)用于組織工程的新的生物材料。 已經(jīng)進(jìn)行了許多涉及戊二醛的研究以增加組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其顯示戊二 醛在人體中的高毒性的嚴(yán)重問(wèn)題。在這方面，在本領(lǐng)域中已經(jīng)探索了用于 膠原組織交聯(lián)的備選技術(shù)，其中之一是利用聚環(huán)氧化合物的膠原組織的交
聯(lián)技術(shù)。
本領(lǐng)域已經(jīng)已知交聯(lián)達(dá)數(shù)年，并且存在化學(xué)的和物理的(照射)方法這 兩者的多種方法。本領(lǐng)域己知的所選擇的例舉性化學(xué)交聯(lián)劑是戊二醛及其 它相關(guān)非生理試劑。這些交聯(lián)劑與膠原分子氨基酸殘基反應(yīng)而形成分子間 交聯(lián)。然而，這些不適宜的試劑可以對(duì)于交聯(lián)膠原基的生物產(chǎn)品的生物相 容性和生物活性具有負(fù)作用，所述負(fù)作用是由膠原分子構(gòu)象的改變和交聯(lián) 劑的浸出所引起的。因而，由非生理試劑交聯(lián)的膠原產(chǎn)品不良地被宿主組 織所接受并且結(jié)合在宿主組織內(nèi)。而且，局部炎癥和更復(fù)雜的全身反應(yīng)是 戊二醛交聯(lián)膠原產(chǎn)品的不利副作用。
授予Brodsky等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,971,954公開(kāi)了 D(-)核糖或其它的還
原生理糖通過(guò)糖化的方法作為生理試劑用于交聯(lián)膠原基質(zhì)的應(yīng)用。然而， 當(dāng)膠原基底由天然的膠原纖維組成時(shí)，Brodsky等公開(kāi)的方法是有效的， 但是對(duì)于從重構(gòu)的纖維狀膠原產(chǎn)生的膠原基質(zhì)，特別是當(dāng)所述膠原是非端 肽膠原時(shí)僅是部分有效的。非端肽膠原是由天然膠原的胃蛋白酶增溶作用 產(chǎn)生的。因?yàn)槲傅鞍酌盖虚_(kāi)是抗原的膠原的膠原分子的端肽，所以胃蛋白 酶溶解的膠原是生物醫(yī)藥工業(yè)中膠原的大多數(shù)的利用形式。
另一個(gè)預(yù)期的用于RCB的支持物基質(zhì)是由脂肪細(xì)胞(adipocytes)或脂 肪細(xì)胞獲得的。脂肪來(lái)源的干細(xì)胞或"脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞"指的是源自 脂肪組織的細(xì)胞。"脂肪"指的是任何脂肪組織。所述脂肪組織可以是灰 色或白色脂肪組織，從皮下的、網(wǎng)膜的/內(nèi)臟、乳房的、生殖腺的、或其它 脂肪組織部位獲得。優(yōu)選地，所述脂肪是皮下的白色脂肪組織。這樣的細(xì) 胞可以包括原代細(xì)胞培養(yǎng)或無(wú)限增殖細(xì)胞系。所述脂肪組織可以來(lái)自具有 脂肪組織的任何生物。優(yōu)選，所述脂肪組織是哺乳動(dòng)物的，最優(yōu)選所述脂 肪組織是人的。脂肪組織的方便來(lái)源是來(lái)自脂肪抽吸外科手術(shù)，然而，脂 肪組織的來(lái)源或脂肪組織的分離方法對(duì)于本發(fā)明不是決定性的。
成年人髓外脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞表示可以用對(duì)于患者最小的風(fēng) 險(xiǎn)或不適而常規(guī)地采集的基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源。病理學(xué)證據(jù)啟示脂肪來(lái)源的基 質(zhì)細(xì)胞能夠沿著多種世系途徑分化。在許多個(gè)體中，脂肪組織是容易獲得 的并且是大量的。肥胖是美國(guó)中流行比例的病癥，其中超過(guò)50%的成年人 超過(guò)基于他們的高度所推薦的BMI。
充分記載的是，脂肪細(xì)胞是可補(bǔ)充的細(xì)胞群體。即使在通過(guò)抽脂或其 它程序的外科手術(shù)除去以后，通常也看到脂肪細(xì)胞隨著時(shí)間在個(gè)體中的復(fù) 發(fā)。這啟示脂肪組織含有能夠自更新的基質(zhì)干細(xì)胞。
脂肪組織用于組織工程應(yīng)用諸如本發(fā)明的RCB提供許多實(shí)際的優(yōu)勢(shì)。 首先，它是豐富的。第二，可以實(shí)現(xiàn)具有對(duì)于患者最小的風(fēng)險(xiǎn)的采集方法。 第三，它是可再補(bǔ)充的。雖然基質(zhì)細(xì)胞代表小于0.01%的骨髓成核細(xì)胞群
體，但是存在高達(dá)8.6. X 104的基質(zhì)細(xì)胞/克脂肪組織(Sen等2001 ， Journal of Cellular Biochemistry(細(xì)胞生物化學(xué)雜志)81:312-319)。經(jīng)過(guò)2至4周的 先體外后體內(nèi)擴(kuò)展從0.5公斤的脂肪組織得到高達(dá)5億個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。這些 細(xì)胞可以立即使用或冷凍保存用于將來(lái)的自體同源的或異源的應(yīng)用。
已經(jīng)報(bào)道了用于分離、擴(kuò)展、和分化人脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞的方法。 見(jiàn)，例如，Burris等1999， Mol Endocrinol(分子內(nèi)分泌學(xué))13:410-7; Erickson 等2002, Biochem Biophys Res Commim.(生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究交流) 2002年1月18日；290 (2) : 763- 9; Gronthos等2001, Journal of Cellular Physiology(細(xì)胞生理學(xué)雜志)，189:54-63; Halvorsen等2001， Metabolism(代 謝)50:407-413; Halvorsen等2001, Tissue Eng.(組織工程)7(6):729-41; Harp 等2001, Biochem Biophys Res Commun(生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究交流) 281:907-912; Saladin等1999, Cell Growth & Diff(細(xì)胞生長(zhǎng)和分化) 10:43-48; Sen等2001, Journal of Cellular Biochemistry(細(xì)胞生物化學(xué)雜志) 81:312-319; Zhou等1999， Biotechnol. Techniques(生物技術(shù)雜志)13: 513-517。脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞是通過(guò)膠原酶消化和差速離心從切碎的 人脂肪組織獲得的[Halvorsen等2001, Metabolism(代謝)50:407-413; Hauner等1989, J Clin Invest(臨床研究雜志)84:1663-1670; Rodbell等 1966，. JBiolChem(生物化學(xué)雜志)241:130-139]。其他人已經(jīng)表明，人脂肪
組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞可以沿著脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、和成骨細(xì)胞世系途徑 分化。[Erickson等2002， Biochem Biophys Res Commun.(生物化學(xué)和生物 物理學(xué)研究交流)2002年1月18日；290(2): 763-9; Gronthos等2001, Journal of Cellular Physiology(細(xì)胞生理學(xué)雜志)，189:54-63; Halvorsen等 2001, Metabolism(代謝)50:407-413; Halvorsen等，2001, Tissue Eng.(組織工 程)2001年12月7日(6) : 729-41; Harp等2001， Biochem Biophys Res
Commun(生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究交流)281 : 907-912; Saladin等1999, Cell Growth & Diff(細(xì)胞生長(zhǎng)和分化)10:43-48; Sen等2001, Journal of Cellular Biochemistry(細(xì)胞生物化學(xué)雜志)81:312-319; Zhou等1999, Biotechnol. Techniques(生物工藝技術(shù))13: 513-517; Zuk等2001, Tissue Eng.(組織工程)7: 211-228。
匹茲堡大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)董事的WO00/53795和轉(zhuǎn)讓給匹茲堡大 學(xué)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)2002/0076400公開(kāi)了基本上無(wú)脂肪細(xì)胞和紅細(xì)胞 的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞和網(wǎng)格(lattices)以及克隆的結(jié)締組織干細(xì)胞群?？梢?單獨(dú)地或在生物相容的組合物中使用所述細(xì)胞，以在體內(nèi)和在體外產(chǎn)生分 化的組織和結(jié)構(gòu)。另外，可以將所述細(xì)胞擴(kuò)展并且培養(yǎng)以產(chǎn)生激素并且提 供用于支持其它細(xì)胞群體生長(zhǎng)和擴(kuò)展的條件培養(yǎng)基。在另一個(gè)方面中，這 些公布公開(kāi)了基本上無(wú)細(xì)胞的脂來(lái)源的網(wǎng)格，其包括細(xì)胞外基質(zhì)材料形式 的脂肪組織。所述網(wǎng)格可以用作促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化成原基(anlagen)或成 熟組織或結(jié)構(gòu)的基底，無(wú)論在體內(nèi)或體外。沒(méi)有公布公開(kāi)已經(jīng)被誘導(dǎo)表達(dá) 眼內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞的至少一種表型或基因型特征的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。
轉(zhuǎn)讓給Artecel Sciences的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,429,013公開(kāi)了涉及分離的脂 肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的組合物，已經(jīng)將其誘導(dǎo)以表達(dá)軟骨細(xì)胞的至少一 個(gè)特征。也公開(kāi)了用于分化這些細(xì)胞的方法。
作為非限制性實(shí)例，在分離脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)方法中， 將脂肪組織在25C至50C之間、優(yōu)選在33C至40C之間、最優(yōu)選在37C 的溫度，用0.01至0.5%之間、優(yōu)選0.04至0.2%、最優(yōu)選0.1%的濃度的 膠原酶，在O.Ol至0.5%之間、優(yōu)選0.04至0.04%、最優(yōu)選0,2%的濃度的 胰蛋白酶處理10分鐘至3小時(shí)之間、優(yōu)選30分鐘至1小時(shí)之間、最優(yōu)選 45分鐘的時(shí)期。將所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)在20 um至800 Pm之間，更優(yōu)選在 40至400 um之間，最優(yōu)選70 w m的尼龍或干酪包布網(wǎng)孔過(guò)濾器。然后 將細(xì)胞直接在培養(yǎng)基中進(jìn)行差速離心或經(jīng)過(guò)Ficoll或Percoll或其它微粒梯 度?？梢栽?C至50C之間，優(yōu)選在20C至40C之間，最優(yōu)選在25C的溫 度將細(xì)胞在100至3000Xg之間，更優(yōu)選200至1500Xg，最優(yōu)選在500 Xg的速度離心1分鐘至1小時(shí)，更優(yōu)選2至15分鐘，最優(yōu)選5分鐘的時(shí) 期。
本領(lǐng)域已知的是，藻酸鹽凝膠可以通過(guò)與二價(jià)陽(yáng)離子如C^+或Mg2+ 混合以形成離子凝膠而形成。該凝膠可以失去機(jī)械強(qiáng)度并且迅速溶解，原因在于離子損失到周?chē)囵B(yǎng)基中。見(jiàn)，Jon A. Rowley, Gerard Madlambayan， David J. Mooney, Biomaterials(生物材料)20 (1999) 45-53 。這類(lèi)凝膠還可以 用于RCB的載體。
也預(yù)期明膠和它的衍生物可以用作用于RCB的可再吸收的支持基質(zhì)。 明膠在類(lèi)似設(shè)置中的應(yīng)用可以在下列文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)Krishna Burugapalli, Veena Koul, Amit K. Dinda, J Biomed Mater Res(生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志) 68A: 210-218， 2004;禾Q Hye-Won Kang, Yasuhiko Tabata， Yoshito Ikada， Biomaterials(生物材料;)20 (1999) 1339-1344。
也預(yù)期的是，可以使用包括羧甲基纖維素和它的衍生物的組合物和用 于RCB的可再吸收的支持基質(zhì)。片劑制造中的交聯(lián)羧甲基纖維素的應(yīng)用 是公開(kāi)的文獻(xiàn)熟知的，所述文獻(xiàn)諸如Wan和Prasad,微晶纖維素和交聯(lián)羧 甲基纖維素鈉對(duì)于具有甲基纖維素作為粘合劑的片劑的性質(zhì)的影響(Effect
on the Properties of Tablets with Methyl cellulose as a Binder),制藥學(xué)國(guó)際雜 志(International Journal of Pharmaceutics), 41, (1988)159-167。實(shí)際上本領(lǐng)域 己知的是在口服或胃崩解片劑的制造中使用鑒定為交聯(lián)羧甲纖維素鈉的 酸交聯(lián)的羧甲基纖維素，類(lèi)型A， NF或交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮或淀粉羥 乙酸鈉的酸式交聯(lián)的羧甲基纖維素。這樣的組合物可以容易地適合于被普 通技術(shù)人員在沒(méi)有過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下在本發(fā)明中使用。
在RCB的植入之前，可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞層。如果不刺激或除去存在 的內(nèi)皮細(xì)胞，則他們具有引起并發(fā)癥的潛在性。所述細(xì)胞將繼續(xù)從基質(zhì)抽 出流體。該流體抽吸作用可以引起流體在角膜和RCB之間收集，難以對(duì) 著角膜穩(wěn)固地固定。在從存在細(xì)胞的抽吸引起問(wèn)題以前，刺激細(xì)胞將容許 新的細(xì)胞層時(shí)間而在角膜上進(jìn)行匯合。
預(yù)期的是，刺激本發(fā)明的內(nèi)皮細(xì)胞的方法包括暴露于多種波長(zhǎng)的射頻 輻射(RF)， UV ，用核輻射諸如Y輻射照射，以及化學(xué)的方法諸如胰蛋白 酶化，酸，堿，低滲溶液，具有低離子(Mg、 Na、 Ca、 K)的緩沖劑等。
在RCB的植入之前，可以利用真空作用或物理刮削除去內(nèi)皮細(xì)胞層。
已經(jīng)描述了本發(fā)明，在不背離如后附的權(quán)利要求的范圍所限定的本發(fā) 明實(shí)質(zhì)的情況下，許多對(duì)于本發(fā)明的變體對(duì)它所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將變得 顯而易見(jiàn)。將全部在這里敘述的參考文獻(xiàn)通過(guò)參考全部結(jié)合，如同充分陳 述在說(shuō)明書(shū)中。
參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1. 一種在修復(fù)角膜中有用的可再吸收的角膜扣狀體，所述扣狀體包括a)具有頂側(cè)和底側(cè)的可生物降解的聚合物支持基質(zhì)，其能夠支持內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)；b)配置在所述頂側(cè)的適于移植的存活的內(nèi)皮細(xì)胞層；和c)所述可再吸收的角膜扣狀體在植入眼時(shí)是由所述眼充分耐受的。
2. 權(quán)利要求1的可再吸收的角膜扣狀體，其中所述可生物降解的聚合 物支持基質(zhì)選自由下列組成的組透明質(zhì)酸，羊膜，脫乙酰殼多糖，交聯(lián) 膠原，藻酸鹽，脂肪組織，明膠，羧甲基纖維素及其組合。
3. 權(quán)利要求1的可再吸收的角膜扣狀體，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞是角膜內(nèi) 皮細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求2的可再吸收的角膜扣狀體，其中所述可生物降解的聚合物支持基質(zhì)包括透明質(zhì)酸并且其中所述內(nèi)皮細(xì)胞是角膜內(nèi)皮細(xì)胞。
5. 權(quán)利要求2的可再吸收的角膜扣狀體，其中所述可生物降解的聚合物支持基質(zhì)包括交聯(lián)膠原并且其中所述內(nèi)皮細(xì)胞是角膜內(nèi)皮細(xì)胞。
6. —種修復(fù)角膜的方法，所述方法包括a) 獲得聚合物支持基質(zhì)；b) 從需要移植的患者采集角膜內(nèi)皮細(xì)胞或利用儲(chǔ)存的內(nèi)皮細(xì)胞；c) 通過(guò)在所述聚合物支持基質(zhì)的表面上培養(yǎng)和擴(kuò)展采集的或儲(chǔ)存的 角膜內(nèi)皮細(xì)胞直到所述細(xì)胞達(dá)到匯合而制備可再吸收的角膜扣狀體；d) 在需要移植的眼上實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)DLEK，角膜-鞏膜切割以便接近所述 角膜的前房；e) 將所述可再吸收的角膜扣狀體植入在所述角膜前房中存在的內(nèi)皮 細(xì)胞的頂部以便移植的內(nèi)皮細(xì)胞與所述角膜前房的細(xì)胞密切接觸；f) 將透明質(zhì)酸酶注射到所述前房中；和g) 閉合所述眼的切口。
7. 權(quán)利要求6的修復(fù)角膜的方法，其中在所述植入步驟e)之前，刺激 所述將要接收可再吸收的角膜扣狀體的角膜位置中的內(nèi)皮細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供包括能夠支持內(nèi)皮細(xì)胞在其表面生長(zhǎng)和擴(kuò)展的可生物降解的聚合物的可再吸收的角膜扣狀體，用于在將健康的角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植到需要移植的角膜組織的應(yīng)用，及其使用方法。
文檔編號(hào)A61K35/44GK101384704SQ200680046714
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2006年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者安東尼·李, 漢克·維, 董紹勝, 革明·呂 申請(qǐng)人:細(xì)胞生物工程公司