本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，特別是涉及一種殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法。
背景技術(shù)：
：在戰(zhàn)爭時期，80%以上的傷亡是因外傷失血而失去生命；和平年代，因自然災(zāi)害、事故災(zāi)難等突發(fā)事件造成的外傷引起的大量失血也是傷殘、死亡的主要原因。傳統(tǒng)的止血棉紗、繃帶等對于不規(guī)則形狀、深、窄、動脈破裂等創(chuàng)傷的止血效果很不理想；止血粉雖然具有優(yōu)良的傷口適用性，但易進(jìn)入血液阻塞末梢動脈流動形成血栓。因此需要一種適用于現(xiàn)場和臨床急救用的，快速、安全、高效的止血材料來代替?zhèn)鹘y(tǒng)止血材料。殼聚糖是甲殼素脫乙酰后產(chǎn)生的一種天然生物多糖，迄今是自然界唯一的堿性多糖，其自然資源十分豐富。由于具有優(yōu)良的生物相容性、廣譜抗菌性、止血促傷口愈合作用，且可生物降解安全無毒，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、生物工程等領(lǐng)域。瓊膠是由紅藻如石花菜、紫菜、江蘺等提取的海洋多糖，是由C1，3連接的β-D-半乳糖和C1，4連接的3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖殘基交替連接的鏈狀中性糖。作為一種多糖，瓊膠黏度高，水溶性低，不易被吸收，因此在應(yīng)用方面受到很大限制。但通過降解得到的瓊膠低聚糖，水溶性好，有利于人體吸收，不僅具有功能性低聚糖的一般特性，還具有較強(qiáng)的抗癌、抗氧化、抗炎、吸濕等活性，且無毒副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。在止血材料產(chǎn)品中，2002年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了一種殼聚糖基外用HemCon止血繃帶，并將其應(yīng)用在伊拉克和阿富汗戰(zhàn)場上，在輕度出血創(chuàng)面的應(yīng)用中效果顯著，但在動脈出血止血時常常因非專業(yè)人士操作難以找準(zhǔn)出血點而影響實際效果，不適用于嚴(yán)重出血，特別是不規(guī)則形狀、深、窄、動脈破裂等創(chuàng)傷的止血。同在2002年，QuikClot沸石止血粉通過FDA批準(zhǔn)用于嚴(yán)重出血創(chuàng)傷的急救，但在使用中QuikClot止血粉存在放熱反應(yīng)會超過100℃高溫的缺陷，造成創(chuàng)面組織傷害。粉末狀止血材料很容易在脈管內(nèi)腔殘留，阻塞末梢動脈流動形成血栓。WoundStat止血劑于2008年獲得美國FDA認(rèn)可并在同年大量應(yīng)用于軍隊，但后來發(fā)現(xiàn)存在進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)引起末梢血栓的風(fēng)險，基于生物安全考慮，美軍2009年已宣布禁止永遠(yuǎn)使用WoundStat。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種能快速止血的同時，兼?zhèn)淞己玫纳锖徒M織相容性，并解決顆粒物易殘留帶來的生物安全隱患的殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法。本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括如下步驟：S1.分別制備2%~3%（W/V）殼聚糖溶液和0.5%~1.5%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液，所述殼聚糖溶液溶劑為1%-3%（V/V）醋酸水溶液；取等體積殼聚糖溶液和瓊膠低聚糖水溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油加入到體積比為4:6的異丙醇/異辛醇復(fù)合醇溶液中，1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油在異丙醇/異辛醇復(fù)合醇溶液中含量為0.5%~2%（V/V），在超聲功率130~150W的條件下，將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液滴加到含有1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油的異丙醇/異辛醇復(fù)合醇溶液中，其中，殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液和含有1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油的異丙醇/異辛醇復(fù)合醇溶液的體積比為1:4~6，滴加完畢停止超聲，600~800rpm攪拌30分鐘得球珠；S3.過濾出球珠后經(jīng)洗滌、預(yù)凍、冷凍干燥即得殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料。本發(fā)明制備方法通過選用異丙醇/異辛醇復(fù)合醇溶液，并加入1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油作為交聯(lián)劑與殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液反應(yīng)制備的多孔球珠止血材料孔隙率大、溶脹效果優(yōu)良，可快速吸水溶脹，封堵創(chuàng)面，迅速促成血凝，具有高效止血活性；且制備的多孔球珠止血材料具有一定體積，不易進(jìn)入血液引起血栓風(fēng)險。優(yōu)選地，S3所述洗滌是指先后分別用體積濃度為100%和50%的乙醇洗滌球珠3次以上。采用上述方法制備得到的殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料，其特征在于，所述殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為0.5~2mm，孔隙率為55%~90%，溶脹后粒徑為4~8mm。優(yōu)選地，所述殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為1.4~2mm，孔隙率為83%~90%，溶脹后粒徑為7.4~8mm。優(yōu)選地，上述方法中，所述殼聚糖分子量為200~600kDa、脫乙酰度80%~95%；所述瓊膠低聚糖分子量為1000~3000Da。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明通過控制制備方法中溶劑的含量和配比、交聯(lián)劑的選用，制備的殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料孔隙率大，溶脹效果優(yōu)良，可快速吸水溶脹，封堵創(chuàng)面，迅速促成血凝，具有高效止血活性；具有一定體積，不易進(jìn)入血液引起血栓風(fēng)險。同時，制備的止血材料生物相容性好，安全無毒；具備優(yōu)良的傷口適應(yīng)性，特別適用于深、窄和不規(guī)則的創(chuàng)傷止血。本發(fā)明制備工藝簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋說明，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。實施例1殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用1%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量200kDa，脫乙酰度95%），制備2%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解瓊膠低聚糖（分子量2000Da），制備0.5%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油（2%，V/V）加入到異丙醇/異辛醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，置于超聲儀中超聲，超聲功率為130W；將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：5），滴加完畢停止超聲，600rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為0.5mm，孔隙率為55%，溶脹后粒徑可達(dá)4.0mm。實施例2殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用2%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量300kDa，脫乙酰度85%），制備2.5%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解瓊膠低聚糖（分子量3000Da），制備1.0%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油（1.5%，V/V）加入到異丙醇/異辛醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，置于超聲儀中超聲，超聲功率為135W；將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：4），滴加完畢停止超聲，700rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為0.9mm，孔隙率為73%，溶脹后粒徑可達(dá)6.2mm。實施例3殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用2%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量400kDa，脫乙酰度90%），制備3%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解瓊膠低聚糖（分子量2000Da），制備1.5%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油（1%，V/V）加入到異丙醇/異辛醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，置于超聲儀中超聲，超聲功率為140W；將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：5），滴加完畢停止超聲，700rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為1.4mm，孔隙率為90%，溶脹后粒徑可達(dá)8.0mm。實施例4殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用3%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量600kDa，脫乙酰度80%），制備3%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解瓊膠低聚糖（分子量1000Da），制備1.5%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油（0.5%，V/V）加入到異丙醇/異辛醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，置于超聲儀中超聲，超聲功率為150W；將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：6），滴加完畢停止超聲，800rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為2.0mm，孔隙率為83%，溶脹后粒徑可達(dá)7.4mm。對比例1殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用1%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量200kDa，脫乙酰度95%），制備2%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解瓊膠低聚糖（分子量2000Da），制備0.5%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油（2%，V/V）加入到乙醇-異丙醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，置于超聲儀中超聲，超聲功率為130W；將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：5），滴加完畢停止超聲，600rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為0.3mm，孔隙率為38%，溶脹后粒徑1.1mm。對比例2殼聚糖-低聚半乳糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用1%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量200kDa，脫乙酰度95%），制備2%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解低聚半乳糖（分子量2000Da），制備0.5%（W/V）低聚半乳糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-低聚半乳糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油（2%，V/V）加入到異丙醇/異辛醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，置于超聲儀中超聲，超聲功率為130W；將上述殼聚糖-低聚半乳糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：5），滴加完畢停止超聲，600rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為1.6mm，孔隙率為35%，溶脹后粒徑6.1mm。對比例3殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用1%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量200kDa，脫乙酰度95%），制備2%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解瓊膠低聚糖（分子量2000Da），制備0.5%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將1,3-二環(huán)氧甘油醚甘油（2%，V/V）加入到異丙醇/異辛醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，磁力攪拌；將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：5），滴加完畢，600rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為2.6mm，孔隙率為31%，溶脹后粒徑可達(dá)4.3mm。對比例4殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料的制備方法，包括以下步驟：S1.用1%（V/V）醋酸水溶液溶解殼聚糖（分子量200kDa，脫乙酰度95%），制備2%（W/V）殼聚糖溶液；用純凈水溶解瓊膠低聚糖（分子量2000Da），制備0.5%（W/V）瓊膠低聚糖水溶液；取等體積的上述二者溶液混勻，制得殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液；S2.將戊二醛（2%，V/V）加入到異丙醇/異辛醇（體積比4：6）復(fù)合醇中，置于超聲儀中超聲，超聲功率為130W；將上述殼聚糖-瓊膠低聚糖復(fù)合溶液用8號針頭滴加到復(fù)合醇中（復(fù)合溶液與復(fù)合醇溶液體積比1：5），滴加完畢停止超聲，600rpm攪拌30分鐘；S3.分出球珠，先后分別用濃度為100%和50%（V/V）乙醇洗滌，-30℃預(yù)凍，冷凍干燥即得多孔球珠。該止血材料干燥狀態(tài)的粒徑為0.7mm，孔隙率為26%，溶脹后粒徑1.9mm。體外凝血實驗：自新西蘭兔耳緣靜脈取血于真空采血管中（含有枸櫞酸鈉抗凝劑，3.8%枸櫞酸鈉∶血=1∶9），備用；取潔凈透明的塑料試管，分別加入50mg上述實施例和對比例中的樣品，輕搖試管使樣品盡量鋪開?？瞻自嚬茏麝幮詫φ?，云南白藥粉作陽性對照，每樣品設(shè)三支試管做平行試驗。依次將1mL新鮮抗凝兔血加入上述試管中，平穩(wěn)地移入37℃水浴中，開始計時；每隔30s將每組試管緩慢傾斜一次（角度小于30°），直至試管緩慢倒置血液不流動為止，按停秒表，記下該組凝血時間，時間超30分鐘記作“不凝血”，實驗數(shù)據(jù)均以“`x±s”表示，結(jié)果見表1。表1體外凝血實驗結(jié)果樣品凝血時間（s）空白對照不凝血云南白藥255±4實施例1263±6實施例2236±5實施例3123±4實施例4168±5對比例1471±4對比例2582±6對比例3484±3對比例4522±4從表1中可看出，實施例1、2制備的殼聚糖-瓊膠低聚糖多孔球珠止血材料凝血活性高，與云南白藥效果相當(dāng)，且粒徑大不會進(jìn)入血液，解決了云南白藥等顆粒物易殘留帶來的生物安全隱患；實施例3、4的孔隙率大、溶脹后粒徑大，快速吸水溶脹，封堵創(chuàng)面，迅速促成血凝，其凝血活性比云南白藥高，且粒徑大不會進(jìn)入血液。從對比例1-4可以看出，通過改變本發(fā)明制備條件而獲得的材料，其止血時間大大延長，止血活性差。當(dāng)前第1頁1 2 3