一、技術領域
本發(fā)明涉及生物、化學和藥品領域，特別涉及羥基酪醇脂質體的制備方法。
二、
背景技術：
脂質體主要是由類脂材料組成的雙分子層空心小球，同時具有親水性和疏水性兩種性質，因此既能包封脂溶性物質又能包埋水溶性物質。將類脂材料分散于水中時，水溶性物質會自發(fā)地分布在脂質體的內部，而脂溶性物質分布在脂質體的親脂端。脂質體的制備方法主要有：薄膜分散法、超聲波分散法、凍融法、乙醇注入法、逆相蒸發(fā)法等。其理化性質的評價指標主要有：脂質體平均粒徑及其粒徑分布、包封率、物化穩(wěn)定性等。制備的脂質體具有靶向性、緩釋性、保護性、低劑量、長效性、低毒性等優(yōu)點。
長循環(huán)脂質體又稱長效脂質體，是一種表面含有天然或合成聚合物修飾的類脂衍生物的新型脂質體。在血液中駐留時間延長，從而延長藥物作用時間，具有長效作用。常用的修飾物有聚乙二醇(peg)和神經節(jié)甘酯(gm1)。gm1增強膜剛性，減少單核吞噬細胞系統(tǒng)(mps)的攝取，這種長循環(huán)脂質體在血液中的滯留量與被mps攝取量的比值高于傳統(tǒng)脂質體幾十倍。但gm1難以大量獲得，且有一定的免疫毒性。含有peg的類脂衍生物，它們在脂質體表面具有高度修飾的作用，能形成空間位阻層，這種立體位阻能夠保護脂質體不被識別、攝取，使其消除減慢，作用時間延長。
油橄欖中包含大量的多酚類化合物，如橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等。尤其是羥基酪醇(3，4-二羥基苯乙醇，hydroxytyrosol，簡稱ht)，清除自由基的能力強，表現(xiàn)出獨特的生物和藥理活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心臟的冠脈血流、有效地抑制由丙烯醛造成視網膜上皮細胞的氧化損傷和線粒體功能失調，保護軟骨和抗骨質疏松等。而且ht還能抑制人類早幼細胞白血病細胞hl-60、結腸癌細胞ht-29、女性乳腺癌細胞mcf-7等擴散，透過阻滯腫瘤細胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡，具有很好的抗癌活性。盡管ht有諸多生物和藥理活性，已逐漸引起研究者的關注。但是，ht含有3個酚羥基，暴露在空氣中極易被氧化，性質很不穩(wěn)定。且親水性強，難以更好地溶于細胞膜結構以增強其功效性。如果將ht制備為脂質體后，不但能保護其不受外界環(huán)境因素的影響提高穩(wěn)定性，還能增強其生物利用度(抗癌、抗菌、抗氧化等生物活性)。
國內外的文獻報道了從油橄欖葉或橄欖果提取分離橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等多酚類化合物，但目前采用橄欖葉提取油橄欖多酚提取物大多是10～40％橄欖苦苷提取物，羥基酪醇含量小于10％，毛蕊花苷低于5％，限制油橄欖多酚活性的多功能開發(fā)。
三、
技術實現(xiàn)要素：
為了解決橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等高活性多酚穩(wěn)定性與生物活性，本發(fā)明找到一種富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物復合方法，并且加工成長循環(huán)脂質體，因此，本發(fā)明的技術方案是采用如下步驟來實現(xiàn)：
第一步：油橄欖多酚提取物制備
取油橄欖葉，加入30～50％乙醇提取，油橄欖葉與30～50％乙醇質量體積比(kg∶l)1∶5～20，提取兩次，溫度70～85℃，合并提取液，濾液過陶瓷膜(孔徑50nm)和分子量3000da超濾膜，再用納濾膜濃縮濾液，濾液過納濾膜，橄欖葉與濃縮濾液質量體積比(kg∶l)1∶1～3，濃縮液真空干燥，粉碎成粉制成油橄欖多酚提取物，hplc分析，其中橄欖苦苷10～40％，毛蕊花苷3～6％，羥基酪醇2～7％，水溶性為100ml水溶解2～8g；
第二步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物制備
將90％羥基酪醇與10～40％橄欖苦苷提取物及90％毛蕊花苷復配，按質量比例為4～8∶2～5∶1～3，加入3～8倍無水乙醇，60～90℃加熱回流10～30min，樣品充分溶解后過濾，減壓濃縮，制備富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物，其中羥基酪醇為50～70％，橄欖苦苷為10～20％，毛蕊花苷為5～15％；
第三步：薄膜分散-機械振蕩法制備長循環(huán)油橄欖多酚脂質體
以富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物為包封目標，設計溫度40～70℃、卵磷脂與膽固醇質量比為1∶1～8∶1，稱卵磷脂與膽固醇質量3～10g，表面活性劑吐溫-80體積2～10ml，peg2001～5g，放人圓底燒瓶中，加入適量有機溶劑，超聲振蕩5～20min，溶解后減壓薄膜蒸發(fā)除去溶劑，再加入1～4mg/ml羥基酪醇(ht)水溶液1～10ml，油橄欖多酚水溶液1～3ml，旋轉洗膜水化時間5～50min，再超聲溶解5～30min可得到脂質體。根據(jù)單因素與正交設計優(yōu)化，制備均勻的乳白色長循環(huán)脂質體，具有穩(wěn)定性、緩釋性、抗氧化性和抑菌性等功能；
第四步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體包封率
取脂質體于燒杯中，加入去離子水，脂質體與去離子水質量體積比濃度為2～15mg/ml，放入透析袋中，在室溫下透析1～15h，hplc分析水溶性中ht濃度(c)和透析濾液中ht濃度(c0)，ht水溶性體積(v)，透析濾液的總體積(v0)，根據(jù)下式計算富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體包封率為20～80％以上；
第五步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體平均粒度及其分布
將1～10mg/ml脂質體放入比色皿中，加入一定量的去離子水，用zetaplus型激光粒度儀在光源波長368nm和散射角90°下室溫測試，制備的脂質體的粒徑分布在200～1000nm。
第六步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的穩(wěn)定性
1.物理穩(wěn)定性：取1～8mg/ml脂質體懸濁液和相同濃度ht水溶液，分別用4000r/min～10000r/min離心機離心10～20min，制備的脂質體在4000～6000r/min無沉淀和不分層，乳液穩(wěn)定；于4℃～25℃下貯藏0～30d，脂質體中羥基酪醇和毛蕊花苷穩(wěn)定，相同條件下比ht水溶液中ht穩(wěn)定性提高20～40％；
2.水解穩(wěn)定性：在薄膜分散-機械振蕩法制備脂質體懸浮液，在ph值為3.0～7.0的檸檬酸緩沖液(0.1～0.5mol/l檸檬酸溶液與0.2～0.5mol/l磷酸氫二鈉溶液)，分別測定各脂質體的包封率，結果是，隨著水化液ph值的升高，包封率增加。
第七步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的緩釋性
配制ht濃度為1～8mg/ml脂質體懸液，移取懸液1～5ml放入透析袋內，將其完全浸入含有100ml生理鹽水的燒杯中；將燒杯放入37℃恒溫的水浴鍋內，在24h內每間隔2h分析透析濾液中ht濃度。與相同濃度ht水溶液作對照，ht水溶液2h內釋放了(43.66±1.82)％，脂質體釋放了(28.62±1.87)％；24h后，ht溶液和脂質體釋放分別為(73.41±1.72)％和(55.72±1.88)％，相同條件下脂質體提高30～65％的緩釋性能。
第八步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的抗氧化性
將脂質體懸液和ht水溶液樣品分別配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/ml的無水乙醇待測溶液。1ml待測樣品加入40mg/ldpph醇溶液3ml，充分混勻后，室溫下避光反應30min，在517nm波長下測定吸光度(ai)。每個樣品平行3次，取平均值。經計算得知ht脂質體的ic50為0.5～2μg/ml，為ht水溶液和脂質體對dpph自由基清除效果大體一致。說明利用脂質體技術把ht制備成相應脂質體后，它對dpph自由基的清除效果并沒有受到影響。
樣品溶液對dpph自由基清除率(η)的計算公式如下：
式中：
a0——1ml待測樣品與3ml無水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值)；
a1——1ml無水乙醇與3mldpph醇溶液混合反應30min后的吸光值(自由基總值)；
ai——1ml待測樣品與3mldpph醇溶液混合反應30min后的吸光值。
第九步：富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的抑菌性
采用菌體濃度為105cfu/ml的菌懸液配制脂質體懸液和ht水溶液樣品濃度濃度依次為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml的樣品溶液。將上述配好的溶液放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱內，37℃培養(yǎng)24h后觀察結果，試管中幾乎無渾濁現(xiàn)象對應的樣品濃度作為此樣品的mic值。每種樣品做3個平行測試。在mic測定結果的基礎上，選取未見細菌生長的各管培養(yǎng)液，移取0.1ml涂布于固體培養(yǎng)基上，放置37℃培養(yǎng)箱內，24h后觀察結果，仍無細菌生長現(xiàn)象對應的樣品濃度作為此樣品的mbc值。相對于ht水溶液，脂質體的抑菌效果相當，且對金黃色葡萄球菌的mic為4～16μg/ml，mbc值為16～64μg/ml。對大腸桿菌的mic為16～64μg/ml，mbc值為32～128μg/ml。
橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等多酚類化合物具有較好醇溶性，目前市場生產的橄欖提取物不僅橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等多酚類化合物含量低，而且水溶性不好，為了改善橄欖苦苷提取物水溶性，有利于脂質體制備與活性，在本發(fā)明中，采用30～50％乙醇提取油橄欖葉，提取兩次，溫度70～85℃，采用陶瓷膜(孔徑50nm)和分子量3000da超濾膜過濾，再用納濾膜濃縮濾液，去掉大分子蛋白、多糖、膠質體、單寧等，濃縮物為水溶性小分子橄欖苦苷、羥基酪醇、毛蕊花苷等多酚類化合物，真空干燥，粉破成粉制成油橄欖多酚提取物，水溶性為100ml水溶解1～6g，具有很好的水溶性。
為了達到油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的效果，本發(fā)明采用薄膜分散-機械振蕩法。旋蒸減壓成膜壓力-0.05～-0.1mpa，溫度50～70℃、真空冷凍干燥成膜壓力2～10mpa，溫度-10～-50℃，超聲機械振蕩功率100～200w，時間20～40min，高速剪切功率500～1000w，時間5～10min，采用其中一種或者幾種方法達到薄膜分散的效果。
為了改善油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的穩(wěn)定性，采用磷脂為表面活性乳化劑，優(yōu)選大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂和氫化大豆磷脂中的一種或復合。為了更好的分散，也添加膽固醇質量3～10g，表面活性劑吐溫-80體積2～10ml，peg2001～5g，形成均一穩(wěn)定的乳相。為了油橄欖多酚提取物及乳化助劑充分溶解形成均相，采用無水乙醇、丙酮、異丙酮和氯仿中的一種作為有機溶劑。
本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為：
創(chuàng)新性制備富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物，羥基酪醇為50～70％，橄欖苦苷為10～20％，毛蕊花苷為5～15％，活性多酚中羥基酪醇、橄欖苦苷和毛蕊花苷比例合理，水溶性高達100ml水溶解6g多酚提取物，濃度高，抗氧化活性更高。
2.采用薄膜分散-機械振蕩法制備了油橄欖多酚提取物脂質體，包封率高、粒徑分布均勻、穩(wěn)定性好；
3.制備的富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體具有緩釋性，可減少用藥次數(shù)；
4.制備的富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體具有一定的抗氧化性和抑菌性。
四、附圖說明：
附圖1溫度對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體包封率的影響；
附圖2卵膽比對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體包封率的影響；
附圖3吐溫-80體積對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體包封率的影響；
附圖4ht質量對富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體包封率的影響。
五、具體實施方式
以下實施例為本發(fā)明的一些舉例，不應被看做是對本發(fā)明的限定。
實施例1
油橄欖多酚提取物制備
取1kg油橄欖葉，加入30％乙醇8l提取，溫度85℃，提取時間2小時，提取兩次，合并提取液，分別采用陶瓷膜(孔徑50nm)和分子量3000da超濾膜過濾，再用納濾膜濃縮濾液至1.5l，濃縮物真空干燥，粉破成粉制成油橄欖多酚提取物，hplc分析，其中橄欖苦苷36.8％，毛蕊花苷5.6％，羥基酪醇3.4％，水溶性為100ml水溶解5.2g。
實施例2
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物制備
將90％羥基酪醇與36.8％橄欖苦苷提取物及90％毛蕊花苷復配，按質量比例為4～8∶2～5∶1～3，優(yōu)選4～5∶2～3∶1～2，加入4倍無水乙醇，60℃加熱回流20min，樣品充分溶解后過濾，減壓濃縮，制備富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物，hplc分析，其中羥基酪醇為56％，橄欖苦苷為18％，毛蕊花苷為7％；
為了達到油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的效果，本發(fā)明采用薄膜分散-機械振蕩法。旋蒸減壓成膜壓力-0.05～-0.1mpa，溫度50～70℃、真空冷凍干燥成膜壓力2～10mpa，溫度-10～-50℃，超聲機械振蕩功率100～200w，時間20～40min，高速剪切功率500～1000w，時間5～10min，采用其中一種或者幾種方法達到薄膜分散的效果。
為了改善油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的穩(wěn)定性，采用磷脂為表面活性乳化劑，優(yōu)選大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂和氫化大豆磷脂中的一種或復合。為了更好的分散，也添加膽固醇質量3～10g，表面活性劑吐溫-80體積2～10ml，peg2001～5g，形成均一穩(wěn)定的乳相。為了油橄欖多酚提取物及乳化助劑充分溶解形成均相，采用無水乙醇、丙酮、異丙酮和氯仿中的一種作為有機溶劑。
實施例3
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的制備
以富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物為包封目標，設計溫度40～70℃，優(yōu)選55℃，卵磷脂與膽固醇質量比為3∶1稱卵磷脂與膽固醇質量4g，表面活性劑吐溫-80體積5ml，peg2003.5g，放入圓底燒瓶中，加入丙酮，超聲振蕩10min，溶解后減壓薄膜蒸發(fā)除去溶劑，旋蒸減壓成膜壓力-0.05～-0.1mpa，溫度50～70℃、真空冷凍干燥成膜壓力2～10mpa，溫度-10～-50℃，超聲機械振蕩功率100～200w，時間20～40min，高速剪切功率500～1000w，時間5～10min。再加入3mg/ml羥基酪醇(ht)水溶液6ml，油橄欖多酚提取物水溶液2ml，旋轉洗膜水化時間15min，再超聲溶解20min可得到脂質體。
實施例4
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的包封率
取0.05g脂質體于燒杯中，加入10ml去離子水，再放入處理過的透析袋中，在室溫下透析9h后測定其中ht含量，并計算ht的包封率。脂質體包封率的計算公式：
式中：
c——ht水溶液的濃度，mg/ml；
v——ht水溶液的體積，ml；
c0——透析濾液中ht的濃度，mg/ml；
v0——透析濾液的總體積，ml。
當ht水溶液濃度為2mg/ml，ht水溶液體積為2ml，卵膽比為4∶1(卵磷脂80mg，膽固醇20mg，下同)，吐溫-80為6ml，制備溫度為65℃，可得到ht脂質體的包封率為37.51％。
實施例4
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的緩釋性
配制ht濃度為1mg/ml脂質體懸液，移取懸液2ml放入透析袋內，將其完全浸入含有100ml生理鹽水的燒杯中；將燒杯放入37℃恒溫的水浴鍋內，在24h內每間隔2h分析透析濾液中ht濃度。與相同濃度ht水溶液作對照，ht水溶液2h內釋放了(43.66±1.82)％，脂質體釋放了(28.62±1.87)％；24h后，ht溶液和脂質體釋放分別為(73.41±1.72)％和(55.72±1.88)％，相同條件下脂質體提高30～55％的緩釋性能。
實施例5
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的抗氧化性
將脂質體懸液和ht水溶液樣品分別配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/ml的無水乙醇待測溶液。1ml待測樣品加入40mg/ldpph醇溶液3ml，充分混勻后，室溫下避光反應30min，在517nm波長下測定吸光度(ai)。每個樣品平行3次，取平均值。經計算得知ht脂質體的ic50為0.5～2μg/ml，為ht水溶液和脂質體對dpph自由基清除效果大體一致。說明利用脂質體技術把ht制備成相應脂質體后，它對dpph自由基的清除效果并沒有受到影響。
樣品溶液對dpph自由基清除率(η)的計算公式如下：
式中：
a0——1ml待測樣品與3ml無水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值)；
a1——1ml無水乙醇與3mldpph醇溶液混合反應30min后的吸光值(自由基總值)；
ai——1ml待測樣品與3mldpph醇溶液混合反應30min后的吸光值。
實施例6
富含羥基酪醇和毛蕊花苷油橄欖多酚提取物長循環(huán)脂質體的抑菌性
采用菌體濃度為105cfu/ml的菌懸液配制ht脂質體懸液和ht水溶液樣品濃度濃度依次為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml的樣品溶液。將上述配好的溶液放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱內，37℃培養(yǎng)24h后觀察結果，試管中幾乎無渾濁現(xiàn)象對應的樣品濃度作為此樣品的mic值。每種樣品做3個平行測試。在mic測定結果的基礎上，選取未見細菌生長的各管培養(yǎng)液，移取0.1ml涂布于固體培養(yǎng)基上，放置37℃培養(yǎng)箱內，24h后觀察結果，仍無細菌生長現(xiàn)象對應的樣品濃度作為此樣品的mbc值。相對于ht水溶液，脂質體的抑菌效果相當，且對金黃色葡萄球菌的mic和mbc值分別為8和32μg/ml。對大腸桿菌的mic和mbc值分別為32和64μg/ml。