本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于維生素e衍生物的納米膠束藥物載體、納米膠束藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在過去幾十年里，納米藥物逐漸成為提高化療效果的新選擇。然而，多藥耐藥性仍是對抗癌癥的一大障礙。與運(yùn)輸相關(guān)的多藥耐藥產(chǎn)生的一個主要原因是由于藥物外排泵的過表達(dá)，如會將多種藥物排出細(xì)胞的p-糖蛋白(p-gp)。由于目前廣泛使用的如阿霉素、紫杉醇、長春花堿等結(jié)構(gòu)不一的化療藥物均是p-糖蛋白的底物，因此p-糖蛋白過表達(dá)的癌癥成為臨床化療的一大挑戰(zhàn)。其通過促進(jìn)向胞外的輸出而引起胞內(nèi)藥物積累量的下降，從而使得治療效果下降，并導(dǎo)致耐藥腫瘤治療更加復(fù)雜化。
d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs1k)是一種由疏水部分α-tos(α-生育酚琥珀酸酯，維生素e的衍生物)和分子量為1kda的親水部分peg(聚乙二醇)組成的非離子型雙親性分子。tpgs1k是被fda批準(zhǔn)的一種安全性藥用輔料。它的主要優(yōu)點之一就是其可以克服多藥耐藥的能力。據(jù)報道，tpgs1k是一種p-糖蛋白的抑制劑，其作用機(jī)理是可以抑制p-糖蛋白的atp酶，而這種酶是為p-糖蛋白在排出藥物時提供能量。然而，tpgs1k的親水端不足夠長來提高膠束在血液中的循環(huán)時間。另外，tpgs1k的臨界膠束濃度(cmc)相當(dāng)高(0.2mg/ml)，也就意味著其在血液循環(huán)中將不穩(wěn)定。
鑒于此，含有2kda的peg分子的tpgs2k(其cmc為0.02mg/ml)，被引入混合膠束以降低cmc值，不僅能提高膠束的穩(wěn)定性，還能延長膠束在血液中的循環(huán)時間。同時tpgs2k也可作為附加的藥物載體。然而，僅僅tpgs-1k和tpgs-2k的組合，由于其疏水內(nèi)核的疏水性不強(qiáng)，不能夠負(fù)載足夠多的藥物，藥物負(fù)載量少，抗腫瘤的效果不能提高。
因此，在本領(lǐng)域中開發(fā)一種既能夠提高膠束穩(wěn)定性又能夠提高藥物負(fù)載量，并具有良好抗腫瘤效果的藥物膠束是本領(lǐng)域研究的重點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于維生素e衍生物的納米膠束藥物載體、納米膠束藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一方面，本發(fā)明提供一種基于維生素e衍生物的納米膠束藥物載體，所述納米膠束藥物載體是由d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(tpgs1k)、d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯(tpgs2k)和α-生育酚琥珀酸酯(α-tos)形成的納米膠束。
在本發(fā)明中，通過d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯與d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯和α-生育酚琥珀酸酯相互配合，使得形成的納米膠束載體親水和疏水作用達(dá)到較好的平衡，在保證具有高的膠束穩(wěn)定性的同時，具有較好的p-糖蛋白抑制能力，具有較好的抗腫瘤效果，并且對正常細(xì)胞具有較小的毒性，具有良好的生物相容性。
在本發(fā)明中，所述d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯與d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯均為維生素e衍生物。
在本發(fā)明中，如果不使用α-tos，僅利用tpgs1000和tpgs2000是不能很穩(wěn)定地負(fù)載dox。
優(yōu)選地，所述d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯與d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯的質(zhì)量比為1:10～10:1，例如1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，優(yōu)選2:1～1:2，進(jìn)一步優(yōu)選1:1。超出1:10～10:1的范圍，例如質(zhì)量比過大會增加對正常細(xì)胞的毒性；質(zhì)量比過小就達(dá)不到抑制p-gp的效果。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)，1:1的效果是最好的，對正常細(xì)胞毒性小并且p-gp抑制效果最好。
優(yōu)選地，所述α-生育酚琥珀酸酯的質(zhì)量與d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯和d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯的總質(zhì)量的比值為0.25:1～10:1，例如0.25:1、0.38:1、0.5:1、0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，優(yōu)選0.5:1～3:1，進(jìn)一步優(yōu)選1:2。α-生育酚琥珀酸酯在這里能起到損傷線粒體的作用，因此比例過小會導(dǎo)致對線粒體的損傷能力不足，而比例過大又會導(dǎo)致體系不穩(wěn)定，對抗腫瘤藥物的包裹能力會降低。
優(yōu)選地，所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物載體的平均粒徑為5～80nm，例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、18nm、20nm、23nm、25nm、28nm、30nm、35nm、38nm、40nm、43nm、45nm、48nm、50nm、55nm、58nm、60nm、65nm、68nm、70nm、75nm、78nm或80nm，優(yōu)選10～40nm。
另一方面，本發(fā)明提供一種納米膠束藥物組合物，所述納米膠束藥物組合物以如上所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物載體作為載體，包載有疏水性抗腫瘤藥物。
在本發(fā)明中，通過d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯與d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯和α-生育酚琥珀酸酯相互配合，使得形成的納米膠束載體親水和疏水作用達(dá)到較好的平衡，在保證具有高的膠束穩(wěn)定性的同時，可以提高藥物的包封率，并且具有較好的p-糖蛋白抑制能力，具有良好的抗腫瘤效果，并且對正常細(xì)胞具有較小的毒性，具有良好的生物相容性。
在本發(fā)明中，tpgs1k和tpgs2k均是雙親性的，其中tpgs1k可以抑制p-糖蛋白，從而增加藥物在胞內(nèi)的積累，tpgs2k具有的長peg鏈成為體系親水端的外殼以避免蛋白的吸附，能夠增強(qiáng)納米膠束載體的親水作用，提高納米載體在體內(nèi)水環(huán)境下的穩(wěn)定性，α-tos作為疏水端，能夠提高納米載體對疏水藥物的包載能力，并且能夠與tpgs1k和tpgs2k聯(lián)合使得體系的親水和疏水作用達(dá)到良好的平衡，增加納米粒子在生理條件下的穩(wěn)定性，并且α-tos也具有抗腫瘤的能力，可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基(ros)，從而降低線粒體膜電位(mmp)，使得細(xì)胞色素c釋放至胞質(zhì)，進(jìn)一步活化細(xì)胞凋亡的caspase通路。另外，α-tos具有癌細(xì)胞的高選擇性，對于正常細(xì)胞毒性小甚至幾乎沒有毒性。因此，α-tos的引入也可以與抗腫瘤藥物協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤的效果，提高對腫瘤細(xì)胞殺傷性，并且α-tos的引入也更加能夠提高納米膠束體系對腫瘤細(xì)胞的靶向性，減小對正常細(xì)胞的毒性。
優(yōu)選地，所述疏水性抗腫瘤藥物為阿霉素、紫杉醇或長春花堿中的任意一種或至少兩種的組合。
優(yōu)選地，所述納米膠束藥物組合物的平均粒徑為5～80nm，例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、18nm、20nm、23nm、25nm、28nm、30nm、35nm、38nm、40nm、43nm、45nm、48nm、50nm、55nm、58nm、60nm、65nm、68nm、70nm、75nm、78nm或80nm，優(yōu)選10～30nm。
另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米膠束藥物組合物的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：將d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯、α-生育酚琥珀酸酯和疏水性抗腫瘤藥物溶于有機(jī)溶劑中，而后除去有機(jī)溶劑，水化，超聲，得到所述納米膠束藥物組合物的水溶液體系。
優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷、二氯甲烷或四氫呋喃中的任意一種或至少兩種的組合。
優(yōu)選地，所述除去有機(jī)溶劑的方法為通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去。
優(yōu)選地，所述水化時使用的溶劑為水或緩沖溶液，優(yōu)選緩沖溶液。
優(yōu)選地，所述緩沖溶液為pbs緩沖溶液。
優(yōu)選地，所述水化的溫度為25～50℃，例如25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、43℃、45℃、48℃或50℃。
優(yōu)選地，所述水化的時間為10～60min，例如10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
優(yōu)選地，所述超聲的時間為1～20min，例如1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、10min、12min、14min、16min、18min或20min，優(yōu)選5-10min。
另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的納米膠束藥物組合物作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物可以作為抗腫瘤藥物而應(yīng)用，其具有腫瘤細(xì)胞或組織的靶向性，對正常細(xì)胞或組織無毒副作用，抗腫瘤效果顯著。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明的基于維生素e衍生物的納米膠束藥物載體，通過d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯與d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯和α-生育酚琥珀酸酯相互配合，使得形成的納米膠束載體親水和疏水作用達(dá)到較好的平衡，膠束穩(wěn)定性好，粒徑小且均一，平均粒徑在5～80nm，其形成的納米膠束藥物組合物可以提高藥物的包封率，并且具有較好的p-糖蛋白抑制能力，具有良好的抗腫瘤效果，其對耐藥株mcf-7細(xì)胞作用48小時后的ic50為3.52±0.24，并且對正常細(xì)胞具有較小的毒性，具有良好的生物相容性，并且制備方法簡單，具有廣泛的應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1是實施例3制備得到的載藥納米膠束t1k2k-tos-dox的dls圖；
圖2是實施例3制備得到的載藥納米膠束t1k2k-tos-dox的tem圖；
圖3是載體t1k2k、未載藥納米膠束t1k2k-tos，實施例4制備的載藥納米膠束t1k2k-tos-dox與dox對多藥耐藥細(xì)胞株mcf-7(mcf-7/adr)的細(xì)胞毒性測定結(jié)果圖。
具體實施方式
下面通過具體實施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。
實施例1
在本實施例中，通過以下方法制備得到維生素e衍生物納米膠束(t1k2k-tos)，具體包括以下步驟：
稱取1mgtpgs1k，5mgtpgs2k，3mgα-tos，并將其溶于15ml三氯甲烷中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑移除，形成的薄膜在1.5mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分鐘，隨后超聲5分鐘，用0.22μm的過濾膜過濾得所述維生素e衍生物納米膠束體系t1k2k-tos。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測維生素e衍生物納米膠束的粒徑，平均粒徑為17.2nm。
實施例2
在本實施例中，通過以下方法制備得到維生素e衍生物納米膠束(t1k2k-tos)，具體包括以下步驟：
稱取1mgtpgs1k,7mgtpgs2k和3mgα-tos，并將其溶于20ml三氯甲烷中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑移除，形成的薄膜在2mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分鐘，隨后超聲5分鐘，用0.22μm的過濾膜過濾得所述維生素e衍生物納米膠束體系t1k2k-tos。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測維生素e衍生物納米膠束的粒徑，平均粒徑為64.3nm。
實施例3
在本實施例中，通過以下方法制備得到基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物t1k2k-tos-dox，具體包括以下步驟：
稱取1mgtpgs1k,5mgtpgs2k,2.5mgα-tos和0.6mg疏水阿霉素，并將其溶于15ml三氯甲烷中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑移除，形成的薄膜在1.5mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分鐘，隨后超聲5分鐘，用0.22μm的過濾膜過濾得納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，結(jié)果如圖1所示，可以看出其平均粒徑為23.6nm。
利用透射電鏡(ht7700,hitachi,jpn)對實施例3制備得到的載藥納米膠束t1k2k-tos-dox進(jìn)行表征，如圖2所示，可以看出，納米膠束粒徑均一，約為20nm。
實施例4
在本實施例中，通過以下方法制備得到基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物t1k2k-tos-dox，具體包括以下步驟：
稱取1mgtpgs1k，7mgtpgs2k，4mgα-tos和1.2mg阿霉素，并將其溶于20ml三氯甲烷中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑移除，形成的薄膜在2mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分鐘，隨后超聲5分鐘，用0.22μm的過濾膜過濾得納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，平均粒徑為30.1nm。
實施例5
與實施例4的區(qū)別僅在于，所使用的tpgs1k與tpgs2k的質(zhì)量為：4mgtpgs1k，4mgtpgs2k，除此之外，其他條件以及制備方法均與實施例4相同，制備得到納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，平均粒徑為25.5nm。
實施例6
與實施例4的區(qū)別僅在于，所使用的tpgs1k與tpgs2k的質(zhì)量為：6mgtpgs1k，2mgtpgs2k，除此之外，其他條件以及制備方法均與實施例4相同，制備得到納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，平均粒徑為28.4nm。
實施例7
與實施例4的區(qū)別僅在于，所使用的tpgs1k與tpgs2k的質(zhì)量為：7.2mgtpgs1k，0.8mgtpgs2k，除此之外，其他條件以及制備方法均與實施例4相同，制備得到納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，平均粒徑為62.1nm。
實施例8
與實施例4的區(qū)別僅在于，所使用的α-tos的質(zhì)量為2mg，除此之外，其他條件以及制備方法均與實施例4相同，制備得到納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，平均粒徑為33.4nm。
對比例1
與實施例4的區(qū)別僅在于，所使用的tpgs1k與tpgs2k的質(zhì)量為：0.5mgtpgs1k，7.5mgtpgs2k，除此之外，其他條件以及制備方法均與實施例4相同，制備得到納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，平均粒徑為71.2nm。
對比例2
與實施例4的區(qū)別僅在于，所使用的α-tos的質(zhì)量為0.7mg，除此之外，其他條件以及制備方法均與實施例4相同，制備得到納米膠束藥物組合物體系。
用malvern儀器公司的zetasizernanozs90激光動態(tài)光散射儀檢測所述基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物體系的粒徑，平均粒徑為33.7nm。
實施例9
在本發(fā)明中，對本發(fā)明的維生素e衍生物納米膠束組合物(t1k2k-tos-dox)對多藥耐藥細(xì)胞株mcf-7(mcf-7/adr)的細(xì)胞毒性進(jìn)行測定，方法如下：
按照文獻(xiàn)(細(xì)胞培養(yǎng)，司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，世界圖書出版公司，1996年)中的方法將上述細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，而后分別加入實施例4制備的藥物組合物，加藥48小時后按照文獻(xiàn)(細(xì)胞培養(yǎng)，司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，世界圖書出版公司，1996年)中的方法(mtt法)檢測細(xì)胞存活率(陽性對照為含相同濃度疏水性藥物的游離藥物組，陰性對照為不含疏水性藥物的空白培養(yǎng)基，其中以陰性對照組中細(xì)胞的存活率按100％計算)。實施例4中的藥物組合物以及陽性對照對mcf-7/adr細(xì)胞的殺傷情況分別如圖3所示，加入藥物的濃度以阿霉素的濃度計，分別為1、5、10、20和50μm。結(jié)果顯示，實施例4中的藥物組合物對mcf-7/adr細(xì)胞的殺傷效果明顯高于陽性對照組。如表1所示，當(dāng)本發(fā)明的基于維生素e衍生物的納米膠束藥物組合物(t1k2k-tos-dox)作用于耐藥株mcf-7細(xì)胞48小時時其ic50為3.52±0.24μg/ml，比dox單藥作用效果提高45倍。
同樣對實施例1-3和5-8以及對比例1-2制備的藥物載體以及藥物組合物均進(jìn)行了如上所述的細(xì)胞毒性測定，并與游離的藥物dox以及單獨的tpgs1k和tpgs2k形成的載體(t1k2k)做對比，其測定得到的ic50值如表1所示。
表1
申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的基于維生素e衍生物的納米膠束藥物載體、納米膠束藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。