本發(fā)明屬于藥物制劑領域，具體地說，涉及一種腫瘤壞死因子直腸給藥制劑及其制備方法。
背景技術：
：腫瘤壞死因子α(TumorNecrosisFactorα簡稱TNFα)是由激活的單核巨噬細胞產生的一種多功能細胞因子。人的有活性的TNFα由3個分子量為17KDa的非糖蛋白單體構成單體呈片層折疊結構，它們之間通過一個Cys69-Cys101間的二硫鍵非共價組成體。不同種屬哺乳動物來源的TNFα在一級結構上具有極高的同源性，在生物學活性上也無明顯的種屬特異性。純化的TNFα等電點在5.3左右；pH6-8時穩(wěn)定；對酸敏感：對蛋白水解酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶等)敏感；50％的飽和硫酸銨可使其沉淀。在反復凍融和無保護劑時，室溫下失活。TNFα基因為單拷貝基因。人的基因大小為2.67kb，定位于人第6號染色體?；蚪M由4個外顯子和3個內含子組成；編碼一個由233個氨基酸組成的前體蛋白、其前76個氨基酸為信號肽、使TNFα前體能跨膜存在于細胞膜上，通過降解后，分出含157個氨基酸的成熟蛋白、糖基化。人TNFα基因第1外顯子編碼81％的信號肽，第4外顯子編碼89％成熟型TNFα氨基酸序列。用TNFα對腫瘤作臨床的免疫治療是幾十年來發(fā)展較快的新型抗瘤療法、對臨床手術、放療、化療等常規(guī)手段是有效補充。這在美國、日本和德國都取得了較好的進展。美國的Genentech公司在臨床試驗中用TNFα治療乳腺癌、肺癌、結腸癌等方面居于領先地位；Cetus公司把TNFα和IL-2聯用開創(chuàng)了復合生物反應調節(jié)劑法。日本的重組產品已進入臨床試驗，對胸、腹水晚期轉移癌、大腸癌、膽囊癌等取得了好的進展。德國BASF公司年產可達500g，德國用TNFα在胃腸道腫瘤、肝癌、卵巢腫瘤、乳腺癌等方面取得了成功，尤其在控制癌性胸腹水方面的療效居世界前列。我國衛(wèi)生部1998年初已批準上海、西安的5家單位開始臨床試驗。臨床上給藥途徑早年多為靜脈、肌肉和皮下注射，近年來為了減輕TNFα的毒性，常采用局部注射或局部灌注方法，治療中、晚期腫瘤。給藥量從10μg/m2到400μg/m2。較多的治療方案是2周為1療程，每個療程中連續(xù)5天給藥，每天給50μg/m2。給藥量主要取決于藥效，通常80萬單位/m2有效。雖然1975年已分離、純化了TNFα，并闡明了結構，1985年已經用大腸桿菌基因工程達到了TNFα的重組產品；但是至今TNFα還停留在臨床階段，世界各國的醫(yī)藥行政部門都未批準TNFα作為商品藥在市場上出售。這主要由于從最初的臨床試驗時發(fā)現，TNFα有嚴重的全身毒性作用，對人的毒性作用要比小鼠高20倍。這種毒性作用主要表現在：發(fā)熱(35-100％)，寒顫(70-100％)，惡心頭痛(20-70％)。乏力(20-77％)、食欲下降(24-46％)；還發(fā)生腹瀉、血小板降低、白細胞減少、GTP上升、體液潴留、肌痛，甚至內毒素性休克。這就大大限制了TNFα的臨床應用劑量，嚴重影響其治療腫瘤的效果。至今能選擇性地、又直接殺傷腫瘤的藥物很少，癌癥的死亡率仍高于其他各種疾病。TNFα被發(fā)現后大家對其抱有極大的希望。但全身毒性的嚴重性，限制了它的應用。十幾年來各國學者正在千方百計降低TNFα的毒性，主要從兩方面取得了一些進展：第一方面是改變給藥途徑，1990年前后，美國曾經試驗用基因治療，即把TNFα直接注入腫瘤組織。第二方面是用蛋白質工程技術對TNFα的結構進行改造，改造的目的是降低毒性和提高抗腫瘤。十幾年來已突變成功了數十種TNFα，其中有些毒性有明顯得下降，而抗腫瘤活性有顯著提高。雖然如此，各國仍然還在作臨床試驗。針對目前存在的上述問題，CN00109459.9公開了一種人腫瘤壞死因子α口服劑，含有表達人腫瘤壞死因子α(hTNFα)的念珠藻，降低了毒性，并可直接作用于消化道。本申請人研發(fā)的注射用改構重組人腫瘤壞死因子(商品名：天恩福)為國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準的國家生物制品I類新藥，是在腫瘤壞死因子原液中加入人血白蛋白和甘露醇經凍干得到的白色疏松粉末，主要用于治療惡性淋巴瘤、肺癌、惡性黑色素瘤、惡性胸腹水，具有廣闊的應用前景。然而，在長期的使用中發(fā)現其毒副反應大，穩(wěn)定性不好。有鑒于此特提出本發(fā)明。技術實現要素：本發(fā)明要解決的技術問題在于克服現有技術的不足，提供一種腫瘤壞死因子直腸給藥制劑及其制備方法。為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種腫瘤壞死因子直腸給藥制劑，其中，所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑包括如下組分：優(yōu)選，所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑包括如下組分：更優(yōu)選，所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑包括如下組分：進一步的，所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑為凍干粉末。本發(fā)明的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑用藥方便，臨用前加入生理鹽水復溶，噴入(注入)直腸即可，病人帶藥回家就能用(原靜脈給藥，必須去醫(yī)院靜脈滴注)，毒副作用小，采用直腸給藥，避免了靜脈給藥的毒副反應大等缺點。本發(fā)明還提供所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑的制備方法，其中，所述的制備方法為：先將甘露醇、泊洛沙姆、明膠和甘氨酸配成溶液，混勻，再加入人血白蛋白，混勻，然后再加入腫瘤壞死因子原液，混合均勻，凍干，即得所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑。進一步的，加入腫瘤壞死因子原液時，控制溫度在2～8℃。進一步的，在凍干前，將溶液的pH值調節(jié)至中性。進一步的，pH值調節(jié)用磷酸緩沖液。本發(fā)明中，所述的腫瘤壞死因子原液可參照現有技術的方法制備得到，如CN03129262.3所公開的一種重組改構人腫瘤壞死因子的生產方法，也可采用如下方法得到：腫瘤壞死因子工程菌經過發(fā)酵，離心得到菌體，勻漿破菌，硫酸銨沉淀，得到目的蛋白，再經過初步精制純化，得到的蛋白質液體即為腫瘤壞死因子原液。所述的凍干分為預凍、一次干燥和二次干燥三個階段：預凍：制品進箱前，隔板先降溫至0～10℃，然后將制品放入冷凍干燥箱中，用10～30min將隔板溫度降至-45±2℃，制品溫度達-40℃±2℃，繼續(xù)保溫2～4h；一次干燥：將隔板溫度升溫至5℃±2℃，保溫待制品冰晶完全消失后，繼續(xù)保溫10～14h；對整個系統抽真空，真空度達350±5mbar；二次干燥：將隔板溫度升溫至30℃±2℃，制品溫度達25℃±2℃，保溫6～10h。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：(1)與現有技術相比，本發(fā)明增加泊洛沙姆、明膠和甘氨酸后，產品穩(wěn)定性增加，并添加了有助于吸收的甘氨酸，有利藥物快速進入血液，發(fā)揮作用；(2)較現有技術相比，本發(fā)明的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑不僅療效增加，而且無不良反應發(fā)生；(3)本發(fā)明方法工藝簡單，適于工業(yè)化大生產。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例，對實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1處方：制備方法：腫瘤壞死因子工程菌經過發(fā)酵，離心得到菌體，勻漿破菌，硫酸銨沉淀，得到目的蛋白，再經過初步精制純化，得到的蛋白質液體即為腫瘤壞死因子原液。先將甘露醇、泊洛沙姆、明膠和甘氨酸配成溶液，混勻，再加入人血白蛋白，混勻，然后在溫度2℃下加入腫瘤壞死因子原液，混合均勻，用磷酸緩沖液調節(jié)pH值至中性，凍干，即得所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑。所述的凍干分為預凍、一次干燥和二次干燥三個階段：預凍：制品進箱前，隔板先降溫至0℃，然后將制品放入冷凍干燥箱中，用10min將隔板溫度降至-45±2℃，制品溫度達-40℃±2℃，繼續(xù)保溫2h；一次干燥：將隔板溫度升溫至5℃±2℃，保溫待制品冰晶完全消失后，繼續(xù)保溫10h；對整個系統抽真空，真空度達350±5mbar；二次干燥：將隔板溫度升溫至30℃±2℃，制品溫度達25℃±2℃，保溫6h。實施例2處方：制備方法：腫瘤壞死因子工程菌經過發(fā)酵，離心得到菌體，勻漿破菌，硫酸銨沉淀，得到目的蛋白，再經過初步精制純化，得到的蛋白質液體即為腫瘤壞死因子原液。先將甘露醇、泊洛沙姆、明膠和甘氨酸配成溶液，混勻，再加入人血白蛋白，混勻，然后在溫度8℃下加入腫瘤壞死因子原液，混合均勻，用磷酸緩沖液調節(jié)pH值至中性，凍干，即得所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑。所述的凍干分為預凍、一次干燥和二次干燥三個階段：預凍：制品進箱前，隔板先降溫至10℃，然后將制品放入冷凍干燥箱中，用30min將隔板溫度降至-45±2℃，制品溫度達-40℃±2℃，繼續(xù)保溫4h；一次干燥：將隔板溫度升溫至5℃±2℃，保溫待制品冰晶完全消失后，繼續(xù)保溫14h；對整個系統抽真空，真空度達350±5mbar；二次干燥：將隔板溫度升溫至30℃±2℃，制品溫度達25℃±2℃，保溫10h。實施例3處方：制備方法：腫瘤壞死因子工程菌經過發(fā)酵，離心得到菌體，勻漿破菌，硫酸銨沉淀，得到目的蛋白，再經過初步精制純化，得到的蛋白質液體即為腫瘤壞死因子原液。先將甘露醇、泊洛沙姆、明膠和甘氨酸配成溶液，混勻，再加入人血白蛋白，混勻，然后在溫度4℃下加入腫瘤壞死因子原液，混合均勻，用磷酸緩沖液調節(jié)pH值至中性，凍干，即得所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑。所述的凍干分為預凍、一次干燥和二次干燥三個階段：預凍：制品進箱前，隔板先降溫至5℃，然后將制品放入冷凍干燥箱中，用20min將隔板溫度降至-45±2℃，制品溫度達-40℃±2℃，繼續(xù)保溫3h；一次干燥：將隔板溫度升溫至5℃±2℃，保溫待制品冰晶完全消失后，繼續(xù)保溫12h；對整個系統抽真空，真空度達350±5mbar；二次干燥：將隔板溫度升溫至30℃±2℃，制品溫度達25℃±2℃，保溫8h。實施例4處方：制備方法：腫瘤壞死因子工程菌經過發(fā)酵，離心得到菌體，勻漿破菌，硫酸銨沉淀，得到目的蛋白，再經過初步精制純化，得到的蛋白質液體即為腫瘤壞死因子原液。先將甘露醇、泊洛沙姆、明膠和甘氨酸配成溶液，混勻，再加入人血白蛋白，混勻，然后在溫度6℃下加入腫瘤壞死因子原液，混合均勻，用磷酸緩沖液調節(jié)pH值至中性，凍干，即得所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑。所述的凍干分為預凍、一次干燥和二次干燥三個階段：預凍：制品進箱前，隔板先降溫至3℃，然后將制品放入冷凍干燥箱中，用25min將隔板溫度降至-45±2℃，制品溫度達-40℃±2℃，繼續(xù)保溫2.5h；一次干燥：將隔板溫度升溫至5℃±2℃，保溫待制品冰晶完全消失后，繼續(xù)保溫11h；對整個系統抽真空，真空度達350±5mbar；二次干燥：將隔板溫度升溫至30℃±2℃，制品溫度達25℃±2℃，保溫7h。實施例5處方：制備方法：腫瘤壞死因子工程菌經過發(fā)酵，離心得到菌體，勻漿破菌，硫酸銨沉淀，得到目的蛋白，再經過初步精制純化，得到的蛋白質液體即為腫瘤壞死因子原液。先將甘露醇、泊洛沙姆、明膠和甘氨酸配成溶液，混勻，再加入人血白蛋白，混勻，然后在溫度6℃下加入腫瘤壞死因子原液，混合均勻，用磷酸緩沖液調節(jié)pH值至中性，凍干，即得所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑。所述的凍干分為預凍、一次干燥和二次干燥三個階段：預凍：制品進箱前，隔板先降溫至3℃，然后將制品放入冷凍干燥箱中，用15min將隔板溫度降至-45±2℃，制品溫度達-40℃±2℃，繼續(xù)保溫3.5h；一次干燥：將隔板溫度升溫至5℃±2℃，保溫待制品冰晶完全消失后，繼續(xù)保溫13h；對整個系統抽真空，真空度達350±5mbar；二次干燥：將隔板溫度升溫至30℃±2℃，制品溫度達25℃±2℃，保溫8h。實施例6處方：制備方法：腫瘤壞死因子工程菌經過發(fā)酵，離心得到菌體，勻漿破菌，硫酸銨沉淀，得到目的蛋白，再經過初步精制純化，得到的蛋白質液體即為腫瘤壞死因子原液。先將甘露醇、泊洛沙姆、明膠和甘氨酸配成溶液，混勻，再加入人血白蛋白，混勻，然后在溫度6℃下加入腫瘤壞死因子原液，混合均勻，用磷酸緩沖液調節(jié)pH值至中性，凍干，即得所述的腫瘤壞死因子直腸給藥制劑。所述的凍干分為預凍、一次干燥和二次干燥三個階段：預凍：制品進箱前，隔板先降溫至7℃，然后將制品放入冷凍干燥箱中，用18min將隔板溫度降至-45±2℃，制品溫度達-40℃±2℃，繼續(xù)保溫2.8h；一次干燥：將隔板溫度升溫至5℃±2℃，保溫待制品冰晶完全消失后，繼續(xù)保溫12h；對整個系統抽真空，真空度達350±5mbar；二次干燥：將隔板溫度升溫至30℃±2℃，制品溫度達25℃±2℃，保溫9h。對比例1、注射用改構重組人腫瘤壞死因子處方：制備方法：同實施例1，所不同的是處方中不含有泊洛沙姆、明膠和甘氨酸。試驗例1、穩(wěn)定性試驗取96孔板，加入細胞數量為2.5～3×105個/ml，細胞板加入樣品和標準品后做四倍稀釋，做復孔，培養(yǎng)20～24小時后在測量波長570nm，參照波長630nm，測量每孔的OD值。以第幾孔為橫坐標，孔內細胞量相對應的OD值為縱坐標。根據細胞死亡率，用MTT染色，死亡越多，顏色越淡，采用直線回歸計算法進行處理。分別計算各試驗樣品的半效稀釋倍數(即從樣品溶液至相當于標準品50％最大效應點的稀釋倍數)，并按下式計算試驗結果：經過MTT法活性測定，結果如下：實驗方法，各加1毫升生理鹽水，室溫放置1小時。MTT法測定各自活性(原活性85萬單位)。1、對比例1的產品活性52萬單位；2、增加泊洛沙姆、明膠和甘氨酸后的實施例1的產品的活性78萬單位。從上述試驗結果可以看出，本發(fā)明產品活性穩(wěn)定性比對比例1的產品活性提高78/52＝1.5倍。試驗例2、臨床試驗一、資料與方法1、病例選擇入選標準：經病理學或細胞學證實的中晚期肺癌、頭頸部腫瘤、胃癌、結腸癌、泌尿系統惡性腫瘤患者；年齡35～70歲，心、肝、腎等臟器功能基本正常；白細胞≥4.0×109·L-1，血小板≥100×109·L-1，血紅蛋白≥90g·L-1；KPS≥30分，預計生存期＞3個月；至少有1個可評價病灶，近1月內未進行其他抗腫瘤治療；上述患者均簽署書面知情同意書。排除標準：可進行并愿意接受手術治療的早期惡性腫瘤患者；有明顯心、肝、腎功能障礙及血液系統疾病患者；對肽類藥物或其他生物制品有過敏史、或有過敏性疾病患者及過敏體質者；孕婦、哺乳期婦女。剔除標準：用藥劑量、化療方案、治療療程不符合本研究要求者；因各種原因未完成給藥計劃者(因不良反應停藥者不納入療效分析，但納入不良反應統計)；試驗期間加用其他藥物影響本試驗療效觀察者。共入組120例，其中試驗組60例，對照組60例；因各種原因出組7例，其中試驗組1例，對照組6例，全組可評價療效及不良反應者均為113例。試驗組59例患者中，男53例，女6例；中位年齡(56.58±9.68)歲。既往治療20例。KPS評分平均為77.86±7.69。59例中肺癌28例，消化道腫瘤18例，泌尿道腫瘤7例，頭頸部腫瘤6例。臨床分期：II期3例，III期20例，IV期36例；對照組54例患者中，男37例，女17例，中位年齡(55.91±15.72)歲。既往治療16例。KPS評分平均為77.36±9.21。肺癌32例，消化道腫瘤22例。經統計學處理，2組患者在性別、年齡、既往治療、KPS評分、病種及臨床分期方面均無統計學差異。2、給藥方法試驗組：實施例1的直腸給藥制劑加聯合化療。用量為400萬IU·m-2，d1～d7，d1～d17，直腸給藥，21d為1個周期，連用2個周期。聯合化療方案：肺癌GP方案(Gem1200mg/m2iv,d1,d8DDP80－100mg/m2ivd2)；胃癌奧沙利鉑+卡培他濱(奧沙利鉑130mg·m-2，iv，d1；卡培他濱1000mg·m-2，bid，po，d1-14)；腸癌XELOX方案(奧沙利鉑130mg·m-2，iv，d1；卡培他濱1000mg·m-2，bid，po，d1-14)；頭頸部腫瘤PF方案(順鉑100mg·m-2，iv，d1；5-Fu1000mg·m-2，iv，d1-4)；泌尿道腫瘤方案同結腸癌。對照組：對比例1的注射用改構重組人腫瘤壞死因子肌注加聯合化療。用量為400萬IU·m-2，d1～7，d1～17，im，21d為1個周期，連用2個周期。聯合化療方案同試驗組。3、觀察指標臨床指標：每天記錄癥狀、體征；每日測體溫、血壓1次，如高熱加測體溫并記錄最高值；每日觀察并記錄乏力、流涕、畏寒等感冒樣癥狀程度及骨、肌肉疼痛程度；詳細記錄TNFα給藥后的局部不良反應，如注射部位的疼痛程度、紅腫硬節(jié)范圍，有無皮疹及出血點，有無痔瘡或潰瘍等并記錄其他不良反應如過敏反應等。同時判斷與藥物的相關性。實驗室指標：治療前及治療開始后每周查血常規(guī)；每周期治療前后查肝、腎功能、尿常規(guī)、心電圖、肝臟B超及胸部X光片；除可直接測量的腫瘤病灶外，對評價病灶均需治療前和治療結束后4周各行CT檢測1次。4、療效評價標準可測量病灶評價標標準：CR可測量病灶完全消失，至少維持4周以上；PR腫塊縮小50％以上，時間不少于4周；MR腫瘤病灶的兩徑乘積縮小≥25％，但＜50％，無新病灶出現；SD腫瘤病灶的兩徑乘積縮小＜25％，或增加＜25％，無新病灶出現；PD腫瘤病灶兩徑乘積增大≥25％，或新病灶出現；有效率為CR+PR病例占全部病例的百分數。骨肌肉疼痛程度及注射局部疼痛判定標準參照疼痛主訴分級法(VerbalRatingScale,VRS)判定。0級:無疼痛；Ⅰ級:輕度疼痛,有疼痛感,可忍受,能正常生活,睡眠末受干擾；Ⅱ級:中度疼痛,疼痛明顯,不能忍受,要求用止痛藥,睡眠受干擾；Ⅲ級:重度疼痛,疼痛劇烈,可伴有植物神經功能紊亂表現,或被動體位,睡眠受嚴重干擾,須用止痛治療。注射部位紅腫硬結標準:以紅腫結節(jié)的最大徑線的長度(單位為cm)表示。0度:無紅腫硬結；Ⅰ度:紅腫硬結最大徑≤1cm；Ⅱ度:紅腫硬節(jié)最大徑1.1～2.0cm；Ⅲ度:紅腫硬結最大徑＞2.0cm。乏力及感冒樣癥狀按無、輕度、中度及重度,Ⅳ度判定。5、統計學方法一般資料比較用ⅹ2檢驗、F檢驗和等級秩和檢驗；臨床療效比較用ⅹ2檢驗和t檢驗；不良反應發(fā)生率用ⅹ2檢驗和F檢驗。二、結果1、療效分析試驗組有效率為44.0％(26/59)；對照組有效率為40.7％(22/54),如表1所示,試驗組有效率高于對照組。表1、近期療效比較分組例數CRPRMRSDPDCR+PRRR/％試驗組5981871882644.1對照組5481452162240.72、藥物不良反應與TNFα有關的不良反應主要為輕度注射部位疼痛、紅腫硬結、發(fā)熱及感冒樣癥狀,試驗組為直腸給藥，經試驗表明無不良反應發(fā)生，而對照組不良反應總發(fā)生率為72.22％(39/54),見表2。表2、與TNFα相關的不良反應不良反應第1周期(n＝54)(％)第2周期(n＝54)(％)注射部位疼痛36(66.67)39(72.22)紅腫硬結12(22.22)24(44.44)發(fā)熱21(38.89)15(27.78)感冒樣癥狀2(3.70)3(5.56)從上述試驗結果可以看出，本發(fā)明的直腸給藥制劑與注射用改構重組人腫瘤壞死因子肌注給藥制劑相比，有效率雖然提高不多，但本發(fā)明的直腸給藥制劑無不良反應發(fā)生，且用藥方便、安全。對本發(fā)明其它實施例所制備的直腸給藥制劑也進行了上述試驗，其獲得的結果相似。以上所述僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本發(fā)明的技術人員在不脫離本發(fā)明技術方案范圍內，當可利用上述提示的技術內容作出些許變動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內容，依據本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明方案的范圍內。當前第1頁1 2 3