本發(fā)明涉及一種抗腫瘤植入膜及其制備方法。

背景技術：

手術切除是癌癥病人最有效的治療方法，但是由于腫瘤切除邊緣難以界定，易殘留隱匿性腫瘤細胞，導致手術后復發(fā)率較高，其5年復發(fā)率可高達77％-100％。為了防止腫瘤復發(fā)，手術后往往需要進行化療。傳統(tǒng)的化療方法多為全身靜脈給藥，但因為化療藥物選擇性差，對于正常細胞和腫瘤細胞具有幾乎同樣的殺傷性，全身用藥，毒性較大，副作用比較多，很多病人都難以接受。另外，長期使用化療藥物會導致腫瘤細胞的耐藥性。尤其是，肝臟等解毒器官對于化療藥物非常不敏感，這對這類臟器的化療治療起到了極大的阻礙作用。

溶瘤病毒(oncolytic virus)是天然存在或經過人工改造之后的能夠選擇性感染并裂解腫瘤細胞的一類病毒。它們通過刪除一些在正常細胞中復制所必需而在腫瘤細胞中復制所不需要的病毒關鍵基因從而達到特異性靶向腫瘤細胞的作用，能選擇性感染腫瘤細胞并在其中復制，最終裂解、殺死腫瘤細胞，并釋放出子代病毒顆粒進一步感染周圍的腫瘤細胞，而在正常組織細胞中則無復制或殺傷作用，而且它還可以誘導特異性抗腫瘤免疫反應。由于溶瘤病毒具有與傳統(tǒng)化療藥物不同的抗腫瘤機制，具有化療抵抗性的腫瘤細胞仍然對溶瘤病毒治療敏感。2015年10月27日，美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)已經批準安進(Amgen)公司經過基因改造的單純皰疹病毒用于治療病灶在皮膚和淋巴結的黑色素瘤。2016年8月16日英國醫(yī)療成本監(jiān)管機構——英國國家衛(wèi)生與臨床優(yōu)化研究所(NICE)發(fā)布最終指南，支持將溶瘤免疫療法用于英格蘭和威爾士國家衛(wèi)生服務(NHS)系統(tǒng)，用于治療黑色素瘤患者。但是溶瘤病毒治療法需要較高的病毒濃度，治療方式通常是直接將病毒溶液注射到肉眼可分辨的腫瘤中并用病毒溶液飽和整個腫瘤。這種給藥方式對于體內深部的腫瘤和手術殘留的隱匿性腫瘤細胞的來說，難以實現(xiàn)。因此亟需一種針對溶瘤病毒應用時瘤內注射的技術局限，以及腫瘤手術后面臨的局部化療和耐藥性等問題有效抗腫瘤藥物和方法。

技術實現(xiàn)要素：

基于以上現(xiàn)有技術的不足，針對腫瘤手術后面臨的局部化療和耐藥性等問題，以及溶瘤病毒應用時瘤內注射的技術局限性，本發(fā)明運用靜電紡絲技術制備了一種負載溶瘤病毒的納米纖維植入膜。在腫瘤手術中直接植入腫瘤切除部位，原位將溶瘤病毒緩釋出來，特異性靶向腫瘤細胞，對殘余腫瘤進行局部治療，避免腫瘤復發(fā)，并拓寬了溶瘤病毒的應用范圍。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種抗腫瘤植入膜，所述抗腫瘤植入膜為負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜。

作為上述技術方案的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明實施例提供的一種抗腫瘤植入膜進一步包括下列技術特征的部分或全部：

作為上述技術方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述電紡納米纖維膜為以帶氨基的可生物降解高分子材料為電紡材料，采用靜電紡絲技術制備的高分子納米纖維膜。

作為上述技術方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述溶瘤病毒為溶瘤單純皰疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒中的一種或者多種的混合。

一種抗腫瘤植入膜的制備方法，其特征在于，包含如下步驟：

步驟一、電紡納米纖維膜的制備，用靜電紡絲技術將帶氨基的可生物降解高分子材料制備成由納米纖維組成的電紡膜；

步驟二、負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜的制備，將步驟一所述的電紡納米纖維膜浸泡到溶瘤病毒溶液中，通過靜電吸附作用將溶瘤病毒富集到電紡纖維膜上面，獲得負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜即抗腫瘤植入膜。

作為上述技術方案的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明實施例提供的一種抗腫瘤植入膜的制備方法進一步包括下列技術特征的部分或全部：

作為上述技術方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述帶氨基的可生物降解高分子材料優(yōu)選為殼聚糖。

作為上述技術方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述溶瘤病毒為溶瘤單純皰疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒中的一種或者多種的混合。

作為上述技術方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述溶瘤病毒溶液優(yōu)選的為溶瘤病毒水溶液，所述溶瘤病毒溶液濃度為10³～10⁷pfu/mL。

作為上述技術方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述抗腫瘤植入膜置于-100℃～-5℃保存。

作為上述技術方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述抗腫瘤植入膜置于-80℃條件下凍存。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的技術方案具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明的抗腫瘤植入膜可以實現(xiàn)局部抗腫瘤治療，避免了全身化療的毒副反應；提高了腫瘤部位的藥物濃度，降低了藥物使用量，減少成本。(2)本發(fā)明使用溶瘤病毒進行抗腫瘤治療，解決了使用化療藥物后產生的耐藥性問題和某些腫瘤細胞對化療藥物不敏感的問題。(3)本發(fā)明使用的電紡納米纖維膜具有較大的比表面積和孔隙率，是富集溶瘤病毒的良好載體，并通過植入膜的形式簡易的將溶瘤病毒釋放到殘留的腫瘤細胞部位，提高了局部溶瘤病毒的濃度也突破了溶瘤病毒瘤內注射的技術局限。(4)本發(fā)明使用的高分子材料均為可生物降解高分子材料，生物相容性好，可被人體完全吸收，不用二次手術取出。(5)本發(fā)明所用的制備方法，靜電紡絲技術和負載溶瘤病毒的靜電吸附法，可以適用于多種高分子材料和溶瘤病毒，具有普適性。(6)該植入膜還可以物理隔絕腫瘤切除部位與腹膜，起到防粘連作用。

本發(fā)明利用靜電紡絲技術將殼聚糖等高分子材料制備成具有高比表面積和孔隙率的納米纖維膜，并用其負載溶瘤病毒，在腫瘤手術中直接植入腫瘤切除部位，以殺死附近潛在的腫瘤細胞，避免腫瘤復發(fā)。

上述說明僅是本發(fā)明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術手段，而可依照說明書的內容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，以下結合優(yōu)選實施例，詳細說明如下。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例的附圖作簡單地介紹。

圖1：抗腫瘤植入膜作用效果示意圖；

圖2：負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜的掃描電子顯微鏡照片；

圖3：泡膜前溶瘤病毒溶液中病毒滴度與負載到電紡納米纖維膜上的病毒負載量的關系圖；

圖4：負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜的對于各種人肝癌細胞的抗腫瘤效果；

圖5：負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜對于Bel-7402細胞的殺傷力與MOI的關系圖。

具體實施方式

下面詳細說明本發(fā)明的具體實施方式，其作為本說明書的一部分，通過實施例來說明本發(fā)明的原理，本發(fā)明的其他方面、特征及其優(yōu)點通過該詳細說明將會變得一目了然。

利用靜電紡絲技術將高分子材料制備成電紡納米纖維膜，將納米纖維膜浸泡在溶瘤病毒溶液中，通過靜電吸附作用將溶瘤病毒富集到電紡纖維膜上面，獲得負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜。在腫瘤手術中直接植入腫瘤切除部位，原位將溶瘤病毒緩釋出來，特異性靶向腫瘤細胞，起到原位局部抗腫瘤作用。如圖1所示即為本發(fā)明的抗腫瘤植入膜的作用效果示意圖。

所述的高分子材料為帶氨基的可生物降解高分子材料，如殼聚糖等。靜電紡絲技術可以將該高分子溶液制備成納米纖維膜，即由直徑從3nm–5μm的纖維組成的三維空間結構。由于納米級纖維的比表面積是微米級纖維的1000倍，由納米級纖維組成的納米纖維膜的比表面積將比由普通紡絲技術制備的纖維膜大幾個數(shù)量級。

所述的溶瘤病毒包含溶瘤單純皰疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒等。

所述負載溶瘤病毒的方法為靜電吸附法。由于溶瘤病毒通常帶負電，而由帶氨基的高分子材料制備的電紡納米纖維膜在溶液中會帶正電，通過靜電吸附可以將溶瘤病毒富集到電紡納米纖維膜上面。而如上所述，電紡納米纖維膜具有極大的比表面積，是富集溶瘤病毒的良好載體，該植入膜植入體內后可以提高局部溶瘤病毒的濃度。

實施例1：負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜的制備方法

將殼聚糖(粘均分子量約為85萬，脫乙酰度為95％)與聚氧化乙烯(重均分子量為60萬)共同溶于90％的乙酸溶液中，配置成質量分數(shù)為3.25％的高分子溶液，其中殼聚糖與聚氧化乙烯的質量比為90:10。將該高分子溶液置于靜電紡絲裝置的進樣裝置中，調節(jié)電壓為20kv，噴頭與收集板的距離為15cm，收集厚度為150～200μm的納米纖維膜。從收集板上取下納米纖維膜，浸泡在1mol/L的碳酸鉀溶液中1hr，然后用去離子水洗滌干凈并室溫干燥，以去除未揮發(fā)干凈的醋酸溶液和聚氧化乙烯，釋放殼聚糖上帶正電的氨基基團。室溫干燥器中保存。其它帶氨基的高分子材料的電紡納米纖維膜的制備方法與之相似，只是將殼聚糖換成其它高分子材料。

將干燥的殼聚糖納米纖維膜裁剪成1×1cm²的小塊并浸泡到0.5mL溶瘤病毒溶液中，如單純皰癥病毒(武漢濱會生物科技有限公司贈送)，在4℃下通過靜電吸附作用將帶負電的溶瘤病毒富集到表面帶正電的納米纖維膜上，2hr后取出吸附溶瘤病毒的纖維膜，-80℃凍存。

用掃描電子顯微鏡觀測負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜形貌。如圖2所示，溶瘤病毒顆粒附著在電紡納米纖維膜上面，電紡膜由直徑約為150nm的納米纖維組成。

實施例2：溶瘤病毒負載量的控制

將面積為1×1cm²，重量為1.5mg的電紡納米纖維膜浸泡到0.5mL具有不同病毒滴度的溶瘤病毒溶液中，在4℃下靜置2hr。檢測泡膜前后溶瘤病毒溶液中病毒滴度的變化，其差值即為負載到電紡納米纖維膜上的病毒負載量。

如圖2的曲線所示，當泡膜前溶瘤病毒溶液中病毒的濃度從7×10³、1.11×10⁵、2.79×10⁵增加到1.11×10⁶pfu/mL，負載到電紡納米纖維膜上的溶瘤病毒負載量隨之從1.29×10³、3.35×10⁴、8.4×10⁴增大到3.35×10⁵pfu/mg，即泡膜前溶瘤病毒溶液中病毒的濃度越大，負載到電紡納米纖維膜上的溶瘤病毒就越多。

實施例3：負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜的腫瘤治療效果

1)細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞Bel-7402(記作2D-7402)用含10％FBS、1％雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，置于5％CO₂，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。用倒置顯微鏡觀察其生長情況，大約2天傳一次代，取處于對數(shù)生長期的細胞用于細胞毒性實驗。

Bel-7402耐化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fu)的耐藥細胞株7402-5fu，其培育方式與2D-7402相似，只是其培養(yǎng)液為含20μg/mL 5-fu的DMEM完全培養(yǎng)基。

用3D細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)的Bel-7402細胞具有干細胞的性質，記作3D-7402。

人肝癌細胞HepG2的培育方式與2D-7402相同。

HepG2耐化療藥物阿霉素(DOX)的耐藥細胞株HepG2-ADM，其培育方式與HepG2相似，只是其培養(yǎng)液為含200ng/mL DOX的DMEM完全培養(yǎng)基。

2)細胞毒性實驗

選擇處于對數(shù)生長期的上述各種肝癌細胞，接種到24孔培養(yǎng)板內，每種細胞均分為5組。對照組只加培養(yǎng)基；空白膜組，加培養(yǎng)基和電紡納米纖維膜；載溶瘤病毒膜組，加培養(yǎng)基和負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜；5-fu組，加含20μg/mL 5-fu的培養(yǎng)基；Dox組，加含200ng/mL DOX的培養(yǎng)基。

將不同細胞系的各組細胞置于5％CO₂，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96hr后，用SRB法檢測其細胞殺傷性。結果如圖4所示，空白膜組的細胞存活率與對照組類似接近100％，說明未負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜不具有細胞毒性。從5-fu組和Dox組的細胞存活率來看，耐藥細胞7402-fu和HepG2-ADM對于化療藥物5-fu和Dox均不敏感，具有化療耐藥性；用3D技術培養(yǎng)的具有干細胞性質的3D-7402細胞對于5-fu也具有一定的耐藥性。但是載溶瘤病毒膜組，不管是對于人肝癌細胞，耐藥性肝癌細胞甚至是具有干細胞性質的3D技術培養(yǎng)的細胞均具有很強的殺傷力(細胞存活率低于40％)，說明負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜具有很好的抗腫瘤效果。

實施例4：負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜的細胞殺傷力

將具有不同溶瘤病毒負載量的負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜與Bel-7402細胞共同孵育，如上述方法來檢測其細胞殺傷力。MOI為負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜上溶瘤病毒的數(shù)量與Bel-7402細胞數(shù)目的比值。結果如圖5所示，當MOI從0、0.01、0.3、0.8、1.3增加到8.4時，細胞存活率從106％、75.3％、44％、37.5％、29.7％下降到13.5％。說明負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜對于細胞的殺傷力與膜上溶瘤病毒的負載量有關，隨負載量的增加而增大。

本發(fā)明利用靜電紡絲技術將帶氨基的可生物降解高分子材料，如殼聚糖等制備成納米纖維膜，然后通過靜電吸附作用將溶瘤病毒包含溶瘤單純皰疹病毒、溶瘤腺病毒、溶瘤新城疫病毒等，富集到電紡納米纖維膜上面，獲得負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜。在腫瘤手術中直接植入腫瘤切除部位，原位將溶瘤病毒緩釋出來，特異性靶向腫瘤細胞，起到原位局部抗腫瘤作用。提高了局部溶瘤病毒的濃度也突破了溶瘤病毒瘤內注射的技術局限。實驗證明，本發(fā)明的負載溶瘤病毒的電紡納米纖維膜對于多種肝癌細胞Bel-7402和HepG2，耐藥性肝癌細胞7402-5fu和HepG2-ADM，甚至是具有干細胞性質的3D技術培養(yǎng)的3D-7402細胞均具有很強的殺傷力。本發(fā)明的植入膜生物相容性好，可被人體完全吸收，不用二次手術取出，還可以物理隔絕腫瘤切除部位與腹膜，起到防粘連作用。本發(fā)明所使用的制備方法，靜電紡絲技術和負載溶瘤病毒的靜電吸附法，可以適用于多種高分子材料和溶瘤病毒，具有普適性。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權利范圍，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和變動，這些改進和變動也視為本發(fā)明的保護范圍。