本發(fā)明涉及屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細(xì)胞制劑及其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是臨床上較為常見(jiàn)的難治病癥，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失以及路易小體形成為主要病理特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常，極大影響了患者的生存質(zhì)量。從19世紀(jì)60年代晚期開(kāi)始，通過(guò)口服左旋多巴的多巴胺替代療法來(lái)緩解pd運(yùn)動(dòng)癥狀是現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)轉(zhuǎn)化研究中的成功之一。目前，左旋多巴仍是治療有癥狀pd的金標(biāo)準(zhǔn)。pd治療目前最為有效的方法是采用左旋多巴替代治療，但仍不能有效阻止或減緩疾病的發(fā)展。目前只能采用藥物、外科手術(shù)或電極的方式進(jìn)行緩解和控制癥狀，避免發(fā)展速度過(guò)快。自二十世紀(jì)八十年代初開(kāi)展的細(xì)胞移植治療pd以來(lái)，人們已嘗試過(guò)胚胎中腦黑質(zhì)組織、自體腎上腺髓質(zhì)，胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、人畸胎瘤神經(jīng)元等，并取得了一定的療效，因此細(xì)胞移植治療pd也越來(lái)越多的受到關(guān)注。但上述細(xì)胞來(lái)源均受供體(donors)資源匱乏、倫理問(wèn)題、成瘤風(fēng)險(xiǎn)大、免疫排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元比例低等問(wèn)題困擾，限制了細(xì)胞移植治療帕金森病的進(jìn)程。目前臨床治療帕金森病的方法以口服da前體藥物左旋多巴為主，但這種藥物起初有效，長(zhǎng)期服用則會(huì)出現(xiàn)療效下降，并引起一系列運(yùn)動(dòng)障礙并發(fā)癥。外科治療以蒼白球和丘腦的損毀為主要方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高。上述方法屬于對(duì)癥治療，但不能逆轉(zhuǎn)da能神經(jīng)元的變性，因此，找到一種能夠替代變性的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞以恢復(fù)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)功能的新技術(shù)新方法，已成為迫在眉睫的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細(xì)胞制劑及其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明與鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥不同，神經(jīng)干細(xì)胞注射液來(lái)源自人類(lèi)胚胎(通過(guò)倫理審查)，完全100％人源，并且采用鼻腔無(wú)創(chuàng)給藥的方式，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，預(yù)計(jì)對(duì)小兒腦癱將有更好的療效。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明涉及一種經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細(xì)胞制劑，所述方法包括如下步驟：s1：種子細(xì)胞培養(yǎng)與純化：將原代神經(jīng)干細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增傳代至p5代即為獲得的種子細(xì)胞。原代神經(jīng)干細(xì)胞可以是在顯微鏡下使用手術(shù)器械分離獲得廢棄胎腦的腹側(cè)中腦組織，然后采用消化液將細(xì)胞進(jìn)行消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后使用無(wú)血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，并接種于超低吸附培養(yǎng)瓶中，35℃5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每間隔48-72小時(shí)進(jìn)行換液，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)12天左右即可傳代，連續(xù)培養(yǎng)至p5代，在p0代到p5代這個(gè)過(guò)程里，所得的細(xì)胞越來(lái)越純。將所得的p0-p5代細(xì)胞放入種子細(xì)胞庫(kù)中進(jìn)行存儲(chǔ)。本發(fā)明所述神經(jīng)干細(xì)胞可以是不同動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物例如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物例如人、嚙齒類(lèi)動(dòng)物例如鼠等的神經(jīng)干細(xì)胞，而且所述神經(jīng)干細(xì)胞可以得自不同來(lái)源，例如可以商購(gòu)獲得的神經(jīng)球凍存液或神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞系，或者是間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞；或者是由其他來(lái)源經(jīng)誘導(dǎo)分化而來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞，比如ipsc技術(shù)，胚胎干細(xì)胞(包括極小類(lèi)胚胎干細(xì)胞)，亞全能干細(xì)胞，人類(lèi)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等；或者是除神經(jīng)組織器官以外的其他器官及組織而來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞，比如臍帶血和臍帶。s2：p6—p8代細(xì)胞培養(yǎng)：將步驟s1中得到的p5代神經(jīng)干細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增傳代至p8代。所述培養(yǎng)擴(kuò)增傳代的方法為將細(xì)胞培養(yǎng)瓶采用層粘連蛋白laminin在37℃包被2小時(shí)，然后采用不含ca、mg的dpbs洗滌一遍備用；將p5代神經(jīng)干細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，采用無(wú)血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，并調(diào)整密度為1x105個(gè)/ml，接種于包被好的培養(yǎng)瓶中，置于35℃5％co2環(huán)境進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)每間隔48小時(shí)進(jìn)行換液，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)7天左右即可傳代，直至p8代，期間p6-p8細(xì)胞放入主細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行存儲(chǔ)。s3：工作細(xì)胞庫(kù)：取步驟s2中p8代細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞特性和異源物質(zhì)檢測(cè)，檢測(cè)合格后，即為工作細(xì)胞，將其進(jìn)行消化凍存，并轉(zhuǎn)移至工作細(xì)胞庫(kù)待用。優(yōu)選的，步驟s2中所述無(wú)血清培養(yǎng)基是由dmem/f12，b27，n2，以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子bfgf,egf,lif組成，無(wú)任何動(dòng)物源血清成分。s4：用于帕金森病的治療制劑的配制：將步驟s3的工作細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)將細(xì)胞進(jìn)行消化并計(jì)數(shù)；然后在0-4度條件下將工作細(xì)胞溶液與塑形劑按體積比1：1進(jìn)行混合；所述工作細(xì)胞溶液的濃度為100微升2.5x106個(gè)工作細(xì)胞；所述塑性劑為matrigel與0.4％羧甲基纖維素鈉溶液按體積比1:1進(jìn)行混合。如果工作細(xì)胞是從工作細(xì)胞庫(kù)中的取出的凍存工作細(xì)胞先應(yīng)進(jìn)行復(fù)蘇后，再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)將細(xì)胞進(jìn)行消化并計(jì)數(shù)；然后在0-4度條件下將100微升2.5x106個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞與100微升塑形劑輕輕混勻，并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的容器中，于4℃恒溫環(huán)境保存。上述的經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細(xì)胞制劑的使用方法，將所述的經(jīng)鼻腔給藥用于帕金森病治療的神經(jīng)干細(xì)胞制劑取出，滴至鼻腔粘膜或注射至皮下。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1.本專(zhuān)利提供了一種無(wú)創(chuàng)的經(jīng)鼻腔粘膜吸附給藥的治療帕金森的神經(jīng)干細(xì)胞制劑，該制劑滴加或注射入鼻腔后在體溫條件下能迅速形成固態(tài)膜狀，吸附于鼻腔待細(xì)胞進(jìn)行緩慢吸收，并且不會(huì)隨呼吸進(jìn)入口腔或肺部，便捷了病人和醫(yī)生的使用，且試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其的療效和安全性比從創(chuàng)傷性的紋狀體給藥更好。2.本專(zhuān)利中神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法采用p0-p5為懸浮培養(yǎng)、p6-p9為貼壁培養(yǎng)的方式，前期懸浮培養(yǎng)有利于獲得純化的神經(jīng)干細(xì)胞克隆，能夠保證獲得的神經(jīng)干細(xì)胞的純度，而貼壁培養(yǎng)能夠使神經(jīng)干細(xì)胞更快的增殖傳代，有利于細(xì)胞的中試擴(kuò)大培養(yǎng)，并且能縮短接近一半的培養(yǎng)時(shí)間。3.本專(zhuān)利提供了一種性能穩(wěn)定、哺乳動(dòng)物來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞制劑，該制劑可在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分化成多巴胺受體的神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細(xì)胞和星狀膠質(zhì)細(xì)胞，可修復(fù)大腦的神經(jīng)和組織。4.該制劑可用于治療帕金森疾病，且不需要使用免疫抑制劑。附圖說(shuō)明圖1為神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)，左圖為懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球；右圖為貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖倍數(shù)可達(dá)10倍/代次。圖2為神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞特性和分化能力的鑒定；a-e為神經(jīng)干細(xì)胞特性鑒定，f-m為神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的鑒定。圖3為流式鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的純度(＞95％)。圖4為神經(jīng)干細(xì)胞給藥后各組動(dòng)物黑質(zhì)區(qū)域免疫組化染色結(jié)果。圖5為神經(jīng)干細(xì)胞給藥后神經(jīng)遞質(zhì)dopac相對(duì)含量變化。圖6為神經(jīng)干細(xì)胞給藥后神經(jīng)遞質(zhì)hva相對(duì)含量變化。圖7為各標(biāo)準(zhǔn)品的hplc檢測(cè)圖譜。圖8為神經(jīng)干細(xì)胞給藥后各組組織樣品的hplc檢測(cè)圖譜。圖9為神經(jīng)干細(xì)胞給藥后不同組大鼠跨步試驗(yàn)結(jié)果比較。圖10為神經(jīng)干細(xì)胞給藥后第10周不同組大鼠跨步試驗(yàn)結(jié)果比較。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1：神經(jīng)干細(xì)胞種子庫(kù)細(xì)胞的獲得1、從胚胎干細(xì)胞(escs)誘導(dǎo)獲得原代神經(jīng)干細(xì)胞使用細(xì)胞刮挑取escs細(xì)胞克隆，輕柔吹散，然后使用神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)液重懸，轉(zhuǎn)移至超低吸附培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)3天左右，收集形成的細(xì)胞球，輕柔吹散，再用神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)液進(jìn)行重懸，超低吸附培養(yǎng)皿中再次懸浮培養(yǎng)3天，收集形成的細(xì)胞球；將提前一天使用laminin包被的培養(yǎng)皿用不含ca、mg的dpbs洗滌2次，將收集的細(xì)胞球用神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，接種于包被好的培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每2-3天進(jìn)行換液，直至形成明顯的神經(jīng)樣集落，然后使用細(xì)胞刮收集形成的集落，并使用accutase將其消化成為單個(gè)細(xì)胞，用神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，懸浮培養(yǎng)，使其形成神經(jīng)干細(xì)胞球，獲得的神經(jīng)干細(xì)胞球可以消化進(jìn)行傳代，也可以進(jìn)行液氮凍存。2、從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipscs)誘導(dǎo)獲得原代神經(jīng)干細(xì)胞挑取ipscs細(xì)胞克隆，將細(xì)胞輕柔吹散并使用不含bfgf和egf的完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，轉(zhuǎn)移至超低吸附培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)7天左右，每2-3天進(jìn)行半量換液，然后離心收集形成的細(xì)胞球。將提前一天使用laminin包被的培養(yǎng)皿用不含ca、mg的dpbs洗滌2次，將收集的細(xì)胞球用含有并接種于包被好的培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每2-3天進(jìn)行換液，直至形成明顯的神經(jīng)樣集落，然后使用細(xì)胞刮收集形成的集落，并使用accutase將其消化成為單個(gè)細(xì)胞，用神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，懸浮培養(yǎng)，使其形成神經(jīng)干細(xì)胞球，獲得的神經(jīng)干細(xì)胞球可以消化進(jìn)行傳代，也可以進(jìn)行液氮凍存。3、通過(guò)胚胎組織獲取原代細(xì)胞(1)胚胎組織獲取取e14的大鼠1只，以40mg/kg的劑量腹腔注射2％戊巴比妥鈉麻醉；75％酒精浸泡消毒大鼠腹部5min，將大鼠仰臥位放置，牽拉固定四肢，剪開(kāi)后腹正中接近恥骨聯(lián)合的皮膚游離含有胚胎的完整子宮，移入含神經(jīng)干細(xì)胞保存液的大培養(yǎng)皿內(nèi)；分離冠臀長(zhǎng)1l～12mm左右的胎鼠。(2)、原代細(xì)胞獲取和接種使用精細(xì)手術(shù)鑷分離中腦腹側(cè)組織，取出放入裝有6ml神經(jīng)干細(xì)胞保存液的60mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用鑷子將組織塊分成約1mm3的小塊，然后轉(zhuǎn)移至含有10ml神經(jīng)干細(xì)胞保存液的50ml離心管中。然后進(jìn)行細(xì)胞消化與計(jì)數(shù)，采用無(wú)血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，加入超低吸附t75培養(yǎng)瓶中，置于35℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4、p1-p5代細(xì)胞的擴(kuò)增傳代神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)至10-12天，觀察細(xì)胞狀態(tài)，用移液器將低吸附t75培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)球和培養(yǎng)液吸入50ml離心管中，100g離心3分鐘，使神經(jīng)球充分沉淀到管底，吸棄上清，將配好的5ml消化液加入到離心管中，放入培養(yǎng)箱中消化15分鐘；4℃，300g，離心5分鐘，吸棄上清，加入神經(jīng)干細(xì)胞保存液10ml進(jìn)行洗滌；4℃，300g，離心5分鐘，吸棄上清，加入1-5ml神經(jīng)干細(xì)胞保存液，輕柔吹打使細(xì)胞分散重懸。然后按照《細(xì)胞密度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作程序》對(duì)單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)得到的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算需加入的無(wú)血清完全培養(yǎng)基的體積。將重懸的細(xì)胞迅速加入低吸附t75培養(yǎng)瓶中，并輕輕從不同方向晃動(dòng)，使細(xì)胞在培養(yǎng)液中均勻分布，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為35℃，二氧化碳濃度為5％。連續(xù)傳代培養(yǎng)直至p5代，消化后細(xì)胞凍存至種子細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行保存。實(shí)施例2：神經(jīng)干細(xì)胞主細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞的獲得1、培養(yǎng)瓶包被：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入適量的層粘連蛋白laminin溶液，放入37℃培養(yǎng)箱中包被2小時(shí)，然后采用不含ca、mg的dpbs洗滌一遍備用；2、將擴(kuò)增純化的p5代神經(jīng)干細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，采用無(wú)血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，并調(diào)整密度為1x105個(gè)/ml，接種于包被好的培養(yǎng)瓶中，置于35℃5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)每間隔48小時(shí)進(jìn)行換液，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)7天左右即可消化傳代，直至p8代，期間所得的細(xì)胞放入主細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行存儲(chǔ)。實(shí)施例3：神經(jīng)干細(xì)胞工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞的獲得將p8代細(xì)胞采用無(wú)血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，并調(diào)整密度為1x105個(gè)/ml，接種于包被好的培養(yǎng)瓶中，置于35℃5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中取樣進(jìn)行細(xì)胞特性和異源物質(zhì)檢測(cè)，檢測(cè)合格后，將細(xì)胞進(jìn)行凍存，并轉(zhuǎn)移至工作細(xì)胞庫(kù)待用。實(shí)施例4：神經(jīng)干細(xì)胞制劑的制備將工作細(xì)胞庫(kù)中的神經(jīng)干細(xì)胞復(fù)蘇進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，參照實(shí)施例1消化細(xì)胞，4℃，300g，離心5分鐘，吸棄上清，加入生理鹽水離心洗滌，吸棄上清，1-5ml生理鹽水重懸計(jì)數(shù)，4℃，300g，離心5分鐘，吸棄上清，加入100微升的生理鹽水將細(xì)胞重懸，在冰上將制備好的細(xì)胞懸液與塑形劑進(jìn)行1:1混勻，然后分裝至4度保存的預(yù)灌封的注射器中，置于4℃恒溫箱中保存?zhèn)溆?，使用時(shí)直接注射至給藥部位。實(shí)施例5：神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定如圖1所示實(shí)施例2、3里的神經(jīng)干細(xì)胞增殖倍數(shù)可達(dá)10倍/代次。如圖2所示采用免疫熒光的方法鑒定檢測(cè)合格后的p8代細(xì)胞，能夠鑒定細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志，其純度可達(dá)95％以上；同時(shí)也能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、多巴胺神經(jīng)元等。如圖3所示通過(guò)流式鑒定鑒定檢測(cè)合格后的p8代細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞的純度可達(dá)95％以上。實(shí)施例6：神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于帕金森動(dòng)物模型的藥效學(xué)研究一、帕金森動(dòng)物模型神經(jīng)干細(xì)胞給藥與評(píng)價(jià)1.實(shí)驗(yàn)分組及免疫組化分析采用單側(cè)mfb內(nèi)微量注射6-ohda誘導(dǎo)pd模型。大鼠麻醉后放置成仰臥位，用前端套有硅膠軟管的微量注射器吸取神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞懸液10ul，將軟管慢慢伸入大鼠左側(cè)鼻腔中，緩慢將細(xì)胞注射入鼻腔，放置15min待神經(jīng)干細(xì)胞液完全形成固態(tài)凝膠時(shí)，將大鼠放回籠中。實(shí)驗(yàn)分組如下：序號(hào)組別數(shù)量注射體積(ul)注射次數(shù)給藥途徑1a910ul4次，每周1次鼻腔2b910ul4次，每周1次鼻腔3c910ul4次，每周1次鼻腔4d1010ul4次，每周1次鼻腔5e810ul4次，每周1次鼻腔6sham組(生理鹽水)1010ul4次，每周1次鼻腔7g86mg/kg每天注射腹腔注射黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(th)免疫組化評(píng)價(jià)干細(xì)胞給藥90天后，分別隨機(jī)取每組大鼠各3只，10％水合氯醛麻醉后，心臟灌注固定。先用生理鹽水300ml進(jìn)行預(yù)灌注，將其體內(nèi)血液沖出，再用中性甲醛固定液400ml進(jìn)行灌注固定，完整剝?nèi)∧X組織，繼續(xù)4℃過(guò)夜固定。后進(jìn)入30％蔗糖溶液4℃脫水至下沉，作連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚為30μm，進(jìn)行th染色，見(jiàn)圖4所示。2.高效液相檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)2.1樣品處理方法干細(xì)胞給藥90天后，分別隨機(jī)取每組大鼠各3～6只，即刻處死，解剖取出紋狀體，稱重并記錄。先于液氮中速凍5min后置-80℃保存?zhèn)溆?。hplc檢測(cè)當(dāng)天，樣品按照100mg加入300μl樣品處理液(0.2m高氯酸，0.2mm焦亞硫酸鈉，0.01％edta-2na)，同時(shí)含有2.5μmdhba作為內(nèi)標(biāo)，超聲粉碎(強(qiáng)度60％，時(shí)間2min)，14,000rpm離心10min，上清液經(jīng)0.22μm水相濾膜過(guò)濾后用于hplc檢測(cè)，以上過(guò)程均在4℃下操作。神經(jīng)遞質(zhì)dopac相對(duì)含量變化見(jiàn)圖5所示；神經(jīng)遞質(zhì)hva相對(duì)含量變化見(jiàn)圖6所示。2.2色譜條件色譜柱：dikmaplatisilods(5μm，250mm*4.6mm)流動(dòng)相：16％甲醇水溶液，含40mm乙酸鈉，15mm檸檬酸，0.25mm辛烷磺酸鈉，0.2mmedta-2na，未加甲醇前調(diào)解ph至4.3檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器(ecd)流速：1ml/min電壓：500mv量程：1μa柱溫：25℃進(jìn)樣體積：50μl各標(biāo)準(zhǔn)品的hplc檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖7所示色譜峰結(jié)果為：組織樣品的hplc檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖8所示色譜峰結(jié)果為：3.大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)采用跨步試驗(yàn)，對(duì)大鼠治療前后分別進(jìn)行前肢功能測(cè)定。實(shí)驗(yàn)者一手固定大鼠軀體后半部和后肢，使其離地，另一手固定一側(cè)前肢使另一側(cè)前肢著地，以大鼠正手方向斜向一側(cè)勻速移動(dòng)大鼠(5s內(nèi)移動(dòng)90cm)，記錄移動(dòng)時(shí)著地側(cè)前肢步數(shù)。交替測(cè)量?jī)蓚?cè)上肢的跨步數(shù)。每只大鼠一側(cè)前肢重復(fù)5次，計(jì)算其均數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1.黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(th)免疫組化評(píng)價(jià)對(duì)各組大鼠黑質(zhì)區(qū)域的免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果如圖4所示。第3組黑質(zhì)區(qū)域th陽(yáng)性神經(jīng)元染色明顯變淺，說(shuō)明6-ohda造模后，會(huì)誘導(dǎo)黑質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元的大量凋亡。第7組黑質(zhì)th免疫組化染色稍有加深，說(shuō)明給予美多巴后能一定程度改善由6-ohda誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。第1,2，4，5組黑質(zhì)神經(jīng)元染色較為明顯，比第3組顯著增多，說(shuō)明鼻腔給予不同劑量的神經(jīng)干細(xì)胞后能有效的提高黑質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元的密度。2.高效液相檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)2.1各標(biāo)準(zhǔn)品峰的歸屬配制一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)樣，各標(biāo)準(zhǔn)品的定位圖譜如圖7所示。內(nèi)標(biāo)dhba最先出峰，出峰時(shí)間在6.5min左右，神經(jīng)遞質(zhì)dopac的出峰時(shí)間約為9min，神經(jīng)遞質(zhì)hva的出峰時(shí)間在20min左右，峰形均良好，空白對(duì)照無(wú)干擾。2.1紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果dopac和hva是多巴胺的主要代謝產(chǎn)物，可以反應(yīng)腦內(nèi)多巴胺含量變化的指標(biāo)。如圖5所示，樣品圖譜中其他成分對(duì)測(cè)定成分無(wú)干擾。dopac和hva的含量相對(duì)于植物油處理組的百分比如圖5和圖6所示。兩種遞質(zhì)的變化趨勢(shì)相似。不同劑量的神經(jīng)干細(xì)胞給藥后，遞質(zhì)水平有不同程度的提高。說(shuō)明干細(xì)胞的治療能提高6-ohda誘導(dǎo)的帕金森模型大鼠腦內(nèi)的遞質(zhì)水平。3.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析神經(jīng)干細(xì)胞給藥后不同組大鼠跨步試驗(yàn)結(jié)果比較見(jiàn)圖9所示。給予6-ohda進(jìn)行造模后，模型動(dòng)物跨步數(shù)顯著減少；第1-4周給予不同劑量的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，從得到的跨步試驗(yàn)結(jié)果看，給藥后第10周，給藥d組和g組與模型對(duì)照組比較有顯著改善。神經(jīng)干細(xì)胞給藥后第10周不同組大鼠跨步試驗(yàn)結(jié)果比較見(jiàn)圖10所示。4.綜合討論結(jié)合行為學(xué)、th神經(jīng)元染色及神經(jīng)遞質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果綜合分析，中低劑量的干細(xì)胞鼻腔給藥后對(duì)于6-ohda誘導(dǎo)的帕金森模型鼠的運(yùn)動(dòng)能力有一定改善作用，減少黑質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元凋亡的產(chǎn)生，并能提高模型大鼠腦內(nèi)的遞質(zhì)水平。當(dāng)前第1頁(yè)12