本發(fā)明涉及于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種RGD及PEG共修飾的PAMAM樹(shù)狀大分子載三氧化二砷遞藥系統(tǒng)的制備方法。

背景技術(shù)：

三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中藥砒霜的有效活性成分，臨床上主要用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ATO對(duì)多種實(shí)體瘤細(xì)胞也具有抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡作用，具有廣譜抗癌性。但由于ATO在體內(nèi)分布缺乏特異性，達(dá)到有效濃度時(shí)對(duì)其他正常組織往往會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)；此外，ATO半衰期短，給藥后消除迅速，因此限制了其在實(shí)體瘤中的應(yīng)用。

聚酰胺-胺樹(shù)枝狀大分子(PAMAM)是一類(lèi)目前得到廣泛應(yīng)用的樹(shù)枝狀聚合物材料，在其作為靶向遞藥系統(tǒng)載體時(shí)體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性。首先，其結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水空腔，可以物理包埋疏水性藥物；其次，PAMAM表面有許多活性較強(qiáng)的氨基，一方面可以連接抗腫瘤藥物，另一方面還可以連接能與機(jī)體中某些器官、組織發(fā)生特異性識(shí)別的靶向配基等。研究表明，低代數(shù)的PAMAM往往呈現(xiàn)相對(duì)開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，內(nèi)腔較小，表面官能團(tuán)有限，不利于載藥和修飾；高代數(shù)的PAMAM開(kāi)始呈現(xiàn)三維的球形結(jié)構(gòu)，并且具有足夠的官能團(tuán)而被更多應(yīng)用。但由于高代數(shù)PAMAM會(huì)引起一定的細(xì)胞毒性和溶血毒性，所以通常在PAMAM表面對(duì)其進(jìn)行PEG化的修飾，一方面可以減少其毒副作用，另一方面可進(jìn)一步提高該載藥系統(tǒng)的親水性，延長(zhǎng)藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，更有助于藥物被動(dòng)靶向于腫瘤組織,從而提高藥物治療效。

為進(jìn)一步提高抗腫瘤藥物的療效，近年來(lái)將配體連接到載藥微粒表面，通過(guò)配體-受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向藥物傳遞系統(tǒng)已經(jīng)成為癌癥治療研究的熱點(diǎn)。整合素是一種由α和β兩個(gè)亞基以非共價(jià)鍵形式結(jié)合，能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外雙向信息傳遞的異二聚體跨膜糖蛋白。其中整合素v3在多種惡性腫瘤細(xì)胞(骨肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及浸潤(rùn)性黑色素瘤)表面有高水平的表達(dá)，而且在惡性腫瘤組織的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜高表達(dá)，而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)的正常器官系統(tǒng)則無(wú)表達(dá)或幾乎不能被探及。整合素v3的天然配體包括纖維連接蛋白，玻璃連接蛋白，層粘蛋白等，這些配體的共同特征是在其結(jié)構(gòu)中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，而且通過(guò)RGD序列與整合素v3結(jié)合。研究表明，外源性RGD多肽競(jìng)爭(zhēng)性與腫瘤細(xì)胞表面整和素特異性結(jié)合后，不僅表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用，且具有靶向性標(biāo)記腫瘤和輸送抗腫瘤藥物的潛在價(jià)值。線性的RGD多肽體內(nèi)易被酶解，半衰期短，從而限制了其應(yīng)用，而環(huán)肽具有更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和受體親和力，從而表現(xiàn)出更高的臨床應(yīng)用潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決ATO脂溶性差，透血腦屏障難，體內(nèi)分布缺乏特異性，達(dá)到有效濃度時(shí)對(duì)其他正常組織毒性大,治療窗窄，腦內(nèi)血藥濃度“峰谷”波動(dòng)亦會(huì)引起顱內(nèi)中樞組織的嚴(yán)重不良反應(yīng)等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種RGD及PEG共修飾的PAMAM樹(shù)狀大分子載三氧化二砷遞藥系統(tǒng)的制備方法，通過(guò)RGD結(jié)合PEG共同修飾PAMAM，用來(lái)負(fù)載ATO，在進(jìn)一步減少PAMAM本身毒性的同時(shí)，賦予其腦膠質(zhì)瘤靶向的能力，并且具有一定緩釋作用，改善ATO藥動(dòng)學(xué)特征，增加生物利用度，提高用藥安全性。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種RGD及PEG共修飾的PAMAM樹(shù)狀大分子載三氧化二砷遞藥系統(tǒng)的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)制作RGD-PEG-PAMAM：

以RGD環(huán)肽的巰基與雙功能聚乙二醇MAL-PEG-NHS的馬來(lái)酰亞胺基反應(yīng)，生成RGD多肽修飾的聚乙二醇羥基琥珀酰亞胺活化酯RGD-PEG-NHS，然后與PAMAM的表面氨基反應(yīng)，生成RGD-PEG修飾的PAMAM，記為RGD-PEG-PAMAM；

(2)制作RGD-PEG-PAMAM-mPEG：

將RGD-PEG-PAMAM與mPEG-NHS反應(yīng)，使RGD-PEG-PAMAM在步驟(1)未反應(yīng)完的多余氨基進(jìn)一步被PEG修飾，制得RGD-PEG-PAMAM-mPEG；

(3)三氧化二砷溶液與RGD-PEG-PAMAM-mPEG反應(yīng)，制得負(fù)載有三氧化二砷的RGD-PEG-PAMAM-mPEG，即RGD及PEG共修飾的PAMAM樹(shù)狀大分子載三氧化二砷遞藥系統(tǒng)。

所述RGD為RGDyC，RGDyK，RGDfC，RGDfK等含有RGD序列的環(huán)狀多肽，其結(jié)構(gòu)中含有游離巰基；優(yōu)選RGDyC。

所述雙功能聚乙二醇MAL-PEG-NHS為分子量為1000-10000Da的雙功能聚乙二醇，其一端含有馬來(lái)酰亞胺基，另一端含有羥基琥珀酰亞胺活化酯；優(yōu)選使用MAL-PEG₃₅₀₀-NHS。

所述PAMAM為整數(shù)代的聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物。優(yōu)選PAMAM G5。

所述mPEG-NHS為分子量為1000-10000Da單官能團(tuán)的甲氧基聚乙二醇，一端為羥基琥珀酰亞胺活化酯。優(yōu)選mPEG₃₀₀₀-NHS

進(jìn)一步，所述步驟(1)優(yōu)選按以下步驟進(jìn)行：

將RGD溶于pH6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，作為溶液A，將PAMAM溶于pH9.2的硼砂-氫氧化鈉緩沖液中，作為溶液B，向溶液A中加入MAL-PEG-NHS，渦旋30s后，全部反應(yīng)液加入溶液B中，室溫下反應(yīng)8～20小時(shí)；調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為7.0，加入β-巰基乙醇終止未反應(yīng)完全的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，超濾、離心、冷凍干燥，制得RGD-PEG-PAMAM。

所述PAMAM、RGD、MAL-PEG-NHS的物質(zhì)的量之比為1:20～50:20～50，優(yōu)選1:45:45

所述溶液A的質(zhì)量濃度優(yōu)選2～5mg/mL；

所述溶液B的濃度優(yōu)選2～5mg/mL

所述步驟(2)優(yōu)選按以下步驟進(jìn)行：

將RGD-PEG-PAMAM復(fù)溶于pH值8.0的磷酸鹽緩沖液中，得到溶液C，向溶液C加入mPEG-NHS，使PAMAM與mPEG-NHS的物質(zhì)的量之比為1:60～70，優(yōu)選1：64，室溫反應(yīng)40～60h(優(yōu)選48h)，超濾、離心，除去未反應(yīng)的PEG，冷凍干燥，制得RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG。

所述步驟(2)在超濾、離心時(shí)，需要多次操作直到到離心后上層液中檢測(cè)無(wú)PEG為止，一般可采用薄層色譜法監(jiān)測(cè)至上層液中無(wú)PEG。

所述溶液C的濃度優(yōu)選為1～10mg/mL。

所述步驟(2)中，RGD-PEG-PAMAM的用量是指其中含有的PAMAM與mPEG-NHS的物質(zhì)的量之比為1:60～70，可按照步驟(1)中制備RGD-PEG-PAMAM時(shí)所投料的PAMAM的物質(zhì)的量來(lái)計(jì)量。

所述步驟(3)優(yōu)選按以下步驟進(jìn)行：

稱(chēng)取RGD-PEG-PAMAM-mPEG溶于超純水中，得到溶液D，向溶液D中加入三氧化二砷溶液，室溫?cái)嚢?2～30小時(shí)，所得反應(yīng)液超濾除去未負(fù)載的游離的三氧化二砷，冷凍干燥，制得RGD及PEG共修飾的PAMAM樹(shù)狀大分子載三氧化二砷。所得制劑一般在-80℃保存

所述RGD-PEG-PAMAM-mPEG、三氧化二砷的質(zhì)量用量比10：1～3，優(yōu)選10:2。

所述溶液D的濃度優(yōu)選為5～15mg/mL

所述三氧化二砷溶液的濃度優(yōu)選為0.5～2mg/mL。

所述三氧化二砷溶液優(yōu)選如下制得：向三氧化二砷逐滴加入濃鹽酸，至完全溶解，再加入氫氧化鈉濃溶液調(diào)節(jié)pH中性，制得三氧化二砷溶液。

本發(fā)明還提供所述的方法制得的RGD及PEG共修飾的PAMAM樹(shù)狀大分子載三氧化二砷遞藥系統(tǒng)，載藥量可達(dá)1.5～3.0％，可以呈現(xiàn)一定緩釋作用和腫瘤靶向作用。

本發(fā)明的有益效果在于：通過(guò)雙官能團(tuán)的PEG(MAL-PEG-NHS)作為偶聯(lián)臂，將RGD與PAMAM鍵合。并且在此基礎(chǔ)上，用單官能團(tuán)的mPEG-NHS進(jìn)一步與PAMAM上多余的氨基反應(yīng)，繼續(xù)屏蔽部分氨基以增加PAMAM的體外安全性。

本發(fā)明將ATO結(jié)合PAMAM本身的優(yōu)勢(shì)，如水溶性好，無(wú)免疫原性，緩釋?zhuān)哂幸欢ㄋ崦籼匦浴Ｍㄟ^(guò)RGD結(jié)合PEG共同修飾PAMAM，可以在降低高代數(shù)PAMAM毒性的同時(shí)，達(dá)到腫瘤靶向的作用，并首次將劇毒中藥三氧化二砷負(fù)載于PAMAM中，載藥量可達(dá)1.5～3.0％，可以呈現(xiàn)一定緩釋作用，即可以一定程度避免其在到達(dá)病灶部位之前而被降解或產(chǎn)生毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)。且PAMAM作為載體材料本身具有一定酸敏特性，其在酸性環(huán)境下表面氨基質(zhì)子化相互排斥而有利于釋藥。因此構(gòu)建RGD-PEG-PAMAM@ATO腦膠質(zhì)瘤靶向遞藥系統(tǒng)，以解決ATO脂溶性差，透血腦屏障難，體內(nèi)分布缺乏特異性等問(wèn)題，并改善其藥動(dòng)學(xué)特征，增加生物利用度，為腦膠質(zhì)瘤治療的基礎(chǔ)研究提供一種新的思路。

附圖說(shuō)明

圖1 RGDyC，PAMAM，RGDyC-PEG-PAMAM和RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的¹H-NMR圖譜，其中(A)圖為RGDyC，(B)圖為PAMAM，(C)圖為RGDyC-PEG-PAMAM，(D)圖為RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG。

圖2 RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的粒徑分布圖和Zeta電位圖，其中(A)圖為粒徑分布圖，(B)圖為Zeta電位圖。

圖3不同載體材料的溶血毒性對(duì)比圖，n＝3。

圖4不同載體材料對(duì)HBMEC細(xì)胞的毒性柱狀對(duì)比圖，n＝6。

圖5 RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG負(fù)載ATO制劑和原藥ATO的體外釋藥曲線圖，n＝3。

具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1

(1)砷溶液的制備：

稱(chēng)取一定量的三氧化二砷，向其中逐滴加入濃鹽酸，至完全溶解，再通過(guò)氫氧化鈉濃溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，使成為濃度約為1mg/mL的砷鹽母液。

(2)RGDyC-PEG-PAMAM的制備：

稱(chēng)取4.68mg RGDyC，溶于2mL醋酸-醋酸鈉緩沖液中(pH 6.0)，向其中加入27.32mg MAL-PEG₃₅₀₀-NHS，渦旋30s，迅速加入至2mL含有5.0mg PAMAM G5的硼砂-氫氧化鈉緩沖液中(pH 9.2)，室溫反應(yīng)過(guò)夜。通過(guò)緩沖液調(diào)節(jié)體系pH至7.0，加入5μLβ-巰基乙醇反應(yīng)1h以終止未反應(yīng)完全的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。用截流分子量為10000的密理博超濾離心管進(jìn)行超純水超濾離心，冷凍干燥，得RGDyC-PEG-PAMAM15.53mg。

(3)RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的合成方法為：在上述基礎(chǔ)上，將上述離心濃縮后的產(chǎn)物15.53mg復(fù)溶于2mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)，向其加入33.30mgmPEG3000-NHS，使PAMAM G5與mPEG3000-NHS最終的反應(yīng)摩爾比為1:64。室溫反應(yīng)48h，用截流分子量為30000的密理博超濾離心管進(jìn)行超濾離心，除去未反應(yīng)的PEG。超濾8-9次，采用薄層色譜法監(jiān)測(cè)至離心后的上層液中無(wú)PEG，冷凍干燥。通過(guò)核磁圖譜確定RGD和PEG的接枝率。核磁結(jié)果表明平均每個(gè)PAMAM樹(shù)狀大分子上，共鍵合上約30個(gè)PEG，并且成功鍵合上RGDyC。RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的粒徑大部分集中在20多納米左右。所得制劑粒徑相對(duì)較小。Zeta電位為5.36±0.22mV。

(4)RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的體外毒性評(píng)價(jià)：

4.1溶血毒性實(shí)驗(yàn)

取新鮮抗凝家兔全血5mL，輕微攪拌去除纖維蛋白凝塊。加生理鹽水充分混勻后，1500rpm·min^-1，離心5min，棄上清。重復(fù)洗滌5～6次，至上清液基本無(wú)色。沉淀的紅細(xì)胞用生理鹽水配成2％(v/v)的紅細(xì)胞懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取未經(jīng)修飾的PAMAM，PEG-PAMAM，RGDyC-PEG-PAMAM和RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG，用1mL生理鹽水配置成一系列不同質(zhì)量濃度的溶液(以PAMAM濃度計(jì)，0.001mg·mL^-1～2mg·mL^-1)置于離心管中，加入等體積的2％(v/v)的紅細(xì)胞懸液。另取1mL 2％(v/v)的紅細(xì)胞懸液，分別加入等體積的蒸餾水和生理鹽水，作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。各管充分混勻，置于37℃恒溫水浴中孵育1h，1500rpm·min^-1，離心10min，取上清液，酶標(biāo)儀于414nm下測(cè)吸光度值(Abs)。按下式計(jì)算溶血率:

其中Abs、Abs₀和Abs₁₀₀分別表示樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值。

載體的溶血毒性結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，PEG的修飾可以顯著降低PAMAM的溶血毒性，且在高濃度時(shí)減毒作用尤為顯著，而RGD的進(jìn)一步修飾對(duì)毒性沒(méi)有顯著性影響。未經(jīng)修飾的PAMAM，在濃度為2mg·mL^-1時(shí)，孵育1h后，溶血率達(dá)到了99.0％，而經(jīng)過(guò)PEG的修飾，PAMAM的溶血毒性明顯降低，當(dāng)PEG的修飾率為24.2％時(shí)，在濃度為2mg·mL-¹時(shí)，溶血率僅為3.5％，比未經(jīng)修飾的PAMAM毒性降低了95.5％。在此濃度下，RGDyC-PEG-PAMAM和RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的溶血率分別為：10.6％和2.8％，且PAMAM，RGDyC-PEG-PAMAM和RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG三者之間的溶血毒性存在顯著性差異。

4.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法考察所得載體材料對(duì)HBMEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性。HBMEC細(xì)胞以5×10³個(gè)/孔接種于96孔板，37℃培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的載體材料(0.001μmol·L^-1～100μmol·L-¹)，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL MTT無(wú)血清培養(yǎng)液(0.5mg·mL^-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，微量振蕩器上振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定其570nm處的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率(Cell Viability)：

其中A_樣品為不同濃度樣品組的吸光度，A_對(duì)照為空白細(xì)胞組的吸光度。

結(jié)果由圖4所示，所有組別在低濃度時(shí)(<0.1μmol·L^-1)，均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，而當(dāng)濃度高于1μmol·L^-1時(shí)，PEG-PAMAM和RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的細(xì)胞存活率明顯高于PAMAM和RGDyC-PEG-PAMAM組，表明PEG的進(jìn)一步修飾確實(shí)可以降低PAMAM的毒性。當(dāng)濃度為100μmol·L^-1時(shí)，PAMAM組對(duì)應(yīng)的HBMEC細(xì)胞的細(xì)胞存活率為45.6％，RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG對(duì)應(yīng)HBMEC細(xì)胞的細(xì)胞存活率分別為87.7％，表現(xiàn)出較好的體外安全性。

(5)RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG載三氧化二砷的制備：

稱(chēng)取RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG 10mg溶于1mL超純水于西林瓶中，加入攪拌子，再加入2mL砷鹽母液，室溫?cái)嚢?4小時(shí)。置于截流分子量為3000的密理博超濾離心管中，超濾除去游離砷鹽，并且每次超濾完后收集下濾液，并補(bǔ)充超純水至刻度。建立砷標(biāo)曲，通過(guò)等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)下濾液中砷鹽濃度，計(jì)算載藥量。冷凍干燥，-80攝氏度保存制劑。

通過(guò)等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)得，超濾離心三次后，幾乎所有未被包載的游離砷鹽已被除干凈。載藥量約在1.5～3.0％之間。

(6)體外釋放實(shí)驗(yàn)：

采用透析法考察ATO和RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG/ATO納米復(fù)合物的體外釋藥特性。原藥ATO和ATO納米復(fù)合物(以0.5mg ATO計(jì))分別溶于1mL pH7.4和pH5.5的PBS釋放介質(zhì)中，放入經(jīng)預(yù)處理的透析袋中，扎緊袋口，置于100mL PBS釋放介質(zhì)，37℃恒溫水浴振蕩(75rpm)。定時(shí)從釋放介質(zhì)中準(zhǔn)確取樣1mL，同時(shí)補(bǔ)加等量37℃空白釋放介質(zhì)。建立砷標(biāo)曲，樣品ATO通過(guò)等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度，計(jì)算累計(jì)釋放百分率(％)。所有試驗(yàn)重復(fù)三次。

所得RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG載三氧化二砷制劑的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示：原藥ATO釋放迅速，在pH 5.5及pH 7.4的環(huán)境下，2h的累積釋放率已達(dá)95％以上，而經(jīng)過(guò)RGDyC-PEG-PAMAM-mPEG的包載后，其釋放呈現(xiàn)出明顯的緩釋特性和一定的酸敏性。此特性對(duì)于后續(xù)的腫瘤的治療具有一定的優(yōu)勢(shì)。